Protocol
Este estudio está de acuerdo con la Universidad Nacional de Singapur Institucional Cuidado de Animales y el empleo (protocolo aprobado ninguna. R15-0225).
1. Preparación quirúrgica del modelo animal
- los lúmenes de los vasos
- Anestesiar a ratas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de edad) con un peso (203 ± 20) g con ketamina (37,5 mg / ml) y xilazina (5 mg / ml) cóctel a través de inyección intraperitoneal (ip) (2 ml / kg) . No vuelva a tapar la aguja o quitarlo de la jeringa después de la inyección.
- Una vez que el animal ha sido anestesiado (confirmado por los pies pellizcos), colocarlo sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 ° C. afeitarse suavemente el pelo en la escápula, el cuello uterino anterior, parte baja del abdomen, pierna trasera medial y el saco escrotal. frenar suavemente las piernas utilizando cintas adhesivas de papel.
- Realizar todos los procedimientos quirúrgicos con tijeras de microdisección y pinzas en ángulo mientras observa a travésun microscopio estereoscópico. Coloque todos los instrumentos quirúrgicos cortantes en una bandeja resistente a la punción para evitar lesiones durante la cirugía.
- Fregar todos los sitios quirúrgicos 3 veces alternando con yodo y alcohol al 70% antes de realizar la incisión. Enjuague todos los catéteres con 30 solución de heparina-solución salina IU / ml.
- Hacer un 1-1,5 cm incisión en la piel en la línea media en las escápulas usando un par de tijeras quirúrgicas sobre la vena yugular derecha. Separar la fascia mediante disección roma para exponer la vena yugular y canular con un tubo de polietileno (PE-50) lleno de solución salina de heparina usando suturas de seda 5-0. Infundir anestesia suplementaria cuando sea necesario (1/3 a 1/2 de la dosis inicial, intravenosa (iv)) durante el curso de la cirugía y el experimento.
- Realizar traqueotomía para mantener la permeabilidad de la vía aérea. Hacer un 1 - 1,5 cm de la incisión en la zona cervical anterior. Canular la tráquea utilizando un tubo de polietileno (PE-205) con suturas de seda 2-0 para asegurar el catéter en su lugar.
- Vigilar la presión arteriala través de la canulación de la arteria femoral. Hacer un 1 - 1,5 cm incisión en la superficie medial izquierdo de la pata trasera. Separar la arteria femoral mediante disección roma. Canular la arteria femoral con un tubo de polietileno (PE-10) lleno de solución salina de heparina usando suturas de seda 5-0.
- Cremaster músculo Preparación y flujo de visualización
- Inserte una sutura de seda 5-0 a través del vértice del saco escrotal para extenderla. Hacer una incisión a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal. Regularmente aplicar solución caliente isotónica (37 ° C; pH 7,4) al músculo expuesto.
- Retire rodea los tejidos conectivos cuidadosamente ya fondo con un aplicador con punta de algodón.
- Inserte una sutura de seda 5-0 a través del ápice del músculo cremáster. Cortar la sutura en dos piezas de igual longitud y un nudo en cada lado. Cortar el músculo entre los dos nudos y se extienden sobre una plataforma de plexiglás transparente personalizado tirando suavemente de la sutura. Fijarel extremo de la sutura a la plataforma con la tachuela azul.
NOTA: la eliminación general de los tejidos conectivos que rodea es fundamental para determinar un contraste de imagen óptima. - 1.2.3 repita el paso hasta que se hagan de 5 a 6 fijaciones. Retirar con cuidado el músculo cremáster del epidídimo utilizando cauterio alta temperatura. Superfuse solución isotónica caliente al músculo expuesto para prevenir la deshidratación del tejido.
- Rodea el músculo cremáster con piezas plegadas de gasa. Cubrir el músculo expuesto con una película de polivinilo. Las piezas de gasa con la película forman una cubeta poco profunda para contener solución isotónica caliente para el objetivo del microscopio de inmersión en agua (Figura 1A).
