Multimodal de imágenes y la Plataforma Microendoscopy Espectroscopia de fibra paquete para no invasiva,<em> En Vivo</em> Análisis de Tejidos
Summary
The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.
Abstract
Recientes técnicas microendoscopy fibra de haz permiten el análisis no invasivo de tejido in vivo utilizando cualquiera de las técnicas de imagen o una combinación de técnicas de espectroscopia. La combinación de las técnicas de imagen y espectroscopia en una sola sonda óptica puede proporcionar un análisis más completo de la salud de los tejidos. En este artículo, dos modalidades diferentes se combinan, imágenes de alta resolución de fluorescencia microendoscopy y espectroscopia de reflectancia difusa, en una sola sonda óptica. De alta resolución de imagen microendoscopy fluorescencia es una técnica utilizada para visualizar el tejido apical micro-arquitectura y, a pesar de todo una técnica cualitativa, ha demostrado diferenciación efectiva en tiempo real entre el tejido neoplásico y no neoplásico. espectroscopía de reflectancia difusa es una técnica que puede extraer parámetros fisiológicos del tejido incluyendo concentración local de hemoglobina, la concentración de melanina, y la saturación de oxígeno. En este artículo se describen las especificaciones rEQUERIDO para construir la sonda de fibra óptica, cómo construir la instrumentación, y a continuación, muestra la técnica en la piel humana in vivo. Este trabajo reveló que el tejido de micro-arquitectura, queratinocitos de la piel específicamente apicales, puede ser co-registrado en sus parámetros fisiológicos asociados. La sonda de instrumentación y fibra de haz que aquí se presenta se puede optimizar, ya sea como un dispositivo de mano o compatible con endoscópicamente para su uso en una variedad de sistemas de órganos. Se necesita investigación clínica adicional para poner a prueba la viabilidad de esta técnica para diferentes estados de enfermedades epiteliales.
Introduction
Técnicas microendoscopy fibra haz normalmente analizan en el tejido vivo utilizando cualquiera de las técnicas de imagen o una combinación de técnicas de espectroscopia. 1-3 Una de estas técnicas de formación de imágenes de alta resolución microendoscopy fluorescencia, pueden tomar imágenes de los tejidos apicales microarquitectura con la resolución subcelular en una pequeña , el campo de visión a microescala, el uso de un agente de contraste tópico tal como proflavina, fluoresceína, o tinta piranina. 1,3-11 Esta modalidad de imagen ha mostrado prometedor rendimiento clínico en la diferenciación de tejido epitelial cualitativamente enfermo y sano en tiempo real con baja variabilidad entre observadores. 8 de vez en cuando, los investigadores utilizarán los datos de microscopía de fluorescencia de alta resolución para extraer características cuantitativas tales como células y tamaño nuclear o área de la glándula, pero esto sigue siendo una técnica cualitativa principalmente dirigido a la visualización de la morfología del tejido. 1,3,8- 10 Por otra parte, las técnicas de espectroscopia, talescomo la espectroscopia de reflectancia difusa, que están dirigidas a proporcionar información de tejido funcional y han mostrado prometedores resultados clínicos para identificar cuantitativamente las lesiones cancerosas en múltiples órganos. 2,12-15
Por lo tanto, hay una necesidad de un dispositivo que incorpora ambos tipos de modalidades para reducir potencialmente más variabilidad entre observadores, mantener visualización en tiempo real del tejido de micro-arquitectura, y proporcionar un análisis más completo de la salud del tejido. Para lograr este objetivo, un instrumento basado en la sonda multimodal fue construido que combina las dos modalidades en una sola sonda de fibra óptica:. De alta resolución microendoscopy fluorescencia y espectroscopia de reflectancia sub-difusa 11 Este método de co-registros cualitativos imágenes de alta resolución de apical morfología de los tejidos (propiedades estructurales) con información cuantitativa espectral (propiedades funcionales) a partir de dos profundidades diferentes tejidos incluyendo la concentración de hemoglobina local ([Hb]), la concentración de melanina ([Mel]), y la saturación de oxígeno (SaO 2). 11,12,16 Esta modalidad específica espectroscopia de reflectancia difusa sub-utiliza dos separaciones fuente-detector (SDSS) a la muestra dos profundidades de tejido única para proporcionar una visión más completa de la salud del tejido mediante el muestreo hasta la membrana basal y el estroma tejido subyacente. 11
La fibra sonda consta de una fibra de imagen 1 mm de diámetro central con aproximadamente 50.000 4,5 micras elementos de fibra de diámetro, un diámetro del revestimiento de 1,1 mm y un diámetro global de recubrimiento de 1,2 mm. La fibra de imagen está rodeada por cinco 200 micras fibras de diámetro con un diámetro de revestimiento de 220 micras. Cada fibra 200 micras multimodo se encuentra una distancia de centro a centro de 864 m de distancia del centro de la fibra de la imagen. Cada una de las fibras de 200 micras multimodo son de 25 °. Usando el extremo izquierdo de fibra multimodo de 200 micras como la fibra "fuente", y el TH adicionalree 200 micras fibras multimodo como las fibras "colección", esta geometría necesariamente crea tres de centro a centro de las SDS de 374 m, 730 m, 1051 m, y 1.323 micras. Las puntas de las fibras están encerrados en una carcasa metálica cilíndrica que mantiene las distancias entre fibras constante. El diámetro de la carcasa metálica cilíndrica es de 3 mm. El extremo distal (hacia la punta de la sonda de fibra óptica) de la sonda de fibra óptica es de 2 pies de largo. La sonda después se separa en los seis respectivas fibras individuales en el extremo proximal (hacia la instrumentación), que es un adicional de 2 pies de largo, para una longitud total de 4 pies. La figura 1 muestra una representación de la sonda de fibra óptica.
