Protocol
Denna studie är i enlighet med National University of Singapore Institutional Animal Care och användning kommittén (godkänt protokoll nr. R15-0225).
1. Kirurgisk Framställning av djurmodell
- kärlkanyle
- Söva en Sprague-Dawley-råttor av hankön (6 - 7 veckor gamla) med en vikt (203 ± 20) g med ketamin (37,5 mg / ml) och xylazin (5 mg / ml) cocktail genom intraperitoneal (ip) injektion (2 ml / kg) . Inte återblick nålen eller ta bort den från sprutan efter injektionen.
- När djuret har sövd (bekräftas av tå nypa), placera den på en värmedyna för att bibehålla sin kroppstemperatur vid 37 ° C. raka försiktigt håret på skulderbladen, främre livmoderhalsen, nedre delen av magen, mediala bakben och pungen. hålla försiktigt benen med hjälp av självhäftande papper band.
- Utför alla kirurgiska ingrepp med hjälp av microdissection sax och vinklade pincett när du tittar genomett stereomikroskop. Placera alla vassa kirurgiska verktyg på en punkteringsresistent fack för att förhindra skador under operationen.
- Skrubba alla kirurgiska platser 3 gånger med omväxlande jod och 70% alkohol innan du utför snittet. Spola alla katetrar med 30 IU / ml heparin-saltlösning.
- Gör en 1-1,5 cm mittlinje hudsnitt på scapulae med användning av ett par av kirurgiska saxar över den högra halsvenen. Separera fascia genom trubbig dissektion för att exponera halsvenen och cannulate det med ett polyetenrör (PE-50) fylld med heparin-saltlösning med hjälp av 5-0 siden suturer. Ingjuta kompletterande anestesi vid behov (1/3 till 1/2 av initialdosen, intravenös (iv)) under hela operationen och experiment.
- Utför trakeostomi att upprätthålla fria luftvägar. Gör en 1-1,5 cm snitt i främre halsområdet. Kanylera trakea med användning av ett polyetylenrör (PE-205) med 2-0 silkessuturer att fästa katetern på plats.
- Övervaka blodtryckgenom kanyl i lårbensartären. Gör en 1-1,5 cm snitt vid den vänstra mediala ytan av bakbenet. Separera den femorala artären genom trubbig dissektion. Cannulate lårbensartären med ett polyetenrör (PE-10) fylld med heparin-saltlösning med hjälp av 5-0 siden suturer.
- Kremastermuskeln Förberedelse och Flow Visualization
- Sätt en 5-0 silke sutur genom spetsen av pungen att förlänga det. Gör ett snitt längs den ventrala ytan av pungen. Regelbundet tillämpa varm isoton lösning (37 ° C; pH 7,4) till den exponerade muskeln.
- Ta bort omgivande bindväv försiktigt och noggrant med en bomullspinne.
- Infoga en 5-0 silkesutur genom spetsen av kremastermuskeln. Skär suturen i två stycken med samma längd och knyt en knut på varje sida. Skär muskeln mellan de två knutar och sträcka ut den på en anpassad transparent plexiglas plattform genom att försiktigt dra suturen. Fixeraslutet av suturen på plattformen med blå klibb.
OBS: Grundlig borttagning av omgivande bindväv är avgörande för att få optimal bildkontrast. - Upprepa steg 1.2.3 tills 5 till 6 upptagningar görs. Försiktigt bort kremastermuskeln från bitestiklarna använder kauterisation hög temperatur. Superfuse varm isotonisk lösning till den exponerade muskeln för att förhindra uttorkning av vävnaden.
- Omge kremastermuskeln med vikta bitar av gasväv. Täck den exponerade muskeln med en polyvinyl film. Gasväv bitar med filmen bildar en grund bassäng för att hålla varm isoton lösning för vattenimmersionsmikroskopobjektiv (Figur 1A).
- Överför djuret på djurstadiet av en intravital mikroskop (Figur 1C). Anslut artärkanyle till en fysiologisk datainsamlingssystem för kontinuerlig tryckövervakning (figur 1E).
- Bibehålla muskeltempure vid 35 ° C med en uppvärmningselement fäst under djuret plattformen (Figur 1B). Placera en temperatursond bredvid muskler för att ge negativ återkoppling till effektstyrenheten av värmeelementet (figur 1D).
- Lämna djuret på scenen i 15 min för att jämvikta med miljön.
- Visualisera blodflöde under en intravital mikroskop med en 40X vattenimmersionsobjektiv och en lång arbetsdag kondensor.
- Välj en ogrenad arteriole (<60 pm) bygger på en tydlig bildskärpa och kontrast mellan RBC kärna, CFL och kärlväggar, för att fokusera mikroskopet på diametrala planet av blodkärlet. Rotera kameran monterad på mikroskopet för att inrikta kärlväggen vertikalt.
