Abstract
Tecniche Microendoscopy fibra fascio recenti consentono l'analisi non invasiva dei tessuti in vivo, utilizzando sia tecniche di imaging o una combinazione di tecniche di spettroscopia. La combinazione di tecniche di imaging e la spettroscopia in un unico sensore ottico può fornire una più completa analisi di salute del tessuto. In questo articolo, due modalità dissimili sono combinati, immagini ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy e la spettroscopia di riflettanza diffusa, in un unico sonda ottica. Ad alta risoluzione imaging di fluorescenza microendoscopy è una tecnica utilizzata per visualizzare tessuto apicale micro-architettura e, anche se principalmente una tecnica qualitativa, ha dimostrato differenziazione efficace in tempo reale tra tessuto neoplastico e non neoplastico. spettroscopia di riflettanza diffusa è una tecnica che può estrarre tessuto di parametri fisiologici concentrazione locale di emoglobina, la concentrazione di melanina, e la saturazione di ossigeno. Questo articolo descrive le specifiche r, facoltativo per costruire la sonda a fibre ottiche, come costruire la strumentazione, e quindi dimostra la tecnica su pelle umana in vivo. Questo lavoro ha rivelato che il tessuto micro-architettura, cheratinociti della pelle in particolare apicali, può essere co-registrato con i suoi parametri fisiologici associati. La sonda strumentazione e fibra fascio qui presentata può essere ottimizzato come dispositivo palmare o endoscopicamente compatibile per l'uso in una varietà di sistemi di organi. ricerca clinica supplementare è necessaria per verificare la fattibilità di questa tecnica per i diversi stati di malattia epiteliali.
Introduction
Tecniche Microendoscopy fibra fascio di solito analizzano nel tessuto vivo utilizzando sia tecniche di imaging o una combinazione di tecniche di spettroscopia. 1-3 Una di queste tecniche di imaging ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy, può immagine del tessuto apicale micro-architettura con una risoluzione sub-cellulare in un piccolo , microscala campo di vista, utilizzando un mezzo di contrasto topico come proflavina, fluoresceina, o inchiostro pyranine. 1,3-11 Questa modalità di imaging ha mostrato promettenti prestazioni cliniche in qualitativamente differenziare tessuto epiteliale malati e sani in tempo reale con basso inter-osservatore variabilità. 8 di tanto in tanto, gli investigatori potranno utilizzare i dati di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione per estrarre le caratteristiche quantitative, come cellule e la dimensione nucleare o l'area della ghiandola, ma questa rimane una tecnica essenzialmente qualitativa mirata verso la visualizzazione morfologia del tessuto. 1,3,8- 10 D'altra parte, tecniche di spettroscopia, talecome spettroscopia di riflettanza diffusa, sono mirati a fornire informazioni tessuti funzionali e hanno mostrato promettenti prestazioni cliniche per identificare quantitativamente lesioni cancerose in più organi. 2,12-15
Pertanto, vi è una necessità di un dispositivo che incorpora entrambi i tipi di modalità per potenzialmente ridurre ulteriormente la variabilità inter-osservatore, mantenere visualizzazione in tempo reale del tessuto micro-architettura e fornire un'analisi più completa di salute del tessuto. Per raggiungere questo obiettivo, uno strumento basato sonda multimodale è stato costruito, che combina due modalità di una sonda singola fibra ottica:. Ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy e la spettroscopia di riflettanza sub-diffusa 11 Questo metodo co-registri qualitativi immagini ad alta risoluzione di apicale morfologia del tessuto (proprietà strutturali) con informazioni quantitative spettrale (proprietà funzionali) da due profondità dei tessuti distinti tra cui concentrazione di emoglobina locale ([Hb]), la concentrazione di melanina ([Mel]), e la saturazione di ossigeno (SaO2). 11,12,16 Questo specifico sub-diffusa spettroscopia di riflettanza modalità utilizza due separazioni sorgente-detector (SDS) per assaggiare due profondità dei tessuti unici a fornire un quadro più completo della salute dei tessuti campionando fino alla membrana basale e stroma tessuto sottostante. 11
La fibra-sonda comprende a 1 mm di diametro della fibra centrale immagine con elementi circa 50.000 4,5 micron fibre di diametro, un diametro rivestimento di 1,1 mm ed un diametro complessivo di rivestimento di 1,2 mm. La fibra immagine è circondata da cinque 200 micron di diametro fibre con diametro di rivestimento di 220 micron. Ogni fibra 200 micron multimodale si trova una distanza da centro a centro di 864 micron dal centro della fibra dell'immagine. Ciascuno dei 200 micron fibre multimodali sono 25 °. Utilizzando la sinistra 200 micron fibra multimodale come la fibra "source", e l'ulteriore three 200 micron fibre multimodali come le fibre "collection", questa geometria necessariamente crea tre da centro a centro SDS di 374 micron, 730 micron, 1.051 micron e 1.323 micron. Le punte di fibre sono racchiusi in un involucro metallico cilindrico che mantiene le distanze tra fibre costante. Il diametro della carcassa cilindrica metallica è di 3 mm. L'estremità distale (verso la punta della sonda in fibra ottica) della sonda in fibra ottica è lungo 2 piedi. La sonda separa poi nei sei rispettive fibre individuali all'estremità prossimale (verso la strumentazione) che è lungo un ulteriore 2 piedi, per una lunghezza totale di 4 piedi. La Figura 1 mostra una rappresentazione della sonda in fibra ottica.
