Abstract
Senaste fiberbunt microendoscopy tekniker möjliggör icke-invasiv analys av in vivo vävnad med användning av antingen avbildningstekniker eller en kombination av spektroskopitekniker. Kombinera avbildning och spektroskopitekniker i en enda optisk sond kan ge en mer fullständig analys av vävnad hälsa. I den här artikeln, är två olika metoder i kombination med hög upplösning fluorescens microendoscopy avbildning och diffus reflektionsspektroskopi, i en enda optisk sond. Högupplöst fluorescens microendoscopy avbildning är en teknik som används för att visualisera apikal vävnadsmikroarkitektur, och även om det mesta en kvalitativ teknik, har visat effektiv realtidsdifferentiering mellan neoplastiska och icke-neoplastisk vävnad. Diffus reflektans-spektroskopi är en teknik som kan extrahera vävnads fysiologiska parametrar inklusive lokal hemoglobinkoncentration, melanin koncentration, och syremättnad. I den här artikeln beskrivs specifikationerna rbligatoriskt att konstruera den fiberoptiska sonden, hur man bygger den instrumentering, och sedan visar tekniken på in vivo människohud. Detta arbete visade att vävnadsmikroarkitekturen, speciellt apikala hudkeratinocyter, kan samtidigt registreras med tillhörande fysiologiska parametrar. Instrumenteringen och fiberknippe sond som presenteras här kan optimeras antingen en handhållen eller endoskopiskt-kompatibel enhet för användning i en mängd olika organsystem. Ytterligare klinisk forskning behövs för att testa lönsamheten av denna teknik för olika epitelceller sjukdomstillstånd.
Introduction
Fiber bunt microendoscopy tekniker analysera typiskt in vivo vävnad med hjälp av antingen avbildningstekniker eller en kombination av spektroskopi tekniker. 1-3 En sådan bildteknik med hög upplösning fluorescens microendoscopy kan bild apikal vävnadsmikroarkitektur med sub-cellulära upplösning i en liten , mikro fält-of-view, med hjälp av en aktuell kontrastmedel såsom proflavin, fluorescein, eller pyranin bläck. 1,3-11 Denna avbildning modalitet har visat lovande kliniska prestanda i kvalitativt skilja sjuka och friska epitelvävnad i realtid med låg inter-observatör variabilitet. 8 ibland kommer utredarna använda högupplösta fluorescensmikroskopi data för att extrahera kvantitativa funktioner såsom cell och nukleära storlek eller körtel område, men detta är fortfarande en främst kvalitativ teknik inriktade på att visualisera vävnadsmorfologin. 1,3,8- 10 Å andra sidan, spektroskopitekniker, såsomsom diffus reflektans spektroskopi, är inriktade på att tillhandahålla funktionell information vävnad och har visat lovande kliniska prestanda i kvantitativt identifiera cancer skador i flera organ. 2,12-15
Därför finns det ett behov av en anordning som innefattar båda typerna av metoder som eventuellt ytterligare minska inter-observatör variabilitet upprätthålla realtid visualisering av vävnadsmikroarkitekturen och ge en mer fullständig analys av vävnad hälsa. För att uppnå detta mål, var en multimodal sondbaserad instrument konstruerat som kombinerar två metoder i en enda fiberoptisk sond. Hög upplösning fluorescens microendoscopy och sub-diffus reflektansspektroskopi 11 Denna metod co-register kvalitativa högupplösta bilder av apikal vävnad morfologi (strukturella egenskaper) med kvantitativ spektral information (funktionella egenskaper) från två olika vävnadsdjup inklusive lokal hemoglobinkoncentration ([Hb]), melanin koncentration ([Mel]), och syremättnad (SAO 2). 11,12,16 Denna specifika sub-diffus reflektansspektroskopi modalitet använder två källdetektor separationer (säkerhetsdatablad) för att sampla två unika vävnadsdjup för att ge en mer heltäckande bild av vävnad hälsa genom provtagning ner till basalmembranet och underliggande vävnad stroma. 11
Fiber sond består av en central 1 mm diameter optisk fiber med cirka 50.000 4,5 um diameter fiberelement, en manteldiameter av 1,1 mm och en total beläggning diameter på 1,2 mm. Den optiska fibern är omgiven av fem 200 um fibrer diameter med beklädnad diameter av 220 pm. Varje 200 pm multimodfiber ligger centrum till centrumavstånd av 864 pm från centrum av den optiska fibern. Var och en av de 200 ^ m multimodfibrer är 25 ° från varandra. Använda den vänstra 200 pm multimodfiber som "källa" fiber, och ytterligare three 200 fim multimodfibrer som "insamlings" fibrer, denna geometri nödvändigtvis skapar tre centrum-till-centrum säkerhetsdatablad av 374 um, 730 um, 1051 um och 1323 um. De fiberspetsarna är inneslutna i ett cylindriskt metallhölje som håller avstånden mellan fibrerna konstant. Diametern hos det cylindriska metallhöljet är 3 mm. Den distala änden (i riktning mot den fiberoptiska sondspets) av den fiberoptiska proben är 2 fot lång. Sonden separerar sedan in i de sex respektive enskilda fibrerna vid den proximala änden (i riktning mot den instrumentering) som är ytterligare 2 fot lång, med en totallängd av 4 fot. Figur 1 visar en representation av den fiberoptiska proben.
