Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

Published: October 19, 2016 doi: 10.3791/54550
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 1,2,3, 2
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

Protocol

מחקר זה עולה בקנה אחד עם האוניברסיטה הלאומית של סינגפור מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (פרוטוקול שאושר לא. R15-0225).

הכנה כירורגי 1. במודל חיה

  1. cannulations כלי
    1. הרדימי חולדות זכרים ספראג-Dawley (6 - 7 שבועות) במשקל (203 ± 20) g עם קטמין (37.5 מ"ג / מ"ל) ו xylazine (5 מ"ג / מ"ל) קוקטייל באמצעות הזרקה (IP) הזרקה (2 מ"ל / ק"ג) . אל לסכם את המחט או להסיר אותו מן המזרק לאחר ההזרקה.
    2. לאחר שבעל החיים הורדמו (אושר על ידי הבוהן הצובט), ומניח אותו על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה ב 37 מעלות צלזיוס. בעדינות לגלח את השיער על השכמות, צוואר רחם קדמי, בטן תחתונה, רגל אחורית המדיאלי צק אשכים. בעדינות לרסן את הרגליים באמצעות קלטות נייר דבק.
    3. בצע את כל הליכים כירורגיים באמצעות מספריים microdissection ו מלקחיים זווית תוך צפייה דרךסטראו. מניח את כל כלי כירורגיים חדו על מגש לנקב עמיד כדי למנוע פגיעה במהלך הניתוח.
    4. שפשפו את כל האתרים כירורגית 3 פעמים עם יוד לסירוגין ו -70% אלכוהול לפני ביצוע החתך. ריקון כל צנתרים עם 30 IU / ml פתרון הפרין-מלוחים.
    5. הפוך 1 - חתך בעור קו האמצע 1.5 ס"מ על השכמות בעזרת זוג מספריים כירורגיות על וריד הצוואר הימני. הפרד את fascia ידי דיסקציה קהה כדי לחשוף את וריד הצוואר ואת cannulate אותו עם צינור פוליאתילן (PE-50) מלא-מלוחים הפרין באמצעות 5-0 תפרים משי. להשרות הרדמה משלים בעת הצורך (1/3 עד 1/2 של המינון ההתחלתי, תוך ורידי (IV)) לאורך כל מהלך הניתוח ולהתנסות.
    6. בצע הנשמה כדי לשמור patency דרכי נשימה. הפוך 1 - חתך ס"מ 1.5 באזור צוואר הרחם הקדמי. Cannulate קנה הנשימה באמצעות צינור פוליאתילן (PE-205) עם 2-0 תפרי משי כדי לאבטח את הקטטר במקום.
    7. צג לחץ דםדרך cannulation על עורק הירך. הפוך 1 - חתך ס"מ 1.5 על פני השטח המדיאלי השמאלי של הרגל האחורית. הפרד את עורק הירך ידי דיסקציה קהה. Cannulate עורק הירך עם צינור פוליאתילן (PE-10) מלא-מלוחים הפרין באמצעות 5-0 תפרים משי.
  2. הכנת שרירי Cremaster ויזואליזציה הזרימה
    1. הכנס תפר משי 5-0 דרך הקודקוד של שק האשכים להאריכו. עושים חתך לאורך המשטח הגחון של שק האשכים. באופן קבוע ליישם פתרון איזוטוני חמים (37 מעלות צלזיוס; pH 7.4) לשריר החשוף.