Figura 1:. Il design della sonda a fibre ottiche La sonda in fibra ottica è costituito da un 1 mm di diametro della fibra di immagine e quattro 200 micron fibre multimodali. Questofigura mostra rappresentazioni di (a) il terminale metallico che vincola la geometria delle fibre sulla punta della sonda per produrre SDS di 374, 730 e 1.051 micron rispetto alla sinistra 200 fibre micron multimodale (Scala bar ≈ 1 mm), (b) le fibre essendo vincolato all'interno del tappo di metallo, mostrando i nuclei delle fibre, rivestimento della fibra, e rivestimento in fibra (Scala bar ≈ 1 mm), (c) la poliammide guaina protettiva attorno alle fibre (Scala bar ≈ 1 mm), (d ) la punta distale finale della sonda, con l'impugnatura in metallo e cavo nero unico che contiene tutte le fibre (Scala bar ≈ 4 mm), e (e) un quadro della punta distale della sonda (Scala bar ≈ 4 mm). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questa strumentazione multimodale e Techni associatiQue è la prima combinazione di queste modalità all'interno di una singola sonda, anche se esistono altre tecniche combinate strutturali / funzionali che combinano diverse modalità. Ad esempio, l'imaging iperspettrale combina immagini a grande campo con emoglobina e melanina proprietà quantitative, 17,18 e altre tecniche sono state sviluppate che uniscono la tomografia a coerenza ottica (OCT) con l'analisi dell'espressione delle proteine dei tessuti, 19 solo per citarne alcuni. Questo articolo riferisce di una configurazione strumentazione compatta e facile da implementare che utilizza una sonda generale fibra ottica che può essere ottimizzato per vari scopi compreso l'uso endoscopico nel tratto gastrointestinale inferiore e dell'esofago o come sonda portatile per l'uso nella cavità orale e il posizionamento della pelle esterna. 11,20
L'hardware di questo strumentazione richiede sia l'acquisizione di dati personalizzati e il codice di post-elaborazione per l'acquisizione diffusa spettri di riflettanza e quindi estrarre il volum risultantetessuto parametri fisiologici e-media, tra cui [Hb], [Mel], e São 2. Il codice di acquisizione dati personalizzati è stato costruito per permettere l'acquisizione simultanea da una telecamera (per alta risoluzione microscopia a fluorescenza) e uno spettrometro (per la spettroscopia di riflettanza diffusa). I driver sono spesso disponibili dai siti web dei produttori per consentire l'integrazione con una varietà di linguaggi di programmazione. Il codice di post-elaborazione personalizzato importa un valori di assorbimento a priori in vivo [Hb] e [Mel] 21 e quindi utilizza un attacco di processo di ottimizzazione non lineare precedentemente sviluppato che crea una curva montato degli spettri. 22 La curva a muro è costruito riducendo al minimo la χ 2 valore tra se stesso e gli spettri crudo e la determinazione dei parametri fisiologici dei tessuti ([Hb], [Mel], e Sao 2) dalla curva arredata e con il più basso χ 2 valore. 22 il codice può essere modificato per includereassorbimento da altri cromofori così, come l'inchiostro pyranine esogeno qui utilizzato, in modo che bersaglio parametri fisiologici sono inalterati.
Indicatori fisiologici di salute dei tessuti, come ad esempio [Hb], [Mel], e São 2, possono essere usati come segnalazioni di risposta del tumore alla terapia o come indicatori di vascolarizzazione locale e l'angiogenesi. 14,23 Compresa una ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy modalità aiuta il posizionamento della sonda guida e fornisce gli investigatori con un quadro più completo della relazione tra struttura del tessuto epiteliale e la funzione. In questo articolo, la costruzione e l'applicazione del microendoscope multimodale è descritto. 11
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Protocol
approvazione Institutional Review Board (IRB # 15-09-149) è stato ottenuto dal programma di soggetti di ricerca umana presso l'Università di Arkansas per tutti gli aspetti di questo studio. I metodi descritti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate, e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti.
