Abstract
Son fiber demeti mikroendoskopi teknikleri görüntüleme teknikleri ya da spektroskopi teknikleri bir arada kullanarak in vivo doku non-invaziv bir analiz sağlar. Tek bir optik prob içine görüntüleme ve spektroskopi teknikleri birleştiren doku sağlığının daha kapsamlı bir analiz sağlayabilir. Bu yazıda, iki farklı yöntemleri tek bir optik prob içine, yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi görüntüleme ve yaygın yansıma spektroskopi birleştirilir. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi görüntüleme çoğunlukla nitel teknikle rağmen, neoplastik ve non-neoplastik doku arasında etkili gerçek zamanlı farklılaşma göstermiştir, apikal doku mikro-mimari görselleştirmek için kullanılan bir tekniktir ve. Diffüz yansıma spektroskopisi yerel hemoglobin konsantrasyonunun melanin konsantrasyonu ve oksijen doygunluğu dahil doku fizyolojik parametreleri ayıklamak bir tekniktir. Bu makalede, özellikleri r açıklarenstrümantasyon oluşturmak ve sonra in vivo insan cildi üzerinde teknik gösterilmiştir nasıl, fiber optik prob inşa etmek equired. Bu çalışma, doku mikro-mimarisi, özellikle apikal cilt keratinositler, ilişkili fizyolojik parametreler ile birlikte kaydedilebilir ortaya koymuştur. Burada sunulan enstrümantasyon ve fiber-demeti sonda organ sistemlerinin çeşitli kullanım için bir el ya da endoskopik-uyumlu cihaza ya da optimize edilebilir. Ek klinik araştırma, farklı epitel hastalık durumları için bu tekniğin uygulanabilirliğini test etmek için gereklidir.
Introduction
Fiber paket mikroendoskopi teknikleri genellikle görüntüleme teknikleri ya da spektroskopi teknikleri bir arada kullanarak in vivo dokusunda analiz. 1-3 Böyle bir görüntüleme tekniği, yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi, alt hücresel çözünürlük ile yapabilirsiniz görüntü apikal doku mikro-mimari, küçük bir yer , mikro alan açısı, bu tür proflavine, floresein veya pyranine mürekkep olarak bir topikal kontrast ajan kullanılarak. 1,3-11 Bu görüntüleme yöntemi niteliksel düşük gerçek zamanlı olarak hastalıklı ve sağlıklı epitel doku ayırt klinik performans vaat göstermiştir gözlemciler arası değişkenliği. 8 Bazen, araştırmacılar bu tür hücre ve nükleer boyutu veya bez alanı olarak nicel özellikleri ayıklamak için yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi verileri kullanacak, ancak bu doku morfolojisi görselleştirmek yönelik hedef öncelikle nitel teknik olarak yerini korumaktadır. 1,3,8- diğer taraftan 10, spektroskopi teknikleri, örneğindağınık yansıma spektroskopisi olarak, fonksiyonel doku bilgi veren ve kantitatif birden organlarda kanser lezyonların saptanmasında klinik performans vaat göstermiştir doğru hedeflenir. 2,12-15
Bu nedenle, potansiyel olarak daha da gözlemciler değişkenliği azaltır, doku mikro mimarisi gerçek zamanlı bir görüntüleme elde ve doku sağlığı daha tam bir analiz sağlamaktır yöntemleri her iki tip içeren bir cihaz için bir ihtiyaç vardır. Bu amaca ulaşmak için, bir modelli prob tabanlı cihaz tek bir fiber optik prob iki modaliteleri birleştiren inşa edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi ve alt dağınık yansıma spektroskopisi apikal niteliksel yüksek çözünürlüklü görüntüler 11 Bu yöntem, ko-register yerel hemoglobin konsantrasyonu olmak üzere iki farklı doku derinliklerinden kantitatif spektral bilgi (fonksiyonel özellikleri) ile doku morfolojisi (yapısal özellikleri) ([Hb]), melanin konsantrasyonu ([Mel]), ve oksijen doygunluğu (SaO 2). 11,12,16 Bu özel alt dağınık yansıma spektroskopisi yöntemi sağlamak için iki eşsiz doku derinlikleri örnek iki kaynak detektör ayrımları (SDS'lerden) kullanan bazal membran ve altta yatan doku stroma aşağı örnekleme yoluyla doku sağlığını daha kapsamlı bir resim. 11