- Spela blodflödet med hjälp av en höghastighetsvideokamera med en bildhastighet på 3000 / sek 1 sek. Spara den inspelade videon som okomprimerad 8-bitars gråskala AVI-format för att bevara bildkvaliteten.
NOTERA: En minsta inspelningsbildfrekvens på 3000 bildrutor / sek rekommenderas för att säkerställa som kan utföras minst en gång per RBC under fysiologiska arteriell strömningsförhållanden CFL mätningen. - Använd ett blått filter med maximal transmission vid en våglängd av 394 nm och spektral bandpass på 310 - 510 nm för att öka kontrasten mellan de röda blodkropparna och plasma.
OBS: Se till att ljusspektrum som passerar genom den blå filtret från mikroskopiska ljuskällan (100 W halogenlampa) är av låg ljusintensitet för att förhindra eventuella vävnadsskador. - Vid slutet av experimentet, avliva djuret med en överdos av pentobarbitalnatrium.
2. Bildanalys
- Förbehandla för bredden mätning CFL
- Öppna MATLAB och kör "CFL_pre.m" fil. (Detta och andra MATLAB-filer kan hittas iip "> Kompletterande MATLAB arkiv.)
- Klicka på "Öppna fil 'för att välja videofilen att analysera.
- Justera reglaget "Rotation" för att rikta kärlväggarna vertikalt.
OBS: Användare kan visa medhjälpande rutnätslinjer för fartyget inriktning genom att välja "Grid på alternativknappen och justera zoomnivå av bilden genom att föra reglaget" Zoom ". - Klicka på "Bekräfta Redigera" för att bekräfta fartygets inriktning.
- Klicka på "Ställ in ROI att beskära" för att definiera regionen av intresse (ROI). Den linje bilden kommer att visas i ett popup-fönster. Justera rektangulära mål på bilden, och dubbelklicka för att bekräfta ROI. Hoppa över detta steg om beskärning av bilden inte erfordras.
OBS: inkluderar endast ett enda fartyg i ROI att analysera CFL bredd från fartyget. Klicka på Återställ bild "för att återställa bilden till sin ursprungliga form, om så är nödvändigt. - Klicka på9, extrahera bilder "för att extrahera alla redigerade bildrutor i konsekutiva bit kartbilder (8-bitars gråskala" bmp "format). De extraherade bilder kan hittas i mappen med samma namn som den valda videofilen.
- Mätning av CFL bredd
- Öppna MATLAB och kör "CFL_measure.m" fil.
- Klicka på "Välj mapp" för att välja den mapp som innehåller de extraherade bilderna.
- Klicka på den mapp som innehåller bilderna och klicka på "Välj mapp". Den första bildrutan i mappen kommer att laddas och visas i "gråskala bilden" panel, tillsammans med sin grå intensitet histogram i "Bild Histogram" panel.
- Välj önskad bildramen från listrutan för att utföra analysen, annars den första bildrutan kommer att väljas.
- Klicka på "Hitta kärlväggarna" för att identifiera den inre kärlväggen i bilden, som bestäms på den plats där denljusintensitet profiltoppar transit från mörker till ljus över två bildpunkter.
- Ta "medianfilter" för att applicera ett medianfilter till bilden för att minska den "salt och peppar" buller.
- Kontrollera "Autokontrast" för att justera bildintensitet digitalt för att förbättra bildkontrasten.
- Välj en tröskelalgoritm i listrutan som automatiskt bestämmer ett tröskelvärdet (τ) som delar grånivåerna i två klasser - vita pixlar med grå nivåer över τ (CFL), och svarta pixlar med grå nivåer under τ (RBC kärna).
OBS: Som en alternativ metod, använda manuell tröskel om ingen av automatiserad-tröskelalgoritmen ger en lämplig bild tröskel. Klicka på "Manual" knappen och justera reglaget för att definiera den manuella tröskelvärdet. - För att mäta den rumsliga variationen av CFL bredd anger pixelupplösningen i "upplösning" box (upplösningmed denna experimentuppställning var 0,42 | j, m / pixel).
- Klicka på "Beräkna" för att få den rumsliga variationen av CFL bredder. Klicka på "Export CSV" för att exportera bredduppgifter CFL i en tabellformat.
- För att mäta tids variation av CFL bredder på en särskild analys linje längs fartyget, klicka på "Temporal Variation" knappen och mata in information bildfrekvensen (bildhastigheten som används i denna experimentuppställning var 3000 bilder / sek).
- Ange den första ramen och sista bildrutan i bilderna för analys i "Start ram" och "sista bildrutan" lådor, respektive.
- Välj positionen för analys linje längs fartyget genom att skjuta "Analys Line" skjutreglaget. Kontrollera positionen för analys linjen, vilket illustreras på både "gråskala bilden" och "binär bild".