Figur 1:. Fiberoptiska sond konstruktion Den fiberoptiska proben består av en 1 mm diameter optisk fiber och fyra 200 | j, m multimodfibrer. DettaFiguren visar representationer av (a) den metall ändkåpa som begränsar geometrin för fibrerna vid sondspetsen till att ge säkerhetsdatablad av 374, 730, och 1051 | j, m med avseende på den längst till vänster 200 fim multimodfiber (Skalstreck ≈ 1 mm), (b) att fibrerna att begränsas inom metallocket, som visar fiberkärnorna, fibermantel och fiberbeläggningen (Skalstreck ≈ 1 mm), (c) den skyddande polyamid mantling kring fibrer (Skalstreck ≈ 1 mm), (d ) den färdiga distala spetsen av sonden, med metallfingergreppet och enda svart kabel som innehåller alla fibrer (Skalstreck ≈ 4 mm), och (e) en bild av den distala spetsen av sonden (Skalstreck ≈ 4 mm). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Detta multimodala instrumentering och tillhörande tekque är den första kombinationen av dessa metoder inom en enda sond, även om andra kombinerade strukturella / funktionella tekniker existerar som kombinerar olika former. Till exempel, hyperspektral avbildning kombinerar vidvinkel avbildning med kvantitativa hemoglobin och melanin egenskaper, 17,18 och andra tekniker har utvecklats som kombinerar optisk koherens tomografi (OCT) med analys av vävnadsproteinuttryck, 19 för att nämna några. Denna artikel rapporterar om en kompakt och enkel att implementera instrumentering installation som använder en allmän fiberoptisk sond som kan optimeras för olika syften, inklusive endoskopisk användning i den nedre mag-tarmkanalen och matstrupen eller som en handhållen sond för användning i munhålan och extern hud placering. 11,20
Hårdvaran för denna instrumentering kräver både anpassade datainsamling och efterbearbetning kod för att få diffus reflektans spektra och sedan extrahera den resulterande volume-genomsnitt vävnads fysiologiska parametrar, bland annat [Hb], [Mel] och SAO 2. Den anpassade datainsamling kod byggdes för att tillåta samtidig förvärv från en kamera (för hög upplösning fluorescensmikroskopi) och en spektrometer (för diffus reflektans spektroskopi). Drivrutiner är ofta tillgängliga från tillverkarnas webbplatser för att möjliggöra integration med en mängd olika programmeringsspråk. Den anpassade efterbehandling kod importerar a priori absorptionsvärden in vivo [Hb] och [Mel] 21 och sedan använder en tidigare utvecklat ickelinjär optimering anpassningsprocessen som skapar en anpassad kurva av spektrat. 22 anpassade kurvan byggs genom att minimera χ värde 2 mellan sig själv och den råa spektra och bestämning av vävnads fysiologiska parametrar ([Hb], [Mel] och SAO 2) från den anpassade kurvan och med den lägsta χ 2 värde. 22 koden kan modifieras för att innefattaabsorption från andra kromoforer liksom, såsom exogena pyranin bläck som används här, så att mål fysiologiska parametrar påverkas inte.