- Transferir el animal en el escenario animal de un microscopio intravital (Figura 1C). Conectar la canulación arterial a un sistema de adquisición de datos fisiológicos de control de la presión continua (Figura 1E).
- Mantener la temperat muscularure a 35 ° C con un elemento de calentamiento fijado debajo de la plataforma de los animales (Figura 1B). Colocar una sonda de temperatura al lado del músculo para proporcionar retroalimentación negativa para el controlador de potencia del elemento de calentamiento (Figura 1D).
- Dejar al animal en el escenario durante 15 min se equilibre con el medio ambiente.
- Visualizar el flujo sanguíneo en un microscopio intravital con un objetivo de inmersión en agua de 40X y un condensador de trabajo larga.
- Elija una arteriola no ramificado (<60 micras), basado en un enfoque de la imagen clara y el contraste entre el núcleo de glóbulos rojos, paredes CFL y de los vasos, con el fin de enfocar el microscopio en el plano diametral del vaso sanguíneo. Girar la cámara montada en el microscopio para alinear verticalmente la pared del vaso.
- Registrar el flujo de sangre usando una cámara de vídeo de alta velocidad a una velocidad de 3.000 / seg durante 1 seg. Guardar el vídeo grabado en formato AVI sin comprimir en escala de grises de 8 bits para preservar la calidad de la imagen.
NOTA: Se recomienda una velocidad mínima de fotogramas de grabación de 3.000 cuadros / seg para garantizar que la medición CFL se puede realizar al menos una vez por RBC en condiciones de flujo arteriolar fisiológicas. - Utilice un filtro azul con pico de transmisión a una longitud de onda de 394 nm y de paso de banda espectral a 310 - 510 nm para mejorar el contraste entre los glóbulos rojos y plasma.
NOTA: Asegúrese de que el espectro de la luz que pasa a través del filtro azul de la fuente de luz microscópico (100 W lámpara halógena) es de baja intensidad de la luz para evitar cualquier daño tisular potencial. - Al final del experimento, la eutanasia a los animales con una sobredosis de pentobarbital sódico.
2. Análisis de Imagen
- Procesamiento previo para la medida de ancho CFL
- Abra MATLAB y ejecute el archivo 'CFL_pre.m'. (Este y otros archivos de MATLAB se puede encontrar en elip "> Suplementario Archivo MATLAB.)
- Haga clic en "Abrir archivo" para seleccionar el archivo de vídeo para analizar.
- Ajuste el deslizador hacia la "rotación" para alinear verticalmente las paredes de los vasos.
NOTA: Los usuarios pueden visualizar las líneas de la cuadrícula de asistencia para la alineación buque seleccionando el botón de opción 'Guía On', y ajustar el nivel de zoom de la imagen deslizando el control deslizante "Zoom". - Haga clic en el botón "Confirmar Editar 'para confirmar la alineación del vaso.
- Haga clic en el botón 'Set ROI de cultivo "para definir la región de interés (ROI). La imagen alineada se mostrará en una ventana emergente. Ajustar el objetivo rectangular en la imagen y haga doble clic para confirmar el retorno de la inversión. Omitir este paso si no se requiere el recorte de la imagen.
NOTA: solo incluye un solo barco en el retorno de la inversión para analizar el ancho de CFL del recipiente. Haga clic en el botón "Reiniciar Imagen" para restaurar la imagen a su forma original, si es necesario. - Haga clic en el9; 'botón para extraer todos los fotogramas de vídeo editado en imágenes de mapa de bits consecutivos (en escala de grises de 8 bits' Extraer imágenes en formato BMP '). Las imágenes extraídas se pueden encontrar en la carpeta con el mismo nombre que el archivo de vídeo seleccionado.
- La medición de la anchura de CFL
- Abra MATLAB y ejecute el archivo 'CFL_measure.m'.
- Haga clic en "Seleccionar carpeta" para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes extraídas.
- Haga clic en la carpeta que contiene las imágenes y haga clic en "Seleccionar carpeta". El primer cuadro de imagen en la carpeta se carga y se muestra en el panel de "Escala de grises imagen ', junto con su gris histograma de intensidad en el panel' del histograma '.