    2. סור שמסביב רקמות חיבור בזהירות וביסודיות באמצעות מטוש הטה-כותנה.
    3. הכנס תפר משי 5-0 דרך הקודקוד של השריר Cremaster. חותך את התפר לשני חלקים שווים באורכם ו לקשור קשר בכל צד. חותכים את השריר בין שני קשרים ולמתוח אותו על גבי פלטפורמת אישית פרספקס שקוף ידי משיכת תפר בעדינות. לתקןסוף התפר אל הרציף עם נקודת סימון כחולה.
      הערה: הסרה יסודית של סובבי רקמות חיבור היא קריטית בהשגה בניגוד תמונה מיטבית.
    4. 1.2.3 חזור על השלב עד 5 עד 6 קיבעונות מבוצעים. מוציאים בזהירות את השריר Cremaster מן יותרת האשך באמצעות כויה בטמפרטורה גבוהה. Superfuse פתרון איזוטוני חם לשריר החשוף על מנת למנוע התייבשות של הרקמה.
      1. הקף את שריר Cremaster עם חתיכות מקופלות של גזה. מכסה את השריר החשוף עם סרט פוליוויניל. חתיכות הגזה עם הסרט יוצרות אגן רדוד להחזיק פתרון איזוטוני חם עבור מטרת מיקרוסקופ מי טבילה (איור 1 א).
    5. מעבירים את החיה על הבמה החיה של מיקרוסקופ intravital (איור 1 ג). חבר את cannulation העורקים למערכת להרכשת נתונים פיזיולוגית לניטור לחץ רצוף (1E איור).
    6. לשמור על השריר לטמפרטורותיור ב 35 ° C עם גוף חימום המצורף מתחת לבמת החי (איור 1 ב). מניח בדיקת טמפרטורה ליד השריר על מנת לספק משוב שלילי על בקר הכח של גוף החימום (1D איור).
    7. להשאיר את החיה על הבמה במשך 15 דקות כדי לאזן עם הסביבה.
    8. דמיין את זרימת דם תחת מיקרוסקופ intravital עם מטרת מי טבילת 40X ו מעבה עבודה מרובה.
    9. בחרו עורקיק unbranched (<60 מיקרומטר) מבוסס על התמקדות תמונה ברורה ניגוד בין ליבת RBC, קירות CFL וכלי, על מנת למקד את המיקרוסקופ במטוס הקוטבי של כלי הדם. סובב את המצלמה רכובה על גבי מיקרוסקופ כדי ליישר את קיר הכלי אנכי.
    10. רשום את זרימת הדם באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה בשיעור מסגרת של 3,000 / sec עבור 1 שניות. שמור הווידאו המוקלט בפורמט 8 סיביות בגווני אפור AVI לא דחוס כדי לשמר את איכות התמונה.
      הערה: מסגרת דולר הקלטת מינימום של 3,000 מסגרות / sec מומלץ לוודא כי מדידת CFL יכולה להתבצע לפחות פעם האחת RBC בתנאי זרימת arteriolar פיסיולוגיים.
    11. שימוש במסנן כחול עם שידור שיא באורך גל של 394 ננומטר bandpass ספקטרלי על 310 - 510 ננומטר כדי לשפר את הניגוד בין RBCs ופלזמה.
      הערה: ודא כי ספקטרום האור עובר דרך המסנן הכחול ממקור האור המיקרוסקופי (100 W מנורת הלוגן) הוא של עוצמת אור הנמוכה כדי למנוע ניזק לרקמות פוטנציאלי.
    12. בסוף הניסוי, להרדימו עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital.