Fysiologiska indikatorer på vävnads hälsa, såsom [Hb], [Mel] och SAO 2, kan användas som rapporter av tumörrespons på terapi eller som indikatorer på lokal vaskularisering och angiogenes. 14,23 Inklusive en högupplösande fluorescens microendoscopy modalitet hjälper guide sondplacering och ger utredarna med en mer fullständig bild av förhållandet mellan epitelvävnad struktur och funktion. I den här artikeln, konstruktion och tillämpning av den multimodala microendoscope beskrivs. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Review Board godkännande (IRB # 15-09-149) erhölls från försöksperson programmet vid University of Arkansas för alla aspekter av denna studie. De metoder som beskrivs genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjer, och informerat samtycke erhölls från alla deltagare.
1. Montering av Högupplöst Fluorescence Microendoscopy Modalitet
Obs! Beskrivs steg för montering av den höga upplösning fluorescens microendoscopy modalitet kan visualiseras i figur 2.
- Placera en 470 nm dikroisk spegel Inuti en 30 mm Cage Cube.
- Skaffa en 30 mm bur kub och ta bort den dikroiska filterfästet.
- Placera en 470 nm dikroisk spegel i den dikroiska filterfästet.
- Sätt tillbaka och säkra den dikroiska filterfästet tillbaka i buren kuben.
- Fästa buraggregatet Rods till 30 mm Cage Cube.
- Säkrafyra 1,5 tum bur monteringsstänger på framsidan av buren kuben.
- Säkra fyra 3,0-tums bur monteringsstavar till den högra sidan av buren kuben.
- Säker två 2,0 tums bur monteringsstavar diagonalt på vänster sida av buren kuben.
- Bygg en Cage Plate / Lens Tube Assembly.
- Skaffa en 1,0 tum gängad 30 mm bur plattan och bifoga en stressfri låsring på insidan av buren plattan med den medföljande gäng.
- Skruva i en 1,0 tum lins röret till stress låsringen.
- Fäst en andra 1,0 tum gängade 30 mm bur plattan till 1,0 tum linsröret och justera standard låsringarna så att de två bur plattorna är i jämnhöjd.
- Skjut 1,0 tum Cage Plate / Lens Tube heten på den vänstra sidan av den 30 mm Cage Cube.
- Bygg rätvinklig spegel montera montering.
- Skaffa en rätvinklig spegel fäste och en 1,0 tums UV-förstärkt aluminium spegel.
- Placera 1,0 inch UV-förstärkt aluminium spegel i spegeln och dra åt.
- Säkra fyra 2,0 tum bur monteringsstänger på framsidan av spegeln montera
- Säker två 2,0 tums bur monteringsstavar diagonalt på den högra sidan av buren kuben.
- Anslut rätvinklig spegel montera enheten på den vänstra sidan av röraggregatet 1,0 tum gripplattan / lins genom att placera de motstående buren monteringsstavar genom de respektive öppningarna hos de 30 mm gripplattan.
- Tråd en z-axel translation mount genom de 3,0 tum bur monteringsstavarna på den högra sidan av enheten.
- Bifoga en 10X akromatisk objektiv till z-axeln översättning fäste.
- Bygga en 1,0 tum fiberadapterplatta / xy-axel översättningsobjektivfattningen montering.
- Skaffa en xy-axel översättning fäste och en 1,0 tum fiberadapterplatta.
- Säkra 1,0 tum fiberadapterplatta i xy-axeln översättningsobjektivfattningen.
- slide tHan 1,0 tum fiber adapter / xy-axel översättningsobjektivfattningen montering framför objektivet.
- Skaffa två 0,5 tum långa, 1,0 tums diameter lins rör, ett 440/40 nm bandpassfilter (excitation filter) och ett 525/36 nm bandpassfilter (emissionsfilter).
- Placera varje filter i en 0,5 tum lång, 1,0 tums diameter lins rör, så att pilen på utsidan av filtret mot sidan av linsen röret med utvändiga gängor.
- Fäst filtren för att monteringen.
- Erhålla två standard låsringarna.
- Fäst filtren inuti 0,5 tum långa, 1,0 tum i diameter lins rör med standard låsringarna.
- Skruva i linsen röret med excitation filter på framsidan av den 30 mm bur kub och skruva i linsen rör med emissionsfiltret till höger vinkel spegel montera.
- Skruva i 0,5 tum linsröret med emissionsfiltret på framsidan av den rätvinklig spegel montera.
- Obtain två 1,0 tum gängade 30 mm bur tallrikar och placera dem framför 0,5 tum lång, 1,0 tums diameter lins rör innehållande filtren.