- Seleccione el cuadro de imagen que desee en el cuadro de lista para realizar el análisis, de lo contrario se seleccionará el primer cuadro de la imagen.
- Haga clic en "Encontrar paredes de los vasos 'para identificar la pared del vaso interno en la imagen, que se determina en el lugar donde laperfil de intensidad de luz tránsitos pico de oscuro a claro más de dos píxeles.
- Check 'filtro de mediana' para aplicar un filtro de mediana a la imagen para reducir el ruido "sal y pimienta".
- Consultar "Contraste automático" para ajustar las intensidades de imagen digital para mejorar el contraste de la imagen.
- Seleccione un algoritmo de umbral en el cuadro de lista que determina automáticamente un valor de umbral (τ) que divide los niveles de gris en dos clases - los píxeles blancos con niveles de gris por encima τ (CFL), y los píxeles negros con niveles de gris por debajo de τ (RBC básicos).
NOTA: Como un método alternativo, el uso de umbralización manual si ninguno de algoritmo de umbral automatizado proporciona una umbralización imagen correspondiente. Haga clic en el botón de opción "Manual" y ajustar el control deslizante para definir el valor de umbral manual. - Para medir la variación espacial de los anchos de CFL, introduzca la resolución de píxeles en el cuadro 'píxeles de resolución' (la resolucióncon esta configuración experimental fue 0,42 m / píxel).
- Haga clic en el botón "Calcular" para obtener la variación espacial de los anchos de CFL. Haga clic en ".csv Exportar 'para exportar los datos de anchura CFL en un formato tabulado.
- Para medir la variación temporal de los anchos de CFL en una línea de análisis específico a lo largo del recipiente, haga clic en el botón de opción 'Variación temporal' e introduzca la información de velocidad de fotogramas (la frecuencia de imagen utilizada en este sistema experimental fue de 3.000 cuadros / seg).
- Introduzca el primer fotograma y el último fotograma de las imágenes para el análisis de las cajas 'de comienzo de trama "y" último cuadro', respectivamente.
- Seleccione la posición de la línea de análisis a lo largo del buque deslizando la barra deslizante 'Análisis de línea ». Confirmar la posición de la línea de análisis, que se ilustra en tanto la 'Escala de grises imagen' y 'la imagen binaria'.
- Haga clic en "Calcular" para obtener la variación temporal de los anchos de CFL. Click 'Exportar CSV "para exportar los datos de anchura CFL en un formato tabulado.
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Representative Results
La visualización de la CFL in vivo depende en gran medida de las preparaciones quirúrgicas de la animal. pérdida excesiva de sangre o la duración de la cirugía prolongada se puede someter al animal a golpes y aberraciones del flujo sanguíneo. El mantenimiento de la temperatura del tejido usando una almohadilla de calefacción, así como una plataforma personalizada durante la cirugía y el experimento también es crucial para el mantenimiento de las condiciones fisiológicas de la rata. Mediante el uso de una lámpara halógena de 100 W en el sistema de microscopio, no se observó daño en los tejidos discernible incluso al final del experimento.
La Figura 2A muestra un típico flujo de RBC a través de una arteriola no ramificado en el músculo cremáster rata, donde la CFL se puede observar entre el núcleo de RBC y la pared interna del vaso (Figura 2C). Un buen contraste entre estos componentes durante el experimento es fundamental para garantizar la exactitud de las mediciones de ancho CFL. La fase inicial del análisis de imágenes implica ladetección de la pared interna del vaso. Al adquirir el perfil de intensidad de luz a lo largo de la línea perpendicular al análisis de la embarcación, la ubicación es aproximada en el pico que los tránsitos de oscuro a claro sobre dos píxeles (Figura 2B).