ניתוח תמונה 2.

  1. עיבוד מקדים למדידת רוחב CFL
    1. פתח MATLAB ולהפעיל את הקובץ 'CFL_pre.m'. (זה וקבצים MATLAB אחרים ניתן למצוא ב-IP "> ארכיון MATLAB משלימה.)
    2. לחץ על 'פתח קובץ' כדי לבחור את קובץ הווידאו לנתח.
    3. הזז את מחוון 'סיבוב' כדי ליישר את דפנות כלי אנכית.
      הערה: משתמשים יכולים להציג את קווי רשת סיוע עבור יישור הכלי ידי בחירת לחצן האפשרויות 'ב- Grid', ולהתאים את רמת הזום של התמונה על ידי הזזת המחוון 'זום'.
    4. לחץ על הכפתור "אישור עריכה 'כדי לאשר את יישור הכלי.
    5. לחץ על הכפתור "גדר ROI כדי היבול 'כדי להגדיר את האזור (ROI) ריבית. התמונה המיושרת יוצגה בחלון מוקפץ. התאם את המטרה המלבנית על התמונה, ולחץ לחיצה כפולה על מנת לאשר את ההחזר על ההשקעה. דלג על שלב זה אם החיתוך של תמונה אינו נדרש.
      הערה: רק כוללת לכלי שייט יחיד ROI לנתח את רוחב CFL מהספינה. לחצו על כפתור "איפוס תמונה 'כדי לשחזר את התמונה לצורתו המקורית, במקרה הצורך.
    6. לחץ על9; חלץ 'כדי לחלץ את כל המסגרות ערכת וידאו לתוך תמונות מפת סיביות ברציפות (8 סיביות בגווני אפור' תמונות bmp 'פורמט). התמונות שחולצו ניתן למצוא בתיקייה עם שם זהה לזה של קובץ הווידאו שנבחרו.
  2. מדידת רוחב CFL
    1. פתח MATLAB ולהפעיל את הקובץ 'CFL_measure.m'.
    2. לחץ על 'בחר תיקייה' כדי לבחור את התיקייה המכילה את תמונות חילוץ.
    3. לחץ על התיקייה המכילה את התמונות ולחץ על 'בחר תיקייה'. מסגרת התמונה הראשונה בתיקייה תהיה טיעון המוצג בלוח התמונה הגוונים האפור ', יחד עם היסטוגרמה בעצמה אפורה בלוח' תמונת היסטוגרמה '.
    4. בחר את מסגרת תמונה הרצויה מתיבת הרשימה כדי לבצע את הניתוח, אחרת מסגרת התמונה הראשונה תיבחר.
    5. לחץ על 'מצא דפנות כלי' כדי לזהות את קיר הכלי הפנימי בתמונה, אשר נקבעה על המיקום שבומעברי שיא פרופיל עוצמת אור את צבעם מכהה לבהירים יותר משני פיקסלים.
    6. בדוק 'מסנן חציון' כדי להחיל מסנן חציון אל התמונה כדי להקטין את הרעש "מלח ופלפל".
    7. בדוק "ניגודיות אוטומטי" כדי להתאים את עוצמות תמונה דיגיטלית על מנת לשפר את הניגודיות בתמונה.
    8. בחר אלגוריתם thresholding בתיבת הרשימה הקובעת ערך thresholding אוטומטי (τ) המחלק את הרמות האפורות לשתי קבוצות - פיקסלים לבן עם רמות אפורות מעל τ (CFL), ופיקסלים שחורים עם רמות אפורות מתחת τ (ליבת RBC).
      הערה: ככל שיטה חלופית, השתמש thresholding ידני אם אף אחד אלגוריתם אוטומטי-thresholding מספק thresholding התמונה המתאימה. לחץ על לחצן הבחירה 'הידני' ולהתאים את המחוון כדי להגדיר את ערך thresholding הידני.
    9. כדי למדוד את השתנות מרחבית של רוחבי CFL, להיכנס פיקסלים ברזולוציה בתיבה 'רזולוציה פיקסל' (ברזולוציהעם הגדרת הניסוי הזה היה 0.42 מיקרומטר / פיקסל).
    10. לחץ על הכפתור "החישוב" כדי להשיג את הווריאציה המרחבי של רוחבי CFL. לחץ על 'ייצוא .csv' כדי לייצא את הנתונים רוחב CFL במתכונת מפוצלת.
    11. כדי למדוד את הווריאציה הזמנית של רוחבי CFL ב קו ניתוח ספציפי לאורך הספינה, לחץ על לחצן הבחירה 'Temporal הווריאציה' והזן את מידע מסגרת דולר (שער המסגרת המשמש הגדרת הניסוי הזה היה 3,000 מסגרות / sec).
    12. הזן את המסגרת הראשונה ועל המסגרת האחרונה של התמונות לניתוח בתיבות 'התחילו Frame' ו 'Frame האחרונה', בהתאמה.
    13. בחר את המיקום של קו הניתוח לאורך הכלי-ידי הסטת המחוון 'ניתוח הקו ". אשר את המיקום של קו הניתוח, אשר באה לידי ביטוי הוא 'תמונה בגוונים האפורה' ו 'תמונה בינארי ".
    14. לחץ על 'חשב' כדי להשיג את הווריאציה הזמנית של רוחבי CFL. CLIck 'יצוא .csv' כדי לייצא את נתוני רוחב CFL במתכונת מפוצלת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ויזואליזציה של CFL in vivo תלויה במידה רבה על ההכנות כירורגית של החיה. איבוד דם מוגזם או משך ניתוח מורחב עלול לחשוף את החיה לזעזע ומשוגות זרימת דם. שמירה על טמפרטורת רקמות באמצעות כרית חימום וכן פלטפורמה אישית במהלך הניתוח ולהתנסות גם חיונית בשמירה על המצבים הפיסיולוגיים של החולדה. באמצעות מנורת הלוגן W 100 במערכת מיקרוסקופ, אין נזק לרקמות להבחין נצפתה גם בסוף הניסוי.