- Med hjälp av epoxi eller starkt lim, bifoga en 455 nm LED till buren plattan är ansluten till excitation filter.
- Skaffa en 0,5 tum lång, 1,0 tums diameter lins rör och en 1,0 inches akromatisk dubbröret objektiv med brännvidd på 50 mm.
- Placera röret linsen inuti linsröret så att pilen på utsidan av linsen är vänd mot den sida av linsen rör med de yttre gängorna.
- Skruva i röret linsen till enheten.
- Skaffa en standard låsringen.
- Säkra linsen inuti 0,5 tum lång, 1,0 tum i diameter lins rör med standard hållarringen.
- Sätt på objektivet rör med röret linsen till den vänstra bur plattan.
- Placera en 30 mm gripplattan framför den 0,5 tum lång, 1,0 inches diameter lins rör innehållande röret linsen.
- bifoga en stressfri hållarring till insidan av den 30 mm gripplattan.
- Bifoga en USB svartvit kamera buren plattan med stressfri låsringen.
- Konstruera optiska post upphängningsanordningar.
- Skaffa fyra 0,5 tum befattningshavare, fyra 0,5 tum optiska inlägg, och fyra monterings baser.
- Fäst 0,5 tum optiska inlägg inne i 0,5 tum befattningshavare.
- Fäst 0,5 tum befattningshavare på monterings baser.
- Skruva i fyra optiska inlägget monteringsanordningar till skruvhålen ligger under 30 mm buren kuben, rätvinklig spegel montera, buren plattan är ansluten till LED, och buren plattan ansluten till kameran.
- Skruva i de fyra optiska post monteringsanordningar till antingen en optisk bakbord eller optisk bord att avsluta byggandet av den höga upplösning fluorescens microendoscopy modalitet.
ftp_upload / 54564 / 54564fig2.jpg "/>
Figur 2:. Montering av högupplösta fluorescens microendoscopy modalitet kan med hög upplösning fluorescens microendoscopy modalitet konstrueras genom att bygga ett skal av komponenter 1,0 tums diameter storlek, med särskild omsorg vid hanteringen av dikroiska spegeln, objektiv, excitation / emissionsfilter och tublinsen. Glasytor av dessa komponenter måste hanteras försiktigt med hjälp av linspapper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Montering av under diffus reflektansspektroskopi Modalitet
Obs! Beskrivs steg för montering av under diffus reflektans spektroskopi modalitet kan visualiseras i Figur 3.
- Skaffa en volfram-halogen ljuskälla och, med hjälp av epoxi eller en starkt lim, säkra en 1,0 tum threaded 30 mm gripplattan på framsidan.
- Säkra fyra 3,0-tums bur monteringsstavar till buren plattan.
- Bifoga en z-axel översättning montera buren monteringsstavarna.
- Skruva i en 20X akromatisk objektiv till z-axeln översättning fäste.
- Bygga en fiberadapterplatta / xy-axel översättningsobjektivfattningen montering.
- Skaffa en xy-axel översättning fäste och en 1,0 inches fiberadapterplatta.
- Fäst fiberadapterplattan i xy-axeln översättningsobjektivfattningen.
- Skjut 1,0 tum fiber adapter / xy-översättning montera montering framför objektivet.
- Bygg motorarmsaggregatet.
- Skaffa specialbyggda aluminium motor arm och en SMA fiber adapterplatta.
- Skruva i fiberadapterplattan (med extern gäng) i aluminiummotorarmen (med invändig gänga).
- Fäst specialbyggda aluminium motor arm adapter till motorarmen med fyra # 4-40 0,5. Skruvar.
- Bygg motor / motor arm / motorhuset enheten.
- Skaffa specialbyggda aluminium motorhuset och 400 steg stegmotor.
- Passa in skruvhålen på stegmotorn och motorhuset och fäst med fyra # 4-40 0,5 tums skruvar.
- Mata den roterande motorstång stegmotorn genom öppningen av motorarmsaggregatet och dra åt låsskruven på aluminiummotorarmen adapter.
- Bygga den optiska omkopplingsenheten.
- Skaffa specialbyggda aluminium optisk omkopplare och tre 1,0 tum fiberadapterplattor.
- Gänga adapterplattorna in i de gängade hålen i den optiska omkopplaren.
- Fäst specialbyggda aluminium optisk omkopplare ansikte plattan på den optiska omkopplaren med fyra # 4-40 0,5 tums skruvar.