Figura 1:. Diseño de la sonda de fibra óptica La sonda de fibra óptica se compone de una fibra de imagen 1 mm de diámetro y cuatro 200 micras fibras multimodo. Estafigura muestra representaciones de (a) la tapa de extremo de metal que limita la geometría de las fibras en la punta de la sonda para producir las SDS de 374, 730, y 1.051 micras con respecto a la más a la izquierda de fibra de 200 micras multimodo (Escala bar ≈ 1 mm), (b) las fibras están limitados dentro de la tapa de metal, que muestra los núcleos de fibra, revestimiento de la fibra, y recubrimiento de la fibra (Escala bar ≈ 1 mm), (c) la poliamida de protección de revestimiento alrededor de las fibras (Escala bar ≈ 1 mm), (d ) la punta distal final de la sonda, con la ranura de agarre de metal y negro de cable único que contiene todas las fibras (Escala bar ≈ 4 mm), y (e) una imagen de la punta distal de la sonda (Escala bar ≈ 4 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Esta instrumentación asociada multimodal y técniQue es la primera combinación de estas modalidades dentro de una única sonda, aunque existen otras técnicas estructurales / funcionales combinados que combinan diferentes modalidades. Por ejemplo, las imágenes hiperespectrales combina formación de imágenes de campo amplio con propiedades cuantitativas de hemoglobina y la melanina, 17,18 y otras técnicas han sido desarrolladas que combinan la tomografía de coherencia óptica (OCT) con el análisis de la expresión de proteínas de tejido, 19 para nombrar unos pocos. Este artículo informa sobre una configuración de instrumentación compacta y fácil de implementar que utiliza una sonda de fibra óptica general que puede ser optimizado para varios propósitos, incluyendo el uso endoscópica en el tracto gastrointestinal inferior y el esófago o como una sonda de mano para su uso en la cavidad oral y la colocación de la piel externa. 11,20
El hardware para esta instrumentación requiere tanto de adquisición de datos y el código de encargo de post-procesamiento para adquirir espectros de reflectancia difusa y luego extraer el volum resultanteparámetros fisiológicos del tejido e incluyendo promediada [Hb], [Mel], y la SaO 2. El código de adquisición de datos personalizados fue construido para permitir la adquisición simultánea de una cámara (por microscopía de fluorescencia de alta resolución) y un espectrómetro (por espectroscopia de reflectancia difusa). Los conductores están a menudo disponibles de los sitios web de los fabricantes para permitir la integración con una variedad de lenguajes de programación. El código de post-procesamiento personalizado importa un archivo de valores de absorción a priori de in vivo [Hb] y [Mel] 21 y luego utiliza un proceso de adaptación de optimización no lineal desarrollado previamente que crea una curva ajustada de los espectros. 22 La curva ajustada se construye mediante la minimización del χ valor 2 entre sí mismo y los espectros en bruto y la determinación de los parámetros fisiológicos del tejido ([Hb], [Mel], y Sao 2) de la curva ajustada y con el más bajo χ 2 valor. 22 el código puede ser modificado para incluirabsorción de otros cromóforos, así, como la tinta piranina exógeno utilizado aquí, por lo que se dirigen a parámetros fisiológicos no se ven afectadas.
Indicadores fisiológicos de la salud de los tejidos, tales como [Hb], [Mel], y SaO 2, se pueden utilizar como informes de la respuesta del tumor a la terapia o como indicadores de la vascularización local y la angiogénesis. 14,23 La inclusión de una modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución ayuda a la colocación de la sonda guía y proporciona a los investigadores una visión más completa de la relación entre la estructura del tejido epitelial y la función. En este artículo, la construcción y aplicación de la microendoscope multimodal se describe. 11
Protocol
Representative Results
Discussion
La alta resolución de imagen multimodal y microendoscope fibra de haz de la espectroscopía de reflectancia difusa sub-informó aquí se pueden optimizar y utilizadas por los investigadores para una variedad de aplicaciones, incluyendo endoscópica o el uso de mano de los estudios en humanos o animales. Por lo tanto, proporciona un método flexible para la visualización in vivo de tejidos apical micro-arquitectura junto con las mediciones de la concentración de hemoglobina, la concentración de melanin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This material is based on work supported by the National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), the Arkansas Biosciences Institute, and the University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the acknowledged funding agencies.
Materials
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit – 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f=50mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor – 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno – R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard – Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver – Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
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