- Klicka på "Beräkna" för att erhålla tids variation av CFL bredder. click "Export CSV" för att exportera bredduppgifter CFL i en tabellformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisering av den CFL in vivo är i hög grad beroende av de kirurgiska förberedelserna hos djuret. Överdriven blodförlust eller utökad kirurgi varaktighet kan utsätta djuret för stötar och blodflödes avvikelser. Bibehållande av vävnadstemperaturen med hjälp av en värmedyna samt en anpassad plattform under operationen och experimentera är också avgörande för att upprätthålla de fysiologiska betingelserna för råtta. Genom användning av en 100 W halogenlampa i mikroskopsystemet ades ingen urskiljbar vävnadsskada observeras även vid slutet av experimentet.
Figur 2A visar en typisk RBC-strömning genom en ogrenad arteriol i rått kremastermuskeln, där CFL kan observeras mellan RBC kärnan och den inre kärlväggen (figur 2C). En god kontrast mellan dessa komponenter under experimentet är kritisk för att säkerställa riktigheten i CFL breddmätningar. Den inledande fasen av bildanalysen involverardetektering av den inre kärlväggen. Genom att förvärva ljusintensitetsprofilen längs analys linje vinkelrät mot fartyget, är platsen approximeras på toppen som transit från mörker till ljus över två pixlar (Figur 2B).
Som RBC och CFL har olika ljustransmission, kan skillnaden i grånivåerna delas in i två klasser (binär bild). Emellertid kan identifieringen av ett exakt tröskelvärde mellan de två topparna i bildhistogrammet begränsas av dålig bildkvalitet och kontrast (figur 3A). För att förbättra kontrasten mellan RBC och CFL, en blå filter kan användas (figur 3B). Detta framgår också tydligt i fig 4, i vilken gränserna för RBC kärna kan mer exakt identifieras med användning av ett blått filter. Vidare kan valet av tröskelalgoritmen 20-23 också påverka mätningen av CFL bredd (Figur4). Det är uppenbart i figur 4A att olika tröskel algoritmer resulterade i olika RBC kärn gräns identifieras, vilket i sin tur kan leda till felaktiga CFL mätningar. För att bättre illustrera inverkan av tröskelalgoritmen på CFL breddmått i figur 4B, är de spatiala profiler för de CFL bredder erhållna med användning av olika tröskelalgoritmer som visas i figur 5 och sammanfattas i Tabell 1.
Figur 1:. Intravital Mikroskopisk System och kremastermuskeln Framställning A:. Kirurgiskt exteriorized råtta kremastermuskeln B: Anpassad plattform med värmeelement för att släppa ut kremastermuskeln och bibehålla dess temperatur vid 35 ° C C:. Mikroskopisk systemet med cusanpassade djurstadiet och höghastighetskamera för visualisering av mikrocirkulationen blodflöden i kremastermuskeln D:. Negativ feedback temperaturkontroll och strömförsörjning E:. Fysiologiska datainsamlingssystem för kontinuerlig övervakning tryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bildbehandling för bestämning av kärlväggen Position och CFL Bredd A:.. Typisk gråskalebild av RBC-strömning i en arteriole (kärldiameter = 52 pm) B: ljusintensitet profil längs analyslinje (heldragen linje i panel A) . C: representant resultat av CFL mätning längs kärlet. Defasta och streckade pilarna visar det inre kärlväggen och ytterkanten av RBC kärna, respektive. (LWB & RWB: vänster och höger kärlväggen gränsen, LCB och RCB: vänster och höger RBC kärngräns) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:.. Image kontrastförstärkning med en optisk blått filter Bild histogram över gråskalebilder som erhållits utan (A) och med blått filter (B) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 4: RBC Kärna bredd som bestäms med hjälp av fem olika tröskel Algoritmer gränserna för RBC kärna och kärlväggen lagras på gråskalebilder i figur 3.. (Översta raden (A): utan blå filter, nedersta raden (B): med blått filter) med hjälp av (från vänster till höger) Otsu metod, minsta metod, intermode metod, iterativ urvalsmetod (Isodata) och fuzzy entropiska tröskel (Shanbhag). De heldragna och streckade linjer indikerar den inre kärlväggen och ytterkanten av RBC kärna, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fysisk Variation av CFL Bredd CFL bredder motsvarande fig 4B längs den vänstra (A).och höger (B) kärlväggar, respektive. (D: avståndet i kärldiameter) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Tröskelvärden och CFL Bredd Data i figur 5. * p <0,001: signifikant skillnad från Otsu metod. † p <0,001: signifikant skillnad från vänster. Statistiska analyser utfördes med användning av två-tailed oparade t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mätningen av CFL bredd är avgörande för en bättre förståelse av hemodynamiken i mikrocirkulationen. I synnerhet har mätning av CFL bredder utförts i mesenteriala 6, spinotrapezius 24 och cerebrala 25 microcirculations. Konventionell mätning av in vivo CFL bredder begränsades uppskattningar genom manuell inspektion av de inspelade videobilder. De manuella mätningar krävs medelvärdes av flera på varandra följande videoramar innan visuellt identifiera gränserna för RBC kärn- och kärlväggar 15,16. I en annan studie, fluoresceinisotiocyanat (FITC) -märkta röda blodkropparna och rodamin-B isothiocynate (RITC) märkt plasma användes för att bestämma de genomsnittliga CFL bredder katt cerebrala mikrokärl 25. Dessa tidigare mätmetoder är mycket tidskrävande och kräver ytterligare steg för fluorescensmärkning, vilket begränsar den rumsliga och tidsmässig upplösning av CFL width mätning. I kontrast, genom koppling av höghastighetskamerainspelningar till ett effektivt bildsegmentering och analys, den teknik som demonstreras här tillåter kvantifieringen av Spatiotemporal variationer av CFL med en rumsupplösning (0,42 ^ m) av en order som är mindre än storleken på en RBC och en tidsupplösning på 1/3000 sek.