- Fäst motor / motor arm / motorhuset aggregatet till den optiska omkopplaren, genom att mata den roterande motorstången hos stegmotorn genom det centrala hålet i than optisk omkopplare.
- Skaffa en elektrisk kretskort och stegmotorn förare, och sedan placera stegmotorn föraren över centrala spåret på bakbord.
- Beakta den elektriska anslutningen schematiska (Figur 3, 2,12) för stegmotorn föraren, 12 V strömförsörjning, och stegmotorn.
- Anslut stegmotorn föraren, 12 V strömförsörjning, och stegmotorn i enlighet med kopplingsschemat (figur 3, 2,12) för att slutföra konstruktionen av den motordrivna optiska omkopplaren.
- Skruva i den optiska byta komponenter och volfram-halogen ljuskälla till en optisk bakbord eller optisk bord nära den tidigare konstruerade (Figur 2, 1,24) med hög upplösning fluorescens microendoscopy montering.
- Fäst ena änden av en 550 um, 0,22 NA patchkabeln till 1,0 tum fiberadapterplatta av motorns armsaggregatet.
- Anslut den andra änden av 550 um, 0,22 NA patchkabeln till fiber anslutaeller USB-spektrometer.
- Skruva i de fem distala sondkablarna till respektive 1,0 tum fiberadapterplattor på instrumenteringen för att avsluta genomförandet av den multimodala högupplösta avbildning och sub-diffus reflektansspektroskopi fiberknippe microendoscope.
- Skruva i den centrala 1 mm bild diameter fiberkabel till 1,0 tum fiberadapterplatta som nämns i steg 1.9.2.
- Skruva i den vänstra 200 um multi fiberkabel till 1,0 tum fiberadapterplatta som nämns i steg 2,6.
- Skruva i 2: a 200 um multi fiberkabel till längst till vänster 1,0 tum fiber adapter till volfram-halogenlampa som nämns i steg 2.9.2.
- Skruva i den 3: e 200 um multi fiberkabel till mitten 1,0 tum fiberadapterplatta som nämns i steg 2.9.2.
- Skruva i den 4: e 200 um multifiberkabeln till den högra 1,0 tum fiberadapterplatta som nämns i steg 2.9.2.
Figur 3:. Montering av sub-diffus reflektansspektroskopi modalitet Under diffus reflektansspektroskopi modalitet kan konstrueras med användning av en basisk volfram-halogenlampa som är kopplad till en objektivlins för att fokusera ljus genom den 200 ^ m multimode leverans fiber, och en spektrometer. Dessutom kan en specialbyggd motoriserad optisk omkopplare byggas inom lampan-fiber spektrometer väg att växla mellan varje SDS. Utredarna använder flera spektrometrar att förvärva från flera säkerhetsdatablad kan kringgå den optiska omkopplaren komponenten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.3. Kalibrering av under diffus reflektansspektroskopi Modality
Obs! Ffter steg (avsnitt 3) skall vara avslutad före samlingen spektraldata (avsnitt 4).
- Slå på alla komponenter i instrumenteringen, inklusive 455 nm LED, bredband volfram-halogenlampa, CMOS-kamera, USB-spektrometer, stegmotor, och motorstyrkortet. Se till att slutaren på volfram-halogenlampan är öppen.
- Stäng av all omgivande ljus.
- Öppna anpassade datainsamling programvara.
- Håll utrustning som kör i 30 minuter för lampan når en lämplig temperatur och för egenbullret från spektrometern stabiliseras.
- Placera en 20% diffus reflektans standard i bottenöppningen av specialbyggda, 3D tryckta kalibreringsstandard enhet.
- Placera den fiberoptiska sond i den vänstra spåret på anpassningsbar, 3D tryckta fiberhållare, visas i figur 4. Den vänstra facket fixerar vinkelräta avståndet från den fiberoptiska sondens spets till reflektansstandard på 2,1 mm, vilket är den optimum avstånd där signalen når spektrometern maximeras under de första SDS av 374 pm.
- Justera den motordrivna optiska omkopplaren till vänster positionen så att spektrometern är ansluten till de första SDS av 374 pm.
- Ställa in integrationstiden till 500 msek. Denna integration tid måste väljas för att inte mätta spektrometern men behålla en praktiskt taget låg integrationstiden.
- Skaffa ett spektrum, Rmax, 374μm, genom att klicka på "Hämta Spectrum" i programmet.