Como los glóbulos rojos y CFL poseen diferente transmitancia de la luz, la diferencia de niveles de gris se puede subdividir en dos clases (imagen binaria). Sin embargo, la identificación de un valor de umbral precisa entre los dos picos en el histograma de la imagen puede ser restringido por la mala calidad de la imagen y el contraste (Figura 3A). Para mejorar el contraste entre el RBC y CFL, un filtro azul se puede utilizar (Figura 3B). Esto es también evidente en la Figura 4, en el que los límites del núcleo de RBC se pueden identificar con más precisión con el uso de un filtro azul. Además, la selección de algoritmo de umbral 20 a 23 también puede influir en la medición de la anchura CFL (Figura4). Es evidente en la figura 4A que los diferentes algoritmos de umbralización dieron lugar a diferentes límites de RBC núcleo individualizado, lo que a su vez podría conducir a mediciones erróneas CFL. Para ilustrar mejor la influencia del algoritmo de umbral en la medida de ancho CFL en la Figura 4B, los perfiles espaciales para los anchos de CFL obtenidos utilizando diferentes algoritmos de umbral se muestran en la Figura 5 y se resumen en la Tabla 1.
B quirúrgicamente exteriorizado Cremáster rata:: personalizar plataformas con elementos de calefacción para colocar el músculo cremáster y mantener su temperatura a 35 ° C C: Figura 1:. Intravital sistema microscópico y Cremaster preparación muscular A.. Microscópico sistema con customized etapa animal y cámara de alta velocidad para la visualización de flujos de sangre en la microcirculación en el cremáster muscular. D: controlador de temperatura negativo y la regeneración fuente de alimentación E:.-sistema de adquisición de datos fisiológicos para control de la presión continua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procesamiento de Imágenes para la determinación de la pared del deposito de posición y CFL Ancho A:.. La imagen en escala de grises típica de flujo de RBC en una arteriola (diámetro de los vasos = 52 micras) B: perfil de intensidad de luz a lo largo de la línea de análisis (línea continua en el panel A) . C: resultado representativo de la medición de CFL lo largo del vaso. losflechas continuas y de trazos indican la pared interna del vaso y el borde exterior del núcleo RBC, respectivamente. (LWB y RSF: la izquierda y la pared del vaso límite derecho, LCB y RCB: izquierda y derecha de RBC núcleo límite) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:.. Mejora del contraste de imagen con un filtro azul óptica histograma Imagen de las imágenes en escala de grises adquiridos sin (A) y con filtro azul (B) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
figure 4: RBC Core anchura determinada usando cinco diferentes algoritmos de umbralización Límites de RBC núcleo y la pared del vaso superpuesta a imágenes en escala de grises en la Figura 3.. (Fila superior (A): sin filtro azul, la fila inferior (B): con filtro azul) usando (de izquierda a derecha) el método de Otsu, método mínimo, el método intermodo, método de selección iterativa (Isodata) y umbralización entrópica fuzzy (Shanbhag). Las líneas continuas y discontinuas indican la pared interna del vaso y el borde exterior del núcleo de RBC, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Variación espacial de CFL Anchura anchuras CFL correspondientes a la figura 4B a lo largo de la izquierda (A).y derecha (B) paredes de los vasos, respectivamente. (D: distancia del diámetro del vaso) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: valores umbral y CFL anchura de los datos de la Figura 5. * p <0,001: diferencia significativa con el método de Otsu. † p <0,001: diferencia significativa desde la izquierda. Los análisis estadísticos se realizaron mediante prueba t no pareada de dos colas.
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Discussion
La medición de la anchura CFL es esencial para una mejor comprensión de la hemodinámica en la microcirculación. En particular, la medición de las anchuras CFL se ha realizado en mesentérica 6, spinotrapezius 24 y cerebrales 25 microcirculations. La medición convencional de la in vivo anchuras CFL se restringió a estimaciones por la inspección manual de los fotogramas de vídeo grabadas. Las mediciones manuales requieren el cálculo del promedio de varios fotogramas de vídeo sucesivas antes de identificar visualmente los límites del núcleo y de los vasos paredes RBC 15,16. En otro estudio, isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con isotiocianato de glóbulos rojos y rodamina-B (RITC) plasma marcadas se utiliza para determinar las anchuras medias CFL en microvasos cerebrales gato 25. Estos métodos de medición anteriores consumen mucho tiempo y requieren pasos adicionales para el etiquetado fluorescente, lo que limita la resolución espacial y temporal de la conexión wi CFLmedición de DTH. Por el contrario, mediante el acoplamiento de las grabaciones de la cámara de alta velocidad para una segmentación efectiva de imagen y el análisis, la técnica mostrada aquí permite la cuantificación de las variaciones espacio-temporales de la CFL con una resolución espacial (0,42 m) de un orden menor que el tamaño de un RBC y una resolución temporal de 1 / 3.000 seg.