איור 2 א מראה זרימת RBC טיפוסית באמצעות עורקיק unbranched בשריר העכברוש Cremaster, שבו CFL ניתן להבחין בין ליבת RBC ו בדפנות כלי הדם הפנימיות (איור 2 ג). ניגודיות טובה בין מרכיבים אלה במהלך הניסוי חיוני להבטחת הדיוק של מדידות רוחב CFL. השלב הראשוני של ניתוח התמונה כרוךזיהוי של כלי הקיר הפנימי. על ידי רכישה לפרופיל עוצמת האור לאורך קו ניתוח בניצב לכלי השיט, המיקום הוא מקורב בשיא כי מעבר את צבעם מכהה לבהיר יותר משני פיקסלים (איור 2 ב).

כפי RBCs ו CFL להחזיק העברת אור שונה, ההבדל ברמות אפורות אפשר לחלק לשתי קבוצות (תמונה בינארית). עם זאת, זיהוי ערך סף המדויק בין שתי הפסגות בהיסטוגרמה התמונה עשוי להיות מוגבל על ידי איכות ירודה של תמונה וניגודיות (איור 3 א). כדי לשפר את הניגודיות בין RBCs ו CFL, מסנן כחול יכול לשמש (איור 3). זה ניכר גם באיור 4, שבו הגבולות של ליבת RBC ניתן לזהות באופן מדויק יותר עם השימוש של מסנן כחול. יתר על כן, הבחירה של אלגוריתם thresholding 20-23 גם יכול להשפיע על המדידה של רוחב CFL (איור4). זה בא לידי ביטוי האיור 4A כי אלגוריתמי thresholding שונים הביאו גבול ליבה שונה RBC המזוהה, דבר אשר עלול להוביל למדידת CFL שגויה. כדי להדגים יותר את ההשפעה של האלגוריתם thresholding על מדידת רוחב CFL באיור 4 ב ', את הפרופילים מרחבית עבור רוחבי CFL שהושגו באמצעות אלגוריתמים thresholding שונים מוצגים איור 5 ו מסוכמים בטבלה 1.