- Stäng luckan på volfram-halogenlampa och spela ett spektrum, R mörk, 374μm, bakgrundsljud, genom att klicka på "Hämta Spectrum" i programmet. Väl förvärvat, öppna slutaren igen.
- Placera den fiberoptiska sond i den högra spåret på anpassningsbar, 3D tryckta fiberhållare, visas i figur 4. Den högra spåret fixerar vinkelräta avståndet från fiber optic sondens spets till reflektansstandard vid 3,9 mm, vilket är det optimala avståndet i vilket signalen når spektrometern är maximerad för den andra SDS av 730 | j, m.
- Justera den motordrivna optiska omkopplaren i mittläget så att spektrometern är ansluten till den andra SDS av 730 pm.
- Skaffa ett spektrum, Rmax, 730μm, genom att klicka på "Hämta Spectrum" i programmet.
- Stäng luckan på volfram-halogenlampa och spela ett spektrum, R mörk, 730μm, bakgrundsljud, genom att klicka på "Hämta Spectrum" i programmet.
- Öppna slutaren än en gång.
Figur 4:. Kalibrering av sub-diffus reflektansspektroskopi modalitet För pre-experimentella kalibrering, måste den fiberoptiska sondspetsen placeras vid olikavinkelräta avstånd från 20% diffus reflektans standard beroende på SDS. Att konsekvent uppnå dessa vinkelräta avstånd i alla experiment en kalibreringsstandard anordning som är konstruerad (enhet tvärsnitt visas i (a)) för att hålla sonden på exakta avstånd från 20% diffus reflektans standard. I detta specifika fiberoptisk sond installationen är ljus från volfram halogenlampa visas genom den optiska omkopplaren på källdetektor separationer av (b) 374 um och (c) 730 m (med motor och motorarmen bort från den optiska banan för tydlighets skull). Avstånd (d) 2,1 mm för 374 pm SDS och (e) 3,9 mm för 730 pm SDS krävs för kalibrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.4. In vivo Data FÖRVÄRVn och optisk egenskap Extraction från Human Skin
I detta avsnitt kommer multimodala microendoscope tekniken demonstreras på in vivo mänsklig hud.
- Öppna anpassade datainsamling programvara och justera tiden spektrometern integration genom att klicka på "Integration Time" och ställ in den så att den är densamma som under kalibrering, vilket var 500 ms i det här fallet (steg 3,8).
- Bestäm hudområde där att samla in data, som kan skilja sig om tillämpningen av utredaren. I detta fall var den tunna huden på underarmen som valts som en demonstration.
- Om huden området innehåller hår, ta bort hår med en steril engångs rakkniv.
- Skaffa en vanlig gul överstrykningspenna, som innehåller pyranin bläck, och lätt markera det valda hudområdet.
- Slå på 455 nm LED och stänga luckan till volfram-halogenlampa.
- Placera sonden i varsam kontakt med huden.
- Förflytta sonden enrunda på det färgade området av vävnad för att se en levande högupplösta matning av apikala keratinocyt arkitektur på visningsfönstret av programvaran.
- Välj en lämplig tid och få exponering, 150 ms och 10 dB förstärkning i det här fallet, för att undvika bildmättnad, genom att klicka på "Exposure Time" och "Gain", skriva in lämpliga värden, och sedan klicka på "Apply Settings" i mjukvaran gränssnitt.
- Förvärva en bild genom att klicka på "Hämta bild" i programvaran gränssnitt.
- Medan hålla sonden på samma bild plats, stänga av 455 nm LED och öppna luckan till volfram-halogenlampa.
- Justera den motordrivna optiska omkopplaren åt vänster läge så att spektrometern är ansluten till den andra SDS av 374 pm.
- Förvärva spektra, R vävnad, 374μm, genom att klicka på "Hämta Spectra" i programvaran gränssnitt.
- Justera den motordrivna optiska omkopplaren till mittläget sådana thpå spektrometern är ansluten till andra SDS av 730 pm.
- Förvärva spektra, R vävnad, 730μm, genom att klicka på "Hämta Spectra" i programvaran gränssnitt.
- Öppna den anpassade efterbearbetnings programvara.
- Kör efterbearbetnings programvara genom att klicka på "Kör" och välj hög upplösning fluorescens bild, fyra kalibreringsspektra, och de två in vivo-spektra från den mapp där data sparades när du uppmanas av programvaran.