1. Assemblea della ad alta risoluzione fluorescenza Microendoscopy Modalità
Nota: La procedura descritta per il montaggio della fluorescenza ad alta risoluzione microendoscopy modalità possono essere visualizzati in figura 2.
- Posizionare un 470 nm Dichroic specchio all'interno di un cubo gabbia 30 mm.
- Ottenere un cubo gabbia 30 mm e rimuovere montare il filtro dicroico.
- Collocare uno specchio dicroico 470 nm nel filtro dicroico di montaggio.
- Re-inserire e fissare montare il filtro dicroico indietro all'interno del cubo gabbia.
- Fissare l'assemblea della gabbia Canne al cubo gabbia 30 mm.
- Sicuroquattro aste di montaggio gabbia 1,5 pollici nella parte anteriore del cubo gabbia.
- Fissare quattro aste di montaggio della gabbia 3,0 pollici sul lato destro del cubo gabbia.
- Sicuro due aste di montaggio gabbia 2,0 pollici diagonalmente sul lato sinistro del cubo gabbia.
- Costruire un / Lens Sistema delle tubazioni Cage Plate.
- Ottenere un filettata della gabbia 1,0 pollici 30 mm e collegare un anello di ritegno libera sollecitazioni all'interno della piastra gabbia utilizzando la filettatura fornito.
- Vite in un tubo lente 1,0 pollici per l'anello di sicurezza senza stress.
- Fissare un secondo 1,0 pollici filettato 30 mm piastra gabbia al tubo obiettivo 1,0 pollici e regolare gli anelli di ritenuta standard in modo che le due piastre gabbia sono a filo.
- Far scorrere il / lente Sistema delle tubazioni 1.0 pollici gabbia piastra sul lato sinistro del cubo gabbia 30 mm.
- Costruire montare lo specchio ad angolo retto assemblaggio.
- Ottenere uno specchio ad angolo retto di montaggio e uno specchio in alluminio 1,0 pollici UV-enhanced.
- Posizionare il inc 1.0h UV-enhanced specchio di alluminio nello specchio di montaggio e stringere.
- Fissare quattro aste di montaggio gabbia 2.0 pollici per la parte anteriore del supporto specchi
- Sicuro due aste di montaggio gabbia 2,0 pollici diagonale sul lato destro del cubo gabbia.
- Collegare montare lo specchio ad angolo retto assemblaggio sul lato sinistro del gruppo del tubo della gabbia 1,0 pollici / obiettivo mettendo le aste di montaggio della gabbia opposte attraverso le rispettive aperture della piastra gabbia di 30 mm.
- Supporto del filetto di traduzione asse z attraverso le aste di montaggio della gabbia 3,0 pollici sul lato destro del gruppo.
- Fissare un obiettivo obiettivo acromatico 10 volte alla traduzione asse z di montaggio.
- Costruire gruppo di montaggio di una lente di traduzione 1.0 pollici piastra adattatore fibra / XY.
- Ottenere traduzione xy-asse di montaggio e di una piastra di adattamento in fibra di 1.0 pollici.
- Fissare la piastra di adattamento in fibra di 1.0 pollici nella lente di traduzione xy-asse di montaggio.
- Far scorrere tegli lente Traduzione adattatore / xy-all'asse della fibra 1,0 pollici montare assemblaggio di fronte alla lente dell'obiettivo.
- Ottenere due, tubi lunghi 0,5 pollici 1,0 pollici lente di diametro, uno 440/40 nm banda passante del filtro (filtro di eccitazione) e un 525/36 nm filtro passa-banda (filtro per le emissioni).
- Posizionare ogni filtro all'interno lungo 0,5 pollici, tubo lente di diametro 1,0 pollici, in modo che la freccia all'esterno del filtro sia rivolto verso il lato del tubo lente con le filettature esterne.
- Fissare i filtri per l'assemblaggio.
- Ottenere due anelli di fissaggio standard.
- Fissare i filtri all'interno dei lunghi 0,5 pollici, tubi lente di diametro 1.0 pollici con gli anelli di tenuta standard.
- Avvitare il tubo obiettivo con il filtro di eccitazione alla parte anteriore del cubo gabbia di 30 mm e avvitare il tubo obiettivo con il filtro per le emissioni allo specchio angolo retto montaggio.
- Avvitare il tubo obiettivo 0,5 pollici con il filtro per le emissioni al fronte allo specchio ad angolo retto montaggio.
- otten due 1.0 pollici filettato piastre gabbia 30 mm e metterli davanti tubi lungo 0,5 pollici, lenti diametro di 1,0 pollici contenenti filtri.
- Utilizzando epossidica o forte adesivo, allegare 455 nm LED alla piastra gabbia collegato al filtro di eccitazione.
- Ottenere uno, 1.0 pollici tubo lungo 0,5 pollici lente di diametro e una lente del tubo doppietto acromatico 1,0 pollici di lunghezza focale di 50 mm.