איור 1
איור 1:. Intravital המיקרוסקופי מערכת Cremaster שרירים הכנה ת:. בניתוח שריר העכברוש Cremaster exteriorized B: מותאם פלטפורמה עם גופי חימום עבור צבת שריר Cremaster ושמירת הטמפרטורה שלו ב 35 ° C C:. מערכת מיקרוסקופית עם customized הבמה החיה ואת המצלמה במהירות גבוהה עבור להדמיה של זורם דם microcirculatory בשריר Cremaster D:. בקר טמפרטורה משוב שלילי וכוח אספקת E:. מערכת להרכשת נתונים פיזיולוגיים לניטור לחץ רצוף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: עיבוד תמונה עבור קביעת כלי סטריט עמדה ורוחב CFL ת:.. תמונה בגווני אפור אופיינית של זרימת RBC בתוך עורקיק (קוטר כלי = 52 מיקרומטר) B: פרופיל עוצמת האור לאורך קו ניתוח (קו מוצק בלוח) . C: תוצאת נציג מדידת CFL לאורך הספינה. החיצים מוצקים מקווקווים מציינים בדפנות כלי הדם הפנימיות הקצה חיצוני של ליבת RBC, בהתאמה. (LWB & RWB: שמאלה גבול בדפנות כלי דם תקינים, LCB & RCB: שמאלה גבול ליבה תקין RBC) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:.. שיפור ניגודיות תמונה עם מסנן כחול אופטי היסטוגרמה תמונה של תמונות בגווני אפור שהושג ללא (א) ו עם מסנן כחול (B) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
Figurדואר 4: רוחב Core RBC נקבע באמצעות חמישה אלגוריתמים ערכים סף שונים גבולות ליבת RBC ו בדפנות כלי דם על גבי תמונות בגוונים אפורות באיור 3.. (שורה העליונה (א): ללא מסנן כחול, בשורה תחתונה (B): עם מסנן כחול) באמצעות (משמאל לימין) את השיטה של ​​אוטסו, שיטת מינימום, שיטת intermode, שיטת בחירת איטרטיבי (Isodata) ו thresholding אנטרופי המטושטש (Shanbhag). הקווים המוצקים מקווקווים מציינים בדפנות כלי הדם הפנימיות הקצה חיצוני של ליבת RBC, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: וריאציה המרחבית של רוחב CFL רוחבי CFL המתאים איור 4B לאורך צדו השמאלי (א).וימינה (B) דפנות כלי, בהתאמה. (D: מרחק בקוטר כלי) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1: ערכי הסף ו CFL רוחב נתונים באיור 5. * p <0.001: הבדל משמעותי משיטה של Otsu. † p <0.001: הבדל משמעותי משמאל. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחני t מזווגים זנב השני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מדידת רוחב CFL חיונית להבנה טובה יותר של ופרמטרים המודינמיים בזרימת הדם. בפרט, מדידת רוחב CFL שבוצעה mesenteric 6, spinotrapezius 24 ו מוחין 25 microcirculations. המדידה המקובלת של רוחבי in vivo CFL הוגבל הערכות על ידי בדיקה ידנית של מסגרות הווידאו המוקלט. המדידות הידניות הנדרשות המיצוע של מסגרות וידאו מספר רצופות לפני חזותי זיהוי גבולות קירות הבסיס וכלי RBC 15,16. במחקר אחר, isothiocyanate והעמסה (FITC) -labelled RBCs ו isothiocynate rhodamine-B (RITC) הפלזמה שכותרתו שמשה כדי לקבוע את רוחב CFL הממוצע microvessels חתול מוחות 25. שיטות מדידה הקודמות אלה הם מאוד זמן רב ודורשות צעדים נוספים עבור תיוג פלורסנט, אשר מגביל את הרזולוציה במרחב ובזמן של wi CFLמדידת DTH. לעומת זאת, על ידי צימוד הקלטות מצלמה במהירות גבוהה אל פילוח תמונה יעיל וניתוח, הטכניקה הפגינה כאן מאפשרת הכימות של וריאציות spatiotemporal של CFL עם רזולוציה מרחבית (0.42 מיקרומטר) צו קטן יותר מהגודל של RBC ו החלטה זמנית של שניות 1 / 3,000.

הכנה כירורגית נכונה של השריר Cremaster הוא קריטי בקביעת דיוק מדידת רוחב CFL. בפרט, הסרה יסודית של רקמות חיבור סמוכות היא חיונית על מנת להבטיח התמקדות יעילה של arterioles בשריר Cremaster. בנוסף, ברזולוציה של זמן ומרחב של המדידה תלויה מפרטים מיקרוסקופ ומצלמה. בעוד מטרה בהגדלה גבוהה יותר עשויה לשפר את הרזולוציה המרחבית, היא מפחיתה את שדה הראייה, אשר בתורו מגביל את אורך כלי השגה לכימות וריאציה המרחבית של רוחב CFL. לכן, microscopiתצורות ג ניתן לשנות בהתאם ליישום הספציפי של הטכניקה.

פילוח תמונה היא גורם חשוב נוסף לדיוק מדידת רוחב CFL. בין הטכניקות השונות שפותחו, thresholding התמונה מבוסס על היסטוגרמה רמה אפורה מספק גישה פשוטה ויעילה עבור פילוח תמונה וניתוח. בהתאם לכך, חזית אובייקטים המחולצים הרקע המבוסס על ההבדל ברמות האפורות שלהם. במקרה האידיאלי, ההיסטוגרמה התמונה יהיה bimodal ואת ערך סף בתחתית העמק הוא טריוויאלי. עם זאת, in vivo תמונות ניסיון תמיד אינן מציגות פרופילים רמים בגווני אפור כזה. התוצאות שלנו הראו איך איכות וחדות התמונה יכולה להשפיע על תהליך פילוח התמונה. השימוש מסנן כחול אופטי משמעותי משופרת הניגוד בין RBCs ואת הפלזמה בתוך עורקיק (איור 3), וזה נראה חיוני כאשר applyinG את thresholding מבוסס היסטוגרמה למדידת רוחב CFL תלות האלגוריתמים (איור 4). התוצאה היא היסטוגרמה תמונת bimodal ברורה, המאפשרת אחד כדי לזהות את ערך הסף ביעילות. עם זאת, יש לציין כי גם עם היסטוגרמה bimodal המתקבלת תמונות in vivo, גידול שונה שוויוני מאוד של שתי פסגות (מקסימום מקומי) ו עמק רחב (מינימום מקומי) של ההיסטוגרמה עדיין יכולים להשפיע על בחירת הסף (טבלת 1 ). לכן, הבחירה של אלגוריתם thresholding המתאים צריכה להיבחן על בסיס איכות התמונה ואת המשתמשים צריכים לקחת בחשבון את המגבלות של כל אלגוריתם thresholding להתאמת ביותר לכימות רוחבי CFL.