OBS! Anpassade program får den verkliga absoluta reflektions (R abs, 374μm och R abs, 730μm) med följande ekvationer.
Efterbearbetnings kod, såsom beskrivits tidigare, beräknar en inpassad kurva till diffus reflektans-spektra (ekvationerna 1 och 2) och därefter determines vävnads fysiologiska parametrar inklusive ([Hb], [Mel], och Sao 2). 11,22,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter detta protokoll kommer utredaren erhålla en in-focus högupplöst bild av vävnadsstället med hela synfältet (fig 5). Konturerna av cellerna kan ses om färgas med pyranin bläck från en standard gul stryknings, medan individuella cellkärnor kan ses om färgas med ett färgämne, såsom proflavin. Följande spektrala förvärvet, använder efterbearbetnings programvara a priori kunskap om in vivo-hemoglobinkoncentration ([Hb]) och melaninkoncentrationer ([Mel]) 21 för att passa under diffus reflektans-spektra och bestämma värden för [Hb], [Mel ], och vävnadssyremättnad (SAO 2) såsom visas i figur 5. efterbehandlings~~POS=TRUNC mjukvara använder breda fysiologiska gränser ([Hb] = 0-150 mg / ml, [Mel] = 0-30 mg / ml, och SAO 2 = 0-100%) för att passa det kalibrerade spektra. 21
Figur 5:. Co-registrering kvalitativa och kvantitativa data från in vivo human normal hud och en godartad melanocytär nevus En hög upplösning fluorescens bild förvärvades från en pyranin-bläck (från en vanlig gul överstrykningspenna) färgade godartad melanocytär nevus och intilliggande normal hud vävnad med en exponeringstid på 150 msek. Konturerna av keratinocyter kan syns tydligt i båda bilderna. Den normala hudvävnad plats och melanocytär nevus hade hemoglobinvärdet med 1,63 och 0,86 mg / ml, melaninkoncentrationer av 0,78 och 10,20 mg / ml, respektive, med liknande syremätt av 99%. Denna siffra visar nyttan av samarbete registrera kvalitativ strukturell och kvantitativ funktionell information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den multimodala högupplösta avbildning och sub-diffus reflektansspektroskopi fiberknippe microendoscope redovisas här kan optimeras och används av forskare för en mängd olika tillämpningar, inklusive endoskopisk eller handhållen användning för mänskliga eller djurstudier. Det ger således en flexibel metod för att visualisera in vivo apikal vävnadsmikroarkitektur tillsammans mätningar av hemoglobinkoncentration, melanin koncentration och vävnadssyremättnad från två olika vävnadsdjup. I den här artikeln beskrivs specifikationerna för den fiberoptiska sond, beskrivs ett protokoll för montering av högupplösta bildsystem och under diffus reflektans bildsystem, och visat dess tillämpning i mänskliga vävnader in vivo med hjälp av pyranin bläck som fluorescerande kontrastmedel för vävnad visualisering. Andra bläck, såsom proflavin eller fluorescein, kan användas i stället för pyranin bläck med lämplig godkännande. 4-7,11
"> Varje sond funktion kan ändras från denna design. För högupplösta fluorescens microendoscopy modalitet bestod 1 mm bild diameter fiber av 50.000 individuella kärnfibrer med 4,5 um mellanrum, vilket resulterar i en konstant subcellulär rumslig upplösning på 4,5 um . Utredarna vill ha en annan bildstorlek fiber för att erhålla en mindre eller större område-of-view kan hitta dessa bild fibrer lättillgängliga med diametrar mellan 0,14 och 1,40 mm. ett rör objektiv med brännvidd på 50 mm valdes så att CMOS-sensorn fångade hela 1 mm field-of-view från optiska fibern. När hålla objektiv konstant ökar brännvidden av röret linsen kommer att öka förstoringen och samplingsfrekvens men minska fält of-view. 11 Således förstoringen av objektivlinsen, brännvidd av röret lins, storleken på bildsensorn, och storleken av bilden fibern kan och bör optimeras beroende på behov. Slutligen filter och excitationsljusKällan kan ändras beroende på excitation / emissionsspektra av fluorescerande färgämnen. 