fiber probu yaklaşık 50,000 4.5 mikron çapında lif elemanlarının, 1.1 mm'lik bir kaplama çapı ve 1.2 mm bir kaplama çapı olan bir merkez 1 mm çaplı görüntü selülozdan oluşur. görüntü, fiber 220 um kaplama çapları beş 200 mikron çapında elyaf ile çevrilidir. Her 200 mikron modlu fiber uzak görüntü fiberin merkezine 864 um merkezden merkeze mesafe yer almaktadır. 200 mikron modlu liflerin her 25 ° arayla. "Kaynak" lif olarak soldaki 200 mikron modlu fiber ve ek th kullanarak"Toplama" elyaf olarak 200 mikron modlu fiberler REE, bu geometri mutlaka 374 mikron üç merkez-merkez SDS'lerden, 730 mikron, 1051 um ve 1323 um oluşturur. lif uçları lifler sabiti arasındaki mesafeleri tutan bir silindirik metal kasa içine alınır. silindirik metal gövdesinin çapı 3 mm 'dir. fiber-optik prob (fiber optik prob ucuna doğru) uzak uç 2 feet uzunluğunda. Bundan sonra, prob 4 feet toplam uzunluğu için, ek bir 2 feet uzunluğunda (enstrümantasyon doğru) proksimal ucunda, altı, ilgili tek tek lifler halinde ayrılır. 1 fiber optik prob bir temsilini göstermektedir.
Şekil 1:. Fiber optik prob tasarım fiber optik prob, bir 1 mm çapında görüntü fiber ve dört 200 um çoklu liflerden oluşur. Burakam temsillerini göstermektedir: (a) metal uç SDS'lere 374, 730 verim sonda ucunda liflerin geometri sınırlandırmaktadır kap ve en soldaki 200 mikron modlu fiber göre (Ölçek çubuğu ≈ 1 mm) 1051 um, (b) lifler lif çekirdeği, lif kaplama ve lif kaplama (Ölçek çubuğu ≈ 1 mm), (c) lifleri etrafında koruyucu poliamid kaplama (Ölçek çubuğu ≈ 1 mm) gösteren metal kap içinde kısıtlı olan, (d ), metal parmak kavrama ve tüm elyaf içeren tek bir siyah kablo (Ölçek çubuğu ≈ 4 mm) ve (e) sondası (Ölçek çubuğu ≈ 4 mm uzak ucunun bir resim) ile sondanın bitmiş distal uç. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu modlu enstrümantasyon ve ilgili Teknik içindiğer kombine yapısal / işlevsel teknikler farklı yöntemlerini birleştirmek var her ne kadar que, tek bir prob içinde bu yöntemlerin ilk kombinasyonudur. Örneğin, hiperspektral görüntüleme birkaç isim doku protein ekspresyonunun analizi, 19 optik koherens tomografi (OCT) birleştiren geliştirilen kantitatif hemoglobin ve melanin özellikleri, 17,18 ve diğer tekniklerle geniş alan görüntüleme birleştirir. Ağız boşluğunda kullanım için, bir el sonda alt gastrointestinal bölgede ve yemek borusu veya endoskopik kullanımı dahil çeşitli amaçlar için optimize edilebilir, genel fiber optik prob kullanan bir kompakt ve kolay uygulanması enstrümantasyon kurulumu ile ilgili bu madde raporları ve dış deri yerleştirme. 11,20
Bu enstrümantasyon için donanım yaygın yansıma spektrumları kazanmak ve daha sonra ortaya çıkan volum ayıklamak için özel veri toplama ve post-processing kodu hem de gerektirir[Hb], [Mel], ve SaO 2 olmak üzere, e-ortalama doku fizyolojik parametreler. özel veri toplama kodu (yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu için) bir kameradan aynı anda satın alma ve (dağınık yansıma spektroskopisi için) bir spektrometre izin inşa edilmiştir. Sürücüler genellikle programlama dilleri ile çeşitli entegrasyon sağlamak için üreticilerin web sitelerinden temin edilebilir. Özel post-processing kod in vivo [Hb] ve [Mel] 21 a priori emme değerleri ithal ve daha sonra spektrumları ile donatılmış bir eğri oluşturur önce geliştirilen doğrusal olmayan optimizasyon uydurma işlemini kullanır. 22 monte eğri minimize tarafından inşa edilmiştir kendisi ve ham spektrumları arasındaki χ 2 değeri donatılmış eğrisinden ve en X2 değeri. 22 kod doku fizyolojik parametreleri ([Hb], [Mel], Sao 2) belirlemek içerecek şekilde modifiye edilebilirBurada kullanılan dışsal pyranine mürekkep gibi diğer kromoforlar, absorpsiyon, yani hedef fizyolojik parametreler etkilenmez.