preparación quirúrgica adecuada del músculo cremáster es crítica en la determinación de la precisión de las medidas de la anchura CFL. En particular, la eliminación completa de los tejidos conectivos adyacentes es esencial para asegurar un buen enfoque de las arteriolas en el músculo cremáster. Además, la resolución temporal y espacial de la medición depende de las especificaciones del microscopio y la cámara. Mientras que un objetivo mayor aumento puede mejorar la resolución espacial, se reduce el campo de visión, que a su vez limita la longitud recipiente obtenible para la cuantificación de la variación espacial de la anchura CFL. Por lo tanto, la microscopiconfiguraciones de C pueden ser modificados de acuerdo a la aplicación específica de la técnica.
segmentación de imágenes es otro factor importante para la exactitud de la medida de ancho CFL. Entre las diversas técnicas desarrolladas, umbralización imagen basada en histograma de niveles de gris proporciona un enfoque sencillo y eficaz para la segmentación y análisis de imágenes. De acuerdo con ello, los objetos de primer plano se extraen del fondo en base a la diferencia en sus niveles de gris. En el caso ideal, el histograma de la imagen será bimodal y un valor umbral en el fondo del valle es trivial. Sin embargo, in vivo imágenes experimentales no siempre exhiben tales perfiles de nivel de escala de grises. Nuestros resultados han demostrado que la calidad de la imagen y el contraste pueden influir en el proceso de segmentación de imágenes. El uso de un filtro azul óptica mejorada significativamente el contraste entre los glóbulos rojos y el plasma en una arteriola (Figura 3), y que parece ser esencial cuando aplg el umbral basado en histograma para la medida de ancho CFL independientemente de los algoritmos (Figura 4). Esto resulta en un histograma de la imagen bimodal distinto, que permite identificar el valor de umbral de manera eficaz. Sin embargo, hay que señalar que incluso con un histograma bimodal obtenido a partir de las imágenes en vivo, una variación extremadamente desigual de los dos picos (máximos locales) y un amplio valle (mínimo local) del histograma todavía pueden influir en la selección de umbral (Tabla 1 ). Por lo tanto, la selección de un algoritmo de umbral apropiado necesita ser examinada en base a la calidad de la imagen y los usuarios tienen que considerar las limitaciones de cada algoritmo de umbral para la mejor adecuación en la cuantificación de los anchos de CFL.
Como las anchuras de CFL dependen en gran medida de las condiciones de flujo, arterial continua medición de la presión a lo largo del curso del experimento es esencial. Con el fin de determinar las condiciones de flujo locales,la tasa de pseudoshear del flujo de sangre se puede calcular midiendo la velocidad media del flujo en el vaso sanguíneo 5.
En resumen, se han utilizado los protocolos para la preparación quirúrgica de un músculo cremáster rata y análisis de imagen cuantitativo descrito aquí para adquirir información cuantitativa sobre la variación dinámica de los anchos de CFL en vivo. Los principales desafíos para asegurar la exactitud de las medidas de ancho CFL incluyen la preparación quirúrgica adecuada del músculo y la segmentación de imágenes, ambos de los cuales se han abordado anteriormente. Esta técnica se puede adaptar fácilmente a otros estudios para investigar la microcirculación hemorreológico y aberraciones hemodinámicos en varias condiciones fisiológicas y patológicas. En consecuencia, estos hallazgos contribuyen al futuro desarrollo de enfoques terapéuticos microvasculares y la intervención clínica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
- Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
- Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
- Goldsmith, H. L.
- Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
- Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
- Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
- Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
- Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
- Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
- Maeda, N.
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
- Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
- Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L.
- Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
- Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
- Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
- Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).