- Posizionare la lente del tubo all'interno del tubo obiettivo tale che la freccia sulla parte esterna della lente è rivolta verso il lato del tubo lente con le filettature esterne.
- Avvitare la lente del tubo per il montaggio.
- Ottenere un anello di sicurezza standard.
- Fissare la lente all'interno del tubo lente di diametro lungo 0,5 pollici 1,0 pollici con l'anello di sicurezza standard.
- Fissare il tubo obiettivo con la lente del tubo alla piastra gabbia più a sinistra.
- Collocare una piastra gabbia di 30 mm davanti al, 1,0 pollici tubo lente di diametro lungo 0,5 pollici, contenente la lente del tubo.
- Collegare un libero anello di ritegno sollecitazioni all'interno della piastra della gabbia 30 mm.
- Fissare una macchina fotografica in bianco e nero USB alla piastra gabbia con l'anello di tenuta libera lo stress.
- Costruire i dispositivi di montaggio posta ottici.
- Ottenere quattro titolari 0,5 pollici postali, quattro posti ottici 0,5 pollici, e quattro basi di montaggio.
- Fissare i messaggi ottici 0,5 pollici all'interno dei post holder 0,5 pollici.
- Fissare i Post Holders 0,5 pollici sulle basi di montaggio.
- Vite nei dispositivi di montaggio quattro postali ottica ai fori situati sotto il cubo gabbia 30 mm, montare lo specchio ad angolo retto, la piastra della gabbia collegato al LED, e la piastra della gabbia collegato alla telecamera.
- Avvitare il quattro post ottica dispositivi sia ad un tagliere ottica o una tabella ottica di montaggio per terminare la costruzione della fluorescenza ad alta risoluzione microendoscopy modalità.
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Figura 2:. Montaggio del ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy modalità La modalità ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy può essere costruito con la costruzione di un guscio di componenti di diametro di dimensioni 1,0 pollici, con particolare cura nel maneggiare lo specchio dicroico, lente dell'obiettivo, di eccitazione / filtri di emissione e lente del tubo. Superfici vetrate di queste componenti devono essere maneggiati con cura utilizzando carta per lenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2. Assemblea della Sotto-riflettanza diffusa Spettroscopia Modalità
Nota: La procedura descritta per il montaggio della modalità spettroscopia di riflettanza diffusa sub-possono essere visualizzati in figura 3.
- Ottenere una sorgente di luce alogena e, utilizzando resina epossidica o un forte adesivo, fissare un threade 1.0 polliciD 30 mm Piastra gabbia sulla parte anteriore.
- Fissare quattro aste di montaggio gabbia 3.0 pollici alla piastra gabbia.
- Fissare un supporto di traduzione asse z per le aste di montaggio gabbia.
- Avvitare una acromatica lente obiettivo 20X alla traduzione asse z montaggio.
- Costruire gruppo di montaggio di una lente di traduzione piastra adattatore fibra / XY.
- Ottenere traduzione xy-asse di montaggio e di una piastra di adattamento in fibra di 1.0 pollici.
- Fissare la piastra di adattamento fibra nella lente di traduzione xy-asse di montaggio.
- Far scorrere montare l'adattatore 1,0 pollici fibra / xy-traduzione assemblaggio di fronte alla lente dell'obiettivo.
- Costruire il gruppo del braccio del motore.
- Ottenere l'alluminio braccio di motore su misura e una piastra di adattamento SMA fibra.
- Avvitare la piastra di adattatore di fibra (con filettatura esterna) nel braccio motore in alluminio (con filettatura interna).
- Collegare l'adattatore in alluminio braccio di motore su misura al braccio motore con quattro # 4-40 0,5. Viti.
- Costruire il gruppo di alloggiamento del braccio / motore / motore.
- Ottenere il corpo motore in alluminio su misura e il motore passo-passo 400.
- Allineare i fori delle viti sul motore passo-passo e l'alloggiamento del motore e quindi fissare con quattro viti # 4-40 0,5 pollici.
- Feed sull'asta motore rotante del motore passo-passo attraverso l'apertura del gruppo braccio motore e serrare la vite di bloccaggio sull'adattatore braccio motore in alluminio.
- Crea il gruppo interruttore ottico.
- Ottenere l'interruttore ottico in alluminio su misura e tre piastre di adattamento in fibra di 1.0 pollici.
- Infilare le piastre di adattamento nei fori filettati del commutatore ottico.
- Fissare l'alluminio interruttore ottico faccia piastra su misura sul commutatore ottico con quattro viti # 4-40 0,5 pollici.
- Attaccare il gruppo di alloggiamento del braccio / motore / motore commutatore ottico alimentando sull'asta motore rotante del motore passo-passo attraverso il foro centrale del tegli interruttore ottico.
- Ottenere un circuito elettrico e driver del motore passo-passo, e quindi inserire il driver del motore passo-passo attraverso la scanalatura centrale della basetta.
- Osservare lo schema di collegamento elettrico (Figura 3, 2.12) per il driver del motore passo-passo, alimentazione 12 V e motore passo-passo.
- Collegare il driver del motore passo-passo, 12 V alimentazione, e del motore passo-passo come specificato nello schema elettrico (Figura 3, 2.12) per completare la costruzione del commutatore ottico motorizzato.
- Avvitare la componenti switch e fonte di luce alogena ottica a un tagliere ottica o un tavolo ottico vicino alla precedenza costruito (Figura 2, 1.24) ad alta risoluzione assemblaggio di fluorescenza microendoscopy.
- Attaccare un'estremità di un 550 micron, 0,22 NA cavo patch alla piastra dell'adattatore fibra 1.0 pollici del gruppo braccio motore.
- Attaccare l'altra estremità del 550 micron, 0,22 NA cavo patch alla fibra collegareo dello spettrometro USB.
- Avvitare le cinque cavi delle sonde distali alle rispettive piastre di adattamento in fibra di 1.0 pollici sulla strumentazione per completare il completamento del imaging ad alta risoluzione multimodale e sub-diffusa spettroscopia di riflettanza fibra fascio microendoscope.
- Avvitare il cavo a fibre immagine 1 mm di diametro al centro della piastra dell'adattatore fibra 1,0 pollici indicato nel passaggio 1.9.2.
- Avvitare il cavo in fibra multimodale 200 micron sinistra alla piastra dell'adattatore fibra 1,0 pollici indicato nel passaggio 2.6.
- Avvitare il cavo di fibra multimodale 2 ° 200 micron alla sinistra adattatore fibra 1.0 pollici attaccato alla lampada al tungsteno-alogena di cui al punto 2.9.2.
- Avvitare il cavo di fibra multimodale 200 micron 3 al 1,0 pollici piastra di adattamento fibra centrale di cui al punto 2.9.2.
- Avvitare il cavo di fibra multimodale 4 ° 200 micron al 1,0 pollici piastra di adattamento fibra più a destra di cui al punto 2.9.2.
Figura 3:. Il montaggio della modalità spettroscopia di riflettanza sub-diffusa Il sub-diffusa modalità spettroscopia di riflettanza può essere costruito utilizzando una lampada alogena al tungsteno base accoppiato ad una lente obiettivo per focalizzare la luce attraverso il 200 micron fibra multimodale consegna, e uno spettrometro. Inoltre, un commutatore ottico motorizzato su misura può essere costruita entro il percorso lampada-fibra-spettrometro per passare da una SDS. Gli investigatori che utilizzano più spettrometri di acquisire da più SDS può ignorare la componente interruttore ottico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.3. La calibrazione del sub-riflettanza diffusa Spettroscopia Modalità
Nota: Il fopo passi (sezione 3) devono essere completati prima della raccolta dati spettrali (sezione 4).
- Accendere tutti i componenti della strumentazione, compreso il LED 455 nm, lampada alogena al tungsteno a banda larga, fotocamera CMOS, spettrometro USB, motore passo-passo e scheda di controllo del motore. Assicurarsi che il pulsante di scatto sulla lampada al tungsteno-alogena è aperto.
- Spegnere tutte luce ambientale.
- Aprire il software di acquisizione dati personalizzati.
- Mantenere apparecchiature funzionanti per 30 min per la lampada raggiungere una temperatura e per il rumore intrinseco dal spettrometro per stabilizzare.
- Posizionare un campione di riflessione diffusa del 20% all'interno dell'apertura inferiore della calibrazione stampata 3D dispositivo standard di misura.
- Posizionare la sonda in fibra ottica all'interno della sinistra scanalatura del costume, 3D stampato fibra titolare, mostrato nella Figura 4. Lo slot più a sinistra fissa la distanza perpendicolare dalla punta della sonda a fibre ottiche per il campione di riflessione al 2,1 mm, che è il operazionedistanza timum in cui il segnale raggiunge lo spettrometro è massimizzato per i primi SDS di 374 micron.
- Regolare l'interruttore ottico motorizzato nella posizione più a sinistra in modo che lo spettrometro è collegato ai primi SDS di 374 micron.
- Impostare il tempo di integrazione per 500 msec. Questo tempo di integrazione deve essere scelto per non saturare il spettrometro ma mantenere un tempo di integrazione praticamente bassa.
- Acquisire uno spettro, R max, 374μm, cliccando su "Acquisire Spectrum" nel software.