Örneğin [Hb], [Mel] ve SaO 2, doku sağlık fizyolojik göstergeleri, tedavi tümör yanıtı rapor olarak veya lokal vaskülarizasyon ve anjiyojenez göstergeleri olarak kullanılabilir. 14,23, yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntemi de dahil olmak üzere kılavuz prob yerleştirme yardımcı olur ve epitel doku yapısı ve fonksiyonu arasındaki ilişki daha tam bir resim ile araştırmacılar sağlar. Bu makalede, inşaat ve modelli mikroendoskop uygulaması tarif edilmektedir. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı (KİK # 15-09-149) Bu çalışmanın tüm yönleriyle Arkansas Üniversitesi İnsan Denekler araştırma programından elde edilmiştir. Tarif edilen yöntemler, onaylanan kurallara uygun olarak gerçekleştirildi ve bilgilendirilmiş rıza Tüm katılımcılardan elde edildi.
Yüksek çözünürlüklü Floresan Mikroendoskopi Şekli 1. Meclis
Not: Yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntemi montajı için belirtilen adımlar Şekil 2'de görülebilir.
- 30 mm Kafes Cube içinde bir 470 nm Dikroyik Ayna yerleştirin.
- 30 mm kafes küp elde edilir ve dikroik filtre monte kaldırın.
- montaj dikroik filtreye 470 nm dikroik ayna yerleştirin.
- Yeniden ekleme ve dikroik filtre geri kafes küp içine monte sabitleyin.
- 30 mm Kafes Cube Kafes Meclisi Çubuk takın.
- Güvenlikafes küpün önüne dört 1,5 inç kafes montaj çubuklar.
- kafes küp sağ tarafında dört 3.0 inç kafes montaj çubukları sabitleyin.
- çapraz kafes küp sol tarafındaki Secure iki 2.0 inç kafes montaj çubuklar.
- Bir Kafes Plaka / Mercek Boru Montaj oluşturun.
- 1.0 inçlik dişli 30 mm kafes plakası elde ve sağlanan diş kullanarak kafes plakasının içine bir stressiz tespit halkasını takın.
- stressiz tutma halkasına bir 1.0 inçlik lens tüp vidalayın.
- İkinci 1,0 inç 1,0 inç lens tüp 30 mm kafes plaka dişli takın ve iki kafes plakaları aynı hizada olacak şekilde standart tutma halkalarını ayarlayın.
- 30 mm Kafes Cube Sol Tarafının üzerine 1.0 inçlik Kafes Plaka / Mercek Boru Montaj kaydırın.
- Sağ açılı ayna düzeneği monte oluşturun.
- dik açılı ayna montaj ve 1.0 inç UV gelişmiş alüminyum ayna alın.
- 1.0 inc yerleştirinh montaj ve sıkın aynaya alüminyum ayna UV geliştirilmiş.
- montaj ayna önünde dört 2,0 inç kafes montaj çubukları Güvenli
- çapraz kafes küp sağ tarafında güvenli iki 2.0 inç kafes montaj çubuklar.
- 30 mm kafes plakasının ilgili açıklıklardan rakip kafes montaj çubuklar koyarak dik açılı ayna 1.0 inç kafes plakası / lens tüp montajı sol tarafında üzerine montaj monte bağlayın.
- z-ekseni çeviri aksamının sağ tarafında 3.0 inç kafes montaj çubuklar aracılığıyla monte geçirin.
- z ekseni çeviri montaj için 10X akromatik objektif lens takın.
- 1.0 inç elyaf adaptör plaka / XY ekseni çeviri lens takımı montaj oluşturun.
- xy ekseni çeviri montaj ve 1.0 inç lif adaptör plakasını alın.
- xy ekseni çeviri lens montaj içine 1.0 inç lif adaptör plakasını sabitleyin.
- slayt to 1.0 inç elyaf adaptör / xy ekseni çeviri lens objektif lens önünde montaj monte.