ככל רוחבי CFL תלוי במידה רבה על תנאי הזרימה, מדידה לחץ דם רציף לאורך כל תקופת הניסוי חיונית. על מנת לקבוע את תנאי זרימה המקומיים,שיעור pseudoshear של זרימת הדם יכול להיות מחושב על ידי מדידת מהירות זרימה הממוצעת של כלי דם 5.

לסיכום, הפרוטוקולים לעריכת כירורגית של שריר עכברוש Cremaster וניתוח תמונה כמותית המתואר כאן כבר נוצלו כדי להשיג מידע כמותי על וריאציה הדינמי של רוחבי CFL in vivo. האתגרים העיקריים בהבטחת הדיוק של מדידות רוחב CFL כוללים הכנת כירורגית התקין של פילוח השריר ותמונה, אשר שניהם טופלו לעיל. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללימודים microcirculatory אחרים לבחון את hemorheological ומשוגות המודינמי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כתוצאה מכך, ממצאים אלה תורמים לפיתוח העתידי של גישות טיפוליות כלי דם ואת התערבות קלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intravital microscope Olympus BX51WI Equipment
High speed camera Photron 1024PCI Equipment
Blue filter HOYA B390 Equipment
Pressure sensor & biopac system Biopac system TSD104A, MP100 Equipment
Temperature controller Shimaden SR 1 Equipment
Plasma Lyte A Baxter NDC:0338-0221 Warm in 37 °C water bath before use
Saline 0.9% Braun
Heparin (5,000 IU/ml) LEO
PE-10 polyethylene tube Becton Dickinson 427400 .024" OD x .011" ID 
PE-50 polyethene tube Becton Dickinson 427411 .038" OD x .023" ID
PE-205 polyethene tube Becton Dickinson 427446 .082" OD x .062" ID
2-0 non-absorbable silk suture Deknatel 113-S
5-0 non-absorbable silk suture Deknatel 106-S
Water circulating heating pad Gaymar
Water bath Fisher Scientific Isotemp 205 Equipment
Sterile Cotton Gauze  Fisher Scientific 22-415-468
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-124
Dumont Forceps Kent Scientific INS14188 Surgical instrument
Micro Dissecting forceps Kent Scientific INS15915 Surgical instrument
Iris forceps 1 x 2 teeth Kent Scientific INS15917 Surgical instrument
Vessel cannulation forceps Kent Scientific INS500377 Surgical instrument
Micro scissor Kent Scientific INS14177 Surgical instrument
Iris scissor Kent Scientific INS14225 Surgical instrument
Vessel clip Kent Scientific INS14120 Surgical instrument
Gemini cautery system Braintree Scientific GEM 5917 Surgical instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
  2. Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
  3. Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
  4. Goldsmith, H. L. The Microcirculatory Society. Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).
  5. Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
  6. Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
  7. Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
  8. Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
  9. Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).
  10. Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
  11. Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
  12. Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
  13. Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
  14. Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
  15. Maeda, N. Erythrocyte rheology in microcirculation. Jpn J Physiol. 46 (1), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714 1-14 (1996).
  16. Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
  17. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
  18. Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
  19. Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
  20. Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
  21. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  22. Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. The analysis of cell images. Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).
  23. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
  24. Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
  25. Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
  26. Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).

Tags

הנדסה ביו-רפואית גיליון 116 שכבת פלזמה ופרמטרים המודינמיים מיקרו הכנת שריר Cremaster microvasculature ויזואליזציה זרימת הדם
ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, Y. C., Fisher, L. K., Salim, V., … More

Ng, Y. C., Fisher, L. K., Salim, V., Kim, S., Namgung, B. Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle. J. Vis. Exp. (116), e54550, doi:10.3791/54550 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter