Protocol
この研究は、シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（承認されたプロトコルがない。R15-0225）によるものです。
動物モデルの1外科の準備
- 血管カニューレ挿入
- ケタミン（37.5 mg / mlで）および腹腔内を介して、キシラジン（5 mg / mlで）カクテル（IP）注射（2ミリリットル/ kg）でグラム - （7週齢6）（203±20）のオスのSprague-Dawleyラットを麻酔。針をリキャップまたは注射後に注射器からそれを削除しないでください。
- 動物は（爪先つまんで確認）、麻酔された後、37℃で、その体温を維持するために加温パッド上に置きます。そっと肩甲骨、前頸部、下腹部、内側後肢と陰嚢の毛を剃ります。ゆっくりと粘着紙テープを使用して足を拘束。
- 見ながら顕微解剖ハサミと角度のついたピンセットを使用して、すべての外科的処置を実行します実体顕微鏡。手術中にけがを防ぐために、パンク防止トレイ上のすべての鋭い手術器具を配置します。
- 切開を行う前に、すべての手術部位を交互にヨウ素、70％アルコールで3回スクラブ。 30 IU / mlのヘパリン - 食塩水溶液を持つすべてのカテーテルをフラッシュします。
- 右頸静脈の上に手術用ハサミを使用して、肩甲骨1.5センチ正中皮膚切開 - 1を加えます。頸静脈を露出させるために鈍的切開により筋膜を分離し、これをポリエチレンチューブ（PE-50）5-0絹縫合糸を用いて、ヘパリン生理食塩水で満たされてカニューレを挿入。補足麻酔を注入する際に必要な（1/3初期投与量の1/2に、静脈内（IV））手術と実験の過程を通して。
- 気道開存性を維持するために気管切開を行います。前頸部エリア1.5センチ切開 - 1を加えます。所定の位置にカテーテルを固定するために2-0絹縫合糸でポリエチレンチューブ（PE-205）を使用して、気管にカニューレを挿入。
- 血圧を測定します大腿動脈にカニュレーションを通じて。後肢の左内側面で1.5センチ切開 - 1を加えます。鈍的切開によって大腿動脈を分離します。ヘパリン生理食塩水は、5-0絹縫合糸を用いて充填したポリエチレンチューブ（PE-10）と大腿動脈にカニューレを挿入。
- 精巣挙筋の準備と流れの可視化
- それを拡張するために陰嚢の頂部を通って5-0絹縫合糸を挿入します。陰嚢の腹側表面に沿って切開を行います。露出した筋肉に、定期的に暖かい等張液（pH 7.4、37℃）を適用します。
- 慎重に周囲の結合組織を削除し、徹底的に綿棒を使用して。
- 精巣挙筋の頂点を通って5-0絹縫合糸を挿入します。同じ長さの2つのピースに縫合糸をカットし、それぞれの側に結び目を作ります。 2ノットの間の筋肉をカットし、静かに縫合糸を引っ張ることにより、カスタマイズされた透明なプレキシグラスのプラットフォームにそれを伸ばします。フィックスブルータックとプラットフォームへの縫合糸の終わり。
注：周囲の結合組織の徹底的な除去は、最適な画像コントラストを得る上で重要です。 - 5〜6凝視が行われるまで、ステップ1.2.3を繰り返します。慎重に高温焼灼を使用して、精巣上体から精巣挙筋を取り除きます。組織の脱水を防ぐために露出した筋肉に温かい等張液を表面かん流します。
- ガーゼの折り返し片と精巣挙筋を囲みます。ポリビニルフィルムで露出した筋肉をカバーしています。フィルムとガーゼ片は、水浸顕微鏡対物レンズ（ 図1A）のための温かい等張液を保持するために浅い盆地を形成しています。
- 生体顕微鏡（ 図1C）の動物ステージ上に動物を転送します。連続圧力監視（ 図1E）のための生理的データ収集システムに動脈カニュレーションを接続します。
- 筋肉temperatを維持動物のプラットフォーム（ 図1B）の下に取り付けられた発熱体と35℃でURE。加熱素子（ 図1D）のパワー・コントローラへの負のフィードバックを提供するために、筋肉の横に温度プローブを配置します。
- 環境と平衡に15分間のステージ上で動物を残します。
- 40X水浸対物レンズと長い作業冷却器を備えた生体顕微鏡で血液の流れを可視化します。
- 血管の直径平面上に顕微鏡を集中させるためにはRBCコア、CFLと血管壁との間に明確な映像のピントやコントラストに基づいて分岐していない細動脈を（<60μm）で、選択してください。垂直方向に血管壁を整列させるために、顕微鏡に取り付けたカメラを回転させます。
- 1秒間3,000 /秒のフレームレートの高速ビデオカメラを使用して血流を記録します。画像品質を維持するために、非圧縮8ビットグレースケールAVI形式として記録されたビデオを保存します。
注意： 3000フレーム/秒の最小記録フレームレートがCFLの測定は、生理的細動脈の流れの条件の下で少なくとも一回RBCあたりに実行できることを確認することをお勧めします。 - 赤血球と血漿との間のコントラストを高めるために、510 nmの - 310で394 nmおよびスペクトル帯域の波長でピーク透過と青色フィルタを使用してください。
注：光スペクトルは、微小光源（100 Wハロゲンランプ）からの青色フィルタを通過したことを確認し、任意の潜在的な組織の損傷を防止するために、低光強度です。 - 実験の最後に、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与により動物を安楽死させます。
2.画像解析
- CFL幅測定のための前処理
- MATLABを開き、「CFL_pre.m 'ファイルを実行します。 （これと他のMATLABファイルはで見つけることができますIP ">補足MATLABアーカイブ。）
- 分析するために、ビデオファイルを選択するには、「ファイルを開く」をクリックしてください。
- 垂直方向に血管壁を整列させるために「回転」スライダを調整します。
注：ユーザーは「グリッドオン]ラジオボタンを選択することで、血管の位置合わせのための補助グリッド線を表示し、「ズーム」スライダーをスライドさせることにより、画像のズームレベルを調整することができます。 - 血管の位置合わせを確認する「確認して編集」ボタンをクリックします。
- 関心領域（ROI）を定義する」に設定したROI作物へ」ボタンをクリックします。配置画像がポップアップウィンドウに表示されます。画像上に長方形の目標を調整し、二重のROIをクリックして確認します。画像のトリミングが必要とされない場合は、このステップをスキップします。
注：のみ容器からCFL幅を分析するためのROI内の単一の容器が含まれます。必要に応じて、元の形にイメージを復元するには、「リセットイメージ」ボタンをクリックします。 - クリック9; '（BMP'形式の連続したビットマップ画像の8ビットグレースケール）に、すべての編集されたビデオフレームを抽出するためにボタン 'イメージを抽出します。抽出された画像は、選択したビデオファイルと同じ名前のフォルダに格納されています。
- CFL幅の測定
- MATLABを開き、「CFL_measure.m 'ファイルを実行します。
- 抽出された画像を含むフォルダを選択するには、「[フォルダの選択]をクリックします。
- 画像を含むフォルダをクリックし、「フォルダの選択」をクリックします。フォルダ内の最初の画像フレームがロードされ、「画像のヒストグラム」パネルで、その灰色の強度ヒストグラムと一緒に、「グレースケール画像」パネルに表示されます。
- 分析を実行するために、リストボックスから所望の画像フレームを選択し、そうでなければ第1の画像フレームが選択されます。
- 位置で決定された画像で血管内壁を識別するために、「血管壁を探す」をクリックします暗いから2ピクセル以上の光に光強度プロファイルのピーク遷移します。
- 「塩、コショウ」ノイズを低減する画像にメディアンフィルタを適用するには、「メジアンフィルタ」を確認してください。
- 画像のコントラストを向上させるために、デジタル画像強度を調整する「自動コントラスト」を確認してください。
- τ（RBCコア）以下のグレーレベルでτ上記のグレーレベル（CFL）と白画素と黒画素 - 自動的に2つのクラスにグレイレベルを分割しきい値値（τ）を決定するリストボックスのしきい値アルゴリズムを選択します。
注：自動化された閾値処理アルゴリズムのいずれも適切な画像閾値化を提供しない場合は別の方法としては、手動のしきい値を使用します。 「マニュアル」のラジオボタンをクリックして、手動のしきい値の値を定義するには、スライダを調整します。 - 、CFL幅の空間的変化を測定する「ピクセル解像度」ボックス内のピクセル解像度（解像度を入力するにはこの実験で0.42ミクロン/ピクセル）でした。
- CFL幅の空間的な変化を得るために「計算」ボタンをクリックします。集計形式でCFL幅データをエクスポートするには、「書き出した.csv]をクリックします。
- 、血管に沿った特定の分析線でCFL幅の時間変化を測定する「時間変化]ラジオボタンをクリックして、フレームレート情報を入力します（この実験で使用されるフレームレートは3000フレーム/秒でした）。
- それぞれ、「フレームを起動 'と'最後のフレーム」ボックスに最初のフレームおよび分析のための画像の最後のフレームを入力します。
- 「分析ライン」のスライドバーをスライドさせることにより、血管に沿って分析線の位置を選択します。 「グレースケール画像」と「バイナリイメージ」の両方に示されている分析線の位置を確認してください。
- CFL幅の時間変化を取得するために「計算」をクリックしてください。 CLICKを表形式でCFL幅データをエクスポートするには、「エクスポートは.csvファイル」。
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Representative Results
in vivoでの CFLの可視化は、動物の外科的な準備に大きく依存しています。過度の失血または拡張手術時間は収差を衝撃や血流ために動物を供することができます。手術と実験中加熱パッドだけでなく、カスタマイズされたプラットフォームを使用して、組織の温度の維持はまた、ラットの生理学的条件を維持するために重要です。顕微鏡システム100 Wのハロゲンランプを使用して、識別可能な組織の損傷があっても、実験の終了時に観察されませんでした。
図2Aは、CFLがRBCコアと内側容器壁（ 図2C）との間で観察することができるラット精巣挙筋における非分枝動脈を介して典型的なRBCの流れを示しています。実験中のこれらの構成要素間の良好なコントラストがCFL幅測定の精度を確保するために重要です。画像解析の初期位相を含みます内側の血管壁を検出します。容器に垂直な分析線に沿った光強度分布を取得することにより、場所が暗いから遷移が2ピクセル（ 図2B）の上に点灯することをピークに近似されます。
赤血球及びCFLが異なる光透過率を有するように、グレーレベルの差は、2つのクラス（二値画像）に細分することができます。しかし、画像のヒストグラムの二つのピーク間の正確な閾値の同定は悪い画質とコントラスト（ 図3A）によって制限されてもよいです。赤血球とCFLの間のコントラストを向上させるために、青色フィルタ（ 図3B）を用いることができます。これは、RBCコアの境界をより正確に青色フィルタを用いて同定することができ、 図4にも明らかです。また、閾値アルゴリズム20〜23の選択は、CFLの幅（ 図の測定に影響を与えることができます4）。これは、異なる閾値処理アルゴリズムが順番に誤ったCFLの測定につながる可能性が識別された異なるRBCコア境界をもたらしたことを図4Aには明らかです。より良い図4BにおけるCFL幅測定の閾値アルゴリズムの影響を説明するために、異なる閾値アルゴリズムを使用して得られたCFL幅の空間プロファイルは、図5に示し、 表1にまとめます。
。 図1： 生体内顕微鏡システムと精巣挙筋の準備 A：外科的に体外ラットの精巣挙筋B：精巣挙筋を配置し、35℃Cで、その温度を維持するための加熱要素を備えたカスタマイズプラットフォーム：お客さまとの顕微鏡システム微小循環血液の可視化のためtomized動物段と高速度カメラは、精巣挙筋を流れるD：ネガティブフィードバック温度制御装置及び電源E：連続的な圧力監視のための生理学的データ収集システム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：細動脈におけるRBCの流れの典型的なグレースケール画像（血管径= 52μm）とB：分析線に沿った光強度プロファイル（パネルAの実線） 船舶壁の位置とCFL幅 A の決意のための画像処理 。C：血管に沿っCFL測定の代表的な結果。ザ実線及び破線の矢印は、RBCのコアの内側の血管壁と外側の縁を示します。 （LWB＆RWB：LCB＆RCB、血管壁の境界を左右：左右のRBCコア境界） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：光ブルーフィルタによる画像のコントラスト強調 （A）がなく、青色フィルタ（B）で得られたグレースケール画像の画像ヒストグラム。。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FigurE 4：RBCコア幅は、5つの異なるしきい値処理アルゴリズムを用いて決定図3のグレースケール画像に重畳されたRBCのコアと血管壁の境界を。。（トップの行（A）：青フィルタなし、下段（B）：ブルーフィルター付き）を使用して、大津の方法、最小法、インター法、反復選択方法（ISODATA）とファジィエントロピーしきい値（Shanbhag）（左から右へ）。固体と破線はそれぞれ、血管内壁とRBCコアの外縁を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：CFL幅の空間変動 CFL幅は左（A）に沿って図4Bを対応します。そして、右（B）血管壁、それぞれ。 （D：血管径の距離） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：図5. *のP <0.001 でのしきい値のとCFL幅データ ：大津の方法から有意な差。 †P <0.001：左から有意な差。統計分析は、両側不対t検定を用いて行きました。
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Discussion
CFL幅の測定は、微小循環における血行動態のより良い理解のために不可欠です。具体的には、CFL幅の測定は腸間膜6で行われた、24および脳25微小循環をspinotrapezius。 in vivoでの CFL幅の従来の測定は、記録されたビデオフレームの手動検査によって推定に制限されていました。マニュアル測定は、視覚的にRBCコアと血管壁15,16の境界を特定する前に、いくつかの連続するビデオフレームの平均化を必要としました。別の研究では、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、赤血球及びローダミンBイソチオシアネート（RITC）はプラズマがネコ脳微小血管25の平均CFL幅を決定するために使用された標識-標識。これらの以前の測定方法は非常に時間がかかり、CFLのwiの空間分解能と時間分解能を制限する蛍光標識のための追加の手順が必要ですDTH測定。対照的に、効果的な画像セグメント化及び分析に高速度カメラの記録を結合することによって、技術はここで実証RBCの大きさよりも小さいオーダーの空間分解能（0.42ミクロン）でCFLの時空間変動の定量化を可能にし1/3000秒の時間分解能。
精巣挙筋の適切な外科的な準備がCFL幅測定の精度を決定する上で非常に重要です。具体的には、隣接する結合組織の徹底的な除去は、精巣挙筋における細動脈の良好なフォーカスを確保することが不可欠です。また、測定の時間と空間分解能は、顕微鏡とカメラの仕様に依存しています。高倍率の対物レンズは、空間分解能を向上させることができるが、それは順番にCFL幅の空間的変化を定量化するために得られる容器の長さを制限する視野を減少させます。したがって、microscopiCの構成は、技術の特定の用途に応じて変更することができます。
画像分割は、CFL幅測定の精度のための別の重要な要因です。開発した様々な技術の中でも、グレーレベルのヒストグラムに基づいて画像しきい値は、画像分割および分析のためのシンプルで効果的なアプローチを提供します。したがって、前景オブジェクトは、それらのグレーレベルの差に基づいて背景から抽出されます。理想的なケースでは、画像のヒストグラムが双峰性になり、谷の底部の閾値は自明です。しかし、in vivoでの実験画像は常に、このような階調プロファイルを示しません。我々の結果は、画像品質及びコントラスト画像分割プロセスに影響を与えることができる方法を示しています。光学青色フィルタの使用が大幅に赤血球および細動脈における血漿（ 図3）との間のコントラストを高め、そして時applyinことが不可欠であると思われます関係なく、アルゴリズムのCFL幅測定のためのグラムヒストグラムベースの閾値処理（ 図4）。これは、1つは、効果的に閾値を識別することを可能にする明確な二峰性、画像ヒストグラムをもたらします。しかし、それも、in vivoでの画像から得られた二峰性のヒストグラムを用いて、二つのピーク（極大値）の非常に不等分散ヒストグラムの広い谷（極小）が依然として閾値選択（ 表1に影響を与えることができることに留意すべきです）。したがって、適切な閾値化アルゴリズムの選択は、画像品質とユーザーに基づいて検討する必要があるCFL幅を定量化することで最高の適合性について、それぞれ閾値処理アルゴリズムの限界を考慮しなければなりません。
CFL幅がフロー条件に大きく依存しているように、実験の過程を通して連続的な動脈圧の測定が不可欠です。局所的な流れの状況を決定するために、血流のpseudoshearレートは血管5の平均流速を測定することによって計算することができます。
要約すると、ここで説明したラット精巣挙筋および定量的画像解析の外科的調製のためのプロトコールは、in vivoでの CFL幅の動的変化に関する定量的情報を取得するために利用されています。 CFL幅測定の精度を確保する上で主要な課題は、上記の対処されているどちらも筋肉や画像セグメンテーション、の適切な外科的な準備が含まれています。この技術は、容易に様々な生理学的および病理学的条件の血液レオロジー及び血行力学的異常を調査するために、他の微小循環の研究に適用することができます。したがって、これらの知見は、微小血管の治療アプローチと臨床的介入の将来の発展に貢献しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
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