Korrekt kirurgisk beredning av kremastermuskeln är kritisk för att bestämma riktigheten i breddmått CFL. I synnerhet, är väsentligt grundlig borttagning av intilliggande bindväv för att säkerställa en bra fokus av arteriolerna i kremastermuskeln. Dessutom är den tidsmässiga och rumsliga upplösningen av mätningen beroende av mikroskop och kamera specifikationer. Medan en högre förstoring mål kan öka den rumsliga upplösningen, det minskar synfältet, vilket i sin tur begränsar den uppnåbara kärllängden för att kvantifiera den rumsliga variationen av CFL bredd. Därför microscopic konfigurationer kan modifieras i enlighet med den specifika tillämpningen av tekniken.
Bild segmentering är en annan viktig faktor för riktigheten i breddmått CFL. Bland de olika tekniker som utvecklats, bildtröskel baserad på grå nivå histogram ger en enkel och effektiv metod för bildsegmentering och analys. Följaktligen är förgrundsobjekt heras från bakgrunden baserat på skillnaden i deras grånivåer. I det ideala fallet kommer bildhistogrammet vara bimodal och ett tröskelvärde vid botten av dalen är trivialt. Men in vivo experimentella bilder inte alltid uppvisar sådana gråskala nivå profiler. Våra resultat har visat hur bildkvaliteten och kontrasten kan påverka bildsegmenteringsprocessen. Användningen av ett optiskt blå filter förbättras avsevärt kontrasten mellan de röda blodkropparna och plasma i en arteriole (Figur 3), och det verkar vara viktigt när applying histogrammet baserade tröskling för CFL breddmätning oberoende av de algoritmer (Figur 4). Detta resulterar i en distinkt bimodal bildhistogrammet, som tillåter en att identifiera tröskelvärdet effektivt. Emellertid bör det noteras att även med en bimodal histogram som erhållits från bilderna in vivo, kan en extremt ojämn varians av två toppar (lokala maxima) och en bred dal (lokalt minimum) i histogrammet fortfarande påverka tröskelväljar (Tabell 1 ). Därför måste valet av en lämplig tröskelalgoritm som skall undersökas baseras på bildkvalitet och användarna måste ta hänsyn till de begränsningar som varje tröskelalgoritm för bästa lämplighet att kvantifiera CFL bredder.
Eftersom CFL bredder är till stor del beroende av flödesförhållanden, är viktigt kontinuerlig artärtryckmätning under hela experimentet. För att bestämma de lokala flödesförhållanden,den pseudoshear hastigheten hos blodflödet kan beräknas genom att mäta den genomsnittliga flödeshastigheten i blodkärlet 5.
Sammanfattningsvis har protokollen för den kirurgiska beredningen av en råtta kremastermuskeln och kvantitativ bildanalys som beskrivs här använts för att förvärva kvantitativ information om den dynamiska variationen av CFL bredder in vivo. De främsta utmaningarna i att säkerställa riktigheten i breddmått CFL inkluderar korrekt kirurgisk förberedelse av muskeln och bildsegmentering, som båda har behandlats ovan. Denna teknik kan lätt anpassas till andra mikrocirkulatoriska studier för att undersöka hemorheological och hemodynamiska aberrationer i olika fysiologiska och patologiska tillstånd. Följaktligen dessa fynd bidra till den framtida utvecklingen av mikrovaskulära behandlingsmetoder och klinisk intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
- Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
- Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
- Goldsmith, H. L.
- Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
- Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
- Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
- Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
- Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
- Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
- Maeda, N.
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
- Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
- Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L.
- Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
- Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
- Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
- Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).