- Chiudere l'otturatore della lampada al tungsteno-alogeno e registrare uno spettro, R scuro, 374μm, del rumore di fondo, facendo clic su "Acquisire Spectrum" nel software. Una volta acquisito, aprire l'otturatore, ancora una volta.
- Posizionare la sonda in fibra ottica all'interno slot più a destra del costume, 3D stampato fibra titolare, mostrato nella Figura 4. Lo slot più a destra fissa la distanza perpendicolare dalla fibra-oPTIC punta della sonda al campione di riflessione al 3,9 mm, che è la distanza ottimale in cui il segnale raggiunge lo spettrometro è massimizzato per la seconda SDS di 730 micron.
- Regolare l'interruttore ottico motorizzato in posizione centrale in modo che lo spettrometro è collegato alle seconde SDS di 730 micron.
- Acquisire uno spettro, R max, 730μm, cliccando su "Acquisire Spectrum" nel software.
- Chiudere l'otturatore della lampada al tungsteno-alogeno e registrare uno spettro, R scuro, 730μm, del rumore di fondo, facendo clic su "Acquisire Spectrum" nel software.
- Aprire l'otturatore, ancora una volta.
Figura 4:. Calibrazione della modalità spettroscopia di riflettanza diffusa sub-Per la calibrazione pre-sperimentale, la punta della sonda a fibre ottiche deve essere collocato in diversidistanze perpendicolari dallo standard riflettanza diffusa 20% a seconda della SDS. Per ottenere sempre queste distanze perpendicolari attraverso tutti gli esperimenti, un dispositivo standard di calibrazione creata (sezione trasversale del dispositivo mostrato in (a)) per tenere la sonda a distanze esatte dal campione di riflessione diffusa del 20%. In questa specifica configurazione sonda in fibra ottica, la luce dalla lampada al tungsteno-alogeno è mostrato tramite l'interruttore ottico alla fonte-rivelatore separazioni di (b) 374 um e (c) 730 micron (con motore e motore braccio rimossa dal percorso ottico per chiarezza). Distanze di (d) 2.1 mm per il 374 micron SDS, e (e) 3,9 mm per i 730 micron SDS sono necessari per la calibrazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.4. In Vivo dati Acquisition e proprietà ottica Estrazione da Pelle umana
In questa sezione, la tecnica microendoscope multimodale sarà dimostrato sulla pelle umana in vivo.
- Aprire il software di acquisizione dati personalizzato e regolare il tempo di integrazione spettrometro cliccando "Integration Time" e impostare in modo che è la stessa durante la calibrazione, che era di 500 msec in questo caso (passo 3.8).
- Determinare l'area della pelle in cui acquisire i dati, che possono differire sull'applicazione del ricercatore. In questo caso, la pelle sottile dell'avambraccio è stato scelto come dimostrazione.
- Se l'area pelle contiene i capelli, rimuovere i capelli con un rasoio monouso sterile.
- Ottenere un evidenziatore giallo standard, che contiene inchiostro pyranine, e leggermente segnare la zona della pelle prescelta.
- Accendere il LED 455 nm e chiudere l'otturatore per la lampada alogena.
- Posizionare la sonda in dolce contatto con la pelle.
- Spostare la sonda unrotonda sulla zona macchiata di tessuto per visualizzare un feed dal vivo ad alta risoluzione di architettura cheratinociti apicale sulla finestra di visualizzazione del software.
- Selezionare un tempo di esposizione appropriata e il guadagno, 150 msec e 10 dB di guadagno in questo caso, al fine di evitare la saturazione delle immagini, cliccando su "Tempo di esposizione" e "guadagno", digitando i valori appropriati, e facendo clic su "Applica impostazioni" nel software interfaccia.
- Acquisire un'immagine cliccando su "Acquisisci immagine" nell'interfaccia software.
- Pur mantenendo la sonda nello stesso sito di immagini, spegnere il LED 455 nm e aprire l'otturatore alla lampada alogena.
- Regolare l'interruttore ottico motorizzato alla posizione sinistra tale che lo spettrometro è collegato alle seconde SDS di 374 micron.
- Acquisire spettri, tessuti R, 374μm, cliccando su "Acquisire Spectra" nell'interfaccia software.
- Regolare l'interruttore ottico motorizzato in posizione centrale tali °Allo spettrometro è collegato al secondo SDS di 730 micron.
- Acquisire spettri, tessuti R, 730μm, cliccando su "Acquisire Spectra" nell'interfaccia software.
- Aprire il software di post-elaborazione personalizzata.
- Eseguire il software di post-processing facendo clic su "Esegui" e selezionare l'immagine di fluorescenza ad alta risoluzione, quattro spettri di calibrazione, e le due in vivo spettri dalla cartella in cui i dati sono stati salvati quando richiesto dal software.
NOTA: Il software personalizzato ottiene la vera riflessione assoluto (R abs, 374μm e R abs, 730μm) utilizzando le seguenti equazioni.
Il codice di post-elaborazione, come precedentemente descritto, calcola una curva adattata agli spettri di riflettanza diffusa (equazioni 1 e 2) e poi determines tessuto di parametri fisiologici ([Hb], [Mel], e Sao 2). 11,22,24
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Representative Results
A seguito di questo protocollo, l'investigatore otterrà un'immagine a fuoco ad alta risoluzione del sito tissutale con il pieno campo di vista (figura 5). Lineamenti di cellule possono essere visti se macchiato di inchiostro pyranine da un evidenziatore giallo di serie, mentre i singoli nuclei delle cellule può essere visto se macchiato con un colorante, come proflavina. Dopo l'acquisizione spettrale, il software di post-elaborazione utilizza una conoscenza a priori in vivo concentrazione di emoglobina ([Hb]) e le concentrazioni di melanina ([Mel]) 21 per adattare gli spettri di riflettanza sub-diffusa e determinare i valori di [Hb], [Mel ], e il tessuto saturazione di ossigeno (SaO2) come mostrato in Figura 5. Il software di post-elaborazione utilizza ampi limiti fisiologici ([Hb] = 0-150 mg / ml, [Mel] = 0-30 mg / ml, e SaO 2 = 0-100%) per adattare gli spettri calibrato. 21
Figura 5:. Co-registrazione dei dati qualitativi e quantitativi in vivo pelle umana normale e un Nevo melanocitico benigno Un'immagine a fluorescenza ad alta risoluzione è stata acquisita da un pyranine-ink (da un evidenziatore giallo standard) macchiato benigna nevo melanocitico e la pelle normale adiacente tessuto con un tempo di esposizione di 150 msec. Lineamenti di cheratinociti possono sono chiaramente visibili in entrambe le immagini. Il sito tessuto cutaneo normale e Nevo melanocitico avevano concentrazioni di emoglobina di 1,63 e 0,86 mg / ml, concentrazioni di melanina di 0,78 e 10,20 mg / ml, rispettivamente con simili saturazioni di ossigeno del 99%. Questa cifra dimostra il vantaggio di co-registrazione qualitativa informazioni funzionali strutturali e quantitative. Clicca qui per visualizzare un vers più grandiione di questa figura.
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Discussion
L'imaging ad alta risoluzione multimodale e sub-diffusa microendoscope fibra fascio di spettroscopia di riflettanza riportato qui possono essere ottimizzati e utilizzati dagli investigatori per una varietà di applicazioni, tra cui endoscopica o l'uso palmare per studi umani o animali. Esso fornisce quindi un metodo flessibile per la visualizzazione in vivo apicale del tessuto micro-architettura insieme a misure della concentrazione di emoglobina, la concentrazione di melanina, e la saturazione di ossigeno dei tessuti provenienti da due diverse profondità dei tessuti. Questo articolo descrive le specifiche della sonda a fibre ottiche, ha delineato un protocollo per il montaggio del sistema di imaging ad alta risoluzione e sistema di imaging riflettanza sub-diffusa, e mostrato la sua applicazione nei tessuti umani in vivo, usando l'inchiostro pyranine come mezzo di contrasto fluorescente per visualizzazione dei tessuti. Altri inchiostri, come proflavina o fluoresceina, possono essere utilizzati al posto di inchiostro pyranine con l'approvazione appropriata. 4-7,11
"> Qualsiasi sonda può essere modificato da questo progetto. Per l'alta risoluzione fluorescenza microendoscopy modalità, 1 mm Fibra immagine diametro consisteva di 50.000 singole fibre di base con 4,5 micron spaziatura, risultando in una risoluzione spaziale sub-cellulare costante di 4,5 micron . Gli investigatori vogliono una diversa fibra un'immagine dimensioni per ottenere un più piccolo o più grande campo di vista può trovare queste fibre immagine prontamente disponibili con diametro compreso tra 0,14 e 1,40 mm. una lente tubo con lunghezza focale 50 mm è stato scelto in modo tale che il sensore CMOS catturato la igienico 1 mm campo visivo di vista dalla fibra immagine. Quando mantenendo costante la lente obiettivo, aumentando la lunghezza focale della lente del tubo aumenterà ingrandimento e frequenza di campionamento ma diminuiscono campo di vista. 11 Così, l'ingrandimento la lente obiettivo, la lunghezza focale della lente del tubo, dimensioni del sensore di immagine, e la dimensione della fibra dell'immagine può e deve essere ottimizzato a seconda delle necessità. Infine, filtri e eccitazione luminosasorgente può essere modificato a seconda spettri di eccitazione / emissione di coloranti fluorescenti. 