4-7 Förutom att ändra sonden och hög upplösning fluorescens microendoscopy instrumentering, kan under diffus reflektans spektroskopi instrumentering ändras.För sub-diffus reflektansspektroskopi modalitet, kan olika stora multimodfibrer användas vid varje SDS. Mindre multi diameter fibrer kommer att kunna leverera och samla ljus över ett mindre område, men det är rekommenderat att använda en rad identiskt fördelade fibrer för att öka signal-till-brus om fiberdiametrar mindre än 200 nm används. Utredarna analyserar hud eller oral vävnad kan dra nytta av en övergripande större sond för att öka fält-of-view och signal-till-brus, men i smalare lysande organ, såsom matstrupen eller mag-tarmkanalen, utredare kommer att möta lagt restriktioner avseende sondstorlek, särskilt för kompatibilitet med biopsihamnen klosterional endoskop. 8 Övriga spektroskopi komponenter som kan behöva modifieras inkluderar bredbandsljuskällan och motoriserad optisk omkopplare. En volfram-halogenlampa valdes i detta fall, även om andra ljuskällor kan och har använts i andra studier, inklusive xenonlampa och lysdioder, som kan öka signal-till-brus och lägre integreringstider. 2,15,20 Den motoriserad optisk omkopplare som presenteras här var specialbyggda för att hantera upp till tre säkerhetsdatablad, men kan modifieras för att inkludera mer eller mindre ingångar. Det bör noteras att den motoriserade optisk omkopplare tillför en ytterligare optisk komponent mellan bredbandig ljuskälla och spektrometer, minskande signal-till-brus. Växeln får inte vara nödvändigt för utredarna med flera spektrometrar som förvärvar data samtidigt, men inklusive en optisk omkopplare komponent i slutändan minskar instrumentering kostnad av cirka $ 3000 USD per SDS.
Konstruktion av instrumentering (
När det gäller felsökning, spektra resulterar i dåliga anfall (genomsnittprocent fel större än 10% mellan rådata och inbyggda data) kommer att ge opålitliga värden för tre vävnads fysiologiska parametrar ([Hb], [Mel], och Sao 2) presenteras här. Dåliga passningar är mest sannolikt resultatet av antingen rörelse mellan proben och hudställe under datainsamling, smala randvillkor i efterbearbetnings kod, eller otillförlitliga a priori värdena av [Hb] och [Mel]. 11,21,24, 26 Förbättringar i dessa tre vanliga händelser fel bör fastställa den exakta montering av under diffus reflektans spektra. Således kan datainsamling förbättras genom att minska spektrometer integrationstiden för att minska rörelseartefakter i spektra. Dessutom, randvillkor representerar de möjliga beräkningsutgångsvärden för [Hb], [Mel], och Sao två följande efterbehandling. I dessa studier, randvillkor var 0-10 mg / ml för [Hb], 21,22 0-40 mg / ml för [Mel], 27,28 och 0-100% Sao 2,
Den primära begränsningen till denna multimodal imaging och spektroskopi fiberknippe microendoscopy plattform är avsaknaden av en widefield imaging modalitet. Den högupplösta fluorescens microendoscopy modalitet har ett cirkulärt område-of-view som är 1 mm i diameter, vilket gör det svårt att snabbt scanna ett stort område av vävnad. En beräkningsmetod för att övervinna denna begränsning är bilden mosaIcking, en teknik som används för att ge en bredare fält-of-view genom att stapla angränsande mikroskala bilder till en enda större bild karta. 10 sådan bild mosaik har tidigare visats av Prieto et al. att undersöka kolon bildfunktioner. 10 En instrumentering modifiering för att övervinna denna begränsning skulle göra sonden kompatibel med biopsi-porten på en konventionell endoskop, såsom sonden presenteras av Parikh et al. att undersöka kolorektal neoplasi. 8 denna funktion kombinerar fördelarna med ett brett fält-of-view med mikroskala avbildning av hög upplösning fluorescens microendoscopy. 8
Sammantaget var denna teknik visat på in vivo mänsklig hud och visar värdet av co-registrering med hög upplösning vävnadsmikro arkitektoniska bilder med den underliggande melanin koncentration, hemoglobinkoncentration, och vävnadssyremättnad (Figur 5). denna TechnIQue kan användas av forskare som vill undersöka sambandet mellan strukturella och funktionella vävnad avvikelser in vivo, eller analysera vävnads funktionella förändringar i avsaknad av observerbara strukturella förändringar. Framtida studier kommer att undersöka lönsamheten för denna teknik i olika epitelceller sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