4-7 Oltre a modificare la sonda e ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy strumentazione, la spettroscopia di riflettanza strumentazione sub-diffusa può essere modificato.Per la modalità di spettroscopia di riflettanza diffusa sub-, diverse fibre multimodali dimensioni possono essere utilizzati in ogni SDS. Più piccole fibre multimodali diametro saranno in grado di consegnare e raccogliere la luce su un'area più piccola, ma si consiglia di utilizzare un array di fibre in modo identico distanziati per aumentare segnale-rumore, se inferiore a 200 micron vengono utilizzati diametri delle fibre. Gli investigatori analizzano pelle o tessuto orale possono beneficiare di una sonda nel complesso più grande per aumentare il campo di vista e rapporto segnale-rumore, ma in organi luminosi stretti, come ad esempio l'esofago o il tratto gastrointestinale, gli investigatori si troveranno ad affrontare i vincoli video sulla dimensione della sonda, soprattutto per la compatibilità con il porto biopsia del conventoionale endoscopi. 8 Altri componenti spettroscopia che possono essere modificati sono la fonte di luce a banda larga e interruttore ottico motorizzato. Una lampada al tungsteno-alogeno è stato scelto in questo caso, anche se altre fonti di luce possono e sono stati utilizzati in altri studi, compresi lampada allo xeno e LED, che possono aumentare segnale-rumore e tempi di integrazione inferiori. 2,15,20 L' interruttore ottico motorizzato presentato qui era su misura per gestire fino a tre SDS, ma può essere modificato per includere gli ingressi più o meno. Va notato che l'interruttore ottico motorizzato fa aggiungere un componente ottico aggiuntivo tra la sorgente di luce a banda larga e spettrometro, diminuendo segnale-rumore. L'interruttore non può essere necessario per gli investigatori con più spettrometri che acquisiscono dati simultaneamente, ma con una componente del interruttore ottico in ultima analisi, riduce i costi della strumentazione di circa $ 3,000 USD per SDS.
Costruzione della strumentazione (
Per quanto riguarda la risoluzione dei problemi, spettri conseguente adatta poveri (mediaerrori per cento superiore al 10% tra i dati grezzi e dati a muro) produrranno valori inaffidabili per i parametri fisiologici tre dei tessuti ([Hb], [Mel], e Sao 2) qui presentati. Adatta poveri sono molto probabilmente il risultato di una movimento tra la sonda e il sito della pelle durante l'acquisizione dei dati, strette condizioni al contorno nel codice post-elaborazione, o inaffidabili a priori i valori di [Hb] e [Mel]. 11,21,24, 26 i miglioramenti in questi tre avvenimenti di errore comuni dovrebbero fissare il montaggio accurato degli spettri di riflettanza sub-diffusa. Così, la raccolta dei dati può essere migliorata riducendo il tempo di integrazione spettrometro per ridurre gli artefatti di movimento all'interno spettri. Inoltre, le condizioni al contorno rappresentano la gamma di possibili valori di output computazionale per [Hb], [Mel], e São 2 seguente post-elaborazione. In questi studi, le condizioni al contorno sono stati 0-10 mg / ml [Hb], 21,22 0-40 mg / ml [Mel], 27,28 e 0-100% per SaO 2,
Il limite principale di questa piattaforma microendoscopy imaging e spettroscopia fibra multimodale fascio è la mancanza di una modalità di imaging widefield. L'alta risoluzione fluorescenza microendoscopy modalità ha un campo di vista circolare, che è 1 mm di diametro, rendendo difficile per scansionare rapidamente una grande area di tessuto. Un metodo di calcolo per superare questa limitazione è immagine mosaIcking, una tecnica utilizzata per fornire un più ampio campo di vista impilando immagini micro-scala adiacenti in un unico, grande mappa immagine. 10 Tale immagine mosaicatura è stato precedentemente dimostrato da Prieto et al. a indagare le caratteristiche dell'immagine del colon. 10 An strumentazione modifica per superare questa limitazione sarebbe fare la sonda compatibile con la porta biopsia di un endoscopio convenzionale, come la sonda presentato da Parikh et al. investigare neoplasia colorettale. 8 questa funzione combina i vantaggi di un campo visivo di livello con l'imaging micro-scala ad alta risoluzione di fluorescenza microendoscopy. 8
In generale, questa tecnica è stata dimostrata in vivo pelle umana e mostra il valore del tessuto ad alta risoluzione immagini micro-architettura co-registrazione con la concentrazione sottostante melanina, emoglobina, e la saturazione di ossigeno tissutale (Figura 5). Questo Technique può essere utilizzato dai ricercatori intendono studiare il legame tra anomalie dei tessuti strutturali e funzionali in vivo, o di tessuti analizzare cambiamenti funzionali in assenza di cambiamenti strutturali osservabili. Studi futuri potranno studiare la fattibilità di questa tecnica in vari stati di malattia epiteliali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
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