- İki 0,5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı mercek tüpleri, tek 440/40 nm bant geçiş filtresi (uyarma filtresi) ve bir 525/36 nm bant geçişi filtresi (emisyon filtresi) edinin.
- filtrenin dışına ok dış dişli objektif borunun yan bakacak şekilde, bir 0.5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı mercek tüp içinde, her filtre yerleştirin.
- montaj için filtreleri takın.
- iki standart tutma halkaları edinin.
- Standart istinat halkaları ile 0,5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı mercek tüpler içinde filtreleri sabitleyin.
- 30 mm kafes küp önüne uyarma filtresi ile objektif tüp vida ve sağ açı aynaya monte emisyon filtresi ile objektif tüp vidalayın.
- Dik açılı ayna monte ön emisyon filtresi ile 0,5 inç lens tüp vidalayın.
- Obtain iki 1,0 inç 30 mm kafes plakaları dişli ve filtreleri içeren 0,5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı mercek tüplerin önünde koyun.
- epoksi veya güçlü bir yapıştırıcı kullanarak, uyarma filtresine bağlı kafes plakasına LED nm 455 ekleyin.
- bir 0,5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı mercek tüp ve 50 mm odak uzunluğuna sahip bir 1.0 inç akromatik çiftler tüp lensi alın.
- Lensin dış ok dış dişli ile objektif tüp tarafına bakacak şekilde mercek tüp içinde tüp lensi yerleştirin.
- montaja tüp lens vidalayın.
- bir standart tespit halkasını edinin.
- Standart istinat halkası ile 0,5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı mercek tüp içindeki lense sabitleyin.
- en soldaki kafes plakasına tüp lens lens tüp takın.
- tüp lens içeren 0.5 inç uzunluğunda, 1.0 inç çaplı lensi borunun önünde bir 30 mm kafesli plakasını.
- takın bir 30 mm kafes plakasının içine stressiz tutma halkası.
- stressiz istinat halkası ile kafes plakasına USB monokrom kamera takın.
- Optik sonrası montaj cihazları Construct.
- Dört 0,5 inç yazılan sahipleri, dört 0,5 inç optik mesajları ve dört montaj tabanları edinin.
- 0,5 inç sonrası sahipleri içinde 0,5 inç optik mesajları sabitleyin.
- montaj tabanlarında üzerine 0,5 inç sonrası sahipleri sabitleyin.
- 30 mm kafes küp altında bulunan vida deliklerine dört optik sonrası montaj cihazlarda vida, dik açılı ayna, LED bağlı kafes plaka ve kameraya bağlı kafes plakası monte edin.
- dört yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntemi inşaatı bitirmek için bir optik breadboard veya optik masaya ya cihazları montaj optik yazı vidalayın.
ftp_upload / 54564 / 54564fig2.jpg "/>
Şekil 2:. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntemi Meclisi yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntem dikroik ayna ele alınan özel bakım ile, 1.0 inç çaplı boyutlu bileşenlerin bir kabuk oluşturarak inşa edilebilir, objektif lens, uyarma / emisyon filtreleri ve tüp lens. Bu bileşenlerin cam yüzeyler dikkatlice mercek kağıdı kullanılarak ele alınması gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Alt yaygın Yansıtma Spektroskopisi Şekli 2. Montaj
Not: Alt yaygın yansıma spektroskopisi yöntemi montajı için belirtilen adımlar Şekil 3'te görülebilir.
- epoksi ya da güçlü bir yapıştırıcı kullanılarak, bir tungsten-halojen ışık kaynağı elde etmek ve bir 1.0 inç threade emniyeteön üzerine d 30 mm kafes plakası.
- kafes plakasına dört 3.0 inç kafes montaj çubukları sabitleyin.
- z-ekseni çeviri kafes montaj çubukları monte takın.
- z ekseni çeviri monte 20X akromatik objektif lens vidalayın.
- Bir elyaf adaptör plaka / XY ekseni çeviri lens takımı montaj oluşturun.
- xy ekseni çeviri montaj ve 1.0 inç lif adaptör plakasını alın.
- xy ekseni çeviri lens montaj içine elyaf adaptör plakasını sabitleyin.
- 1,0 inç elyaf adaptörü / XY-çeviri objektif lens önünde tertibatını monte kaydırın.
- Motor kolu tertibatını oluşturmak.
- özel olarak oluşturulmuş alüminyum motorlu kol ve bir SMA lif adaptör plakasını alın.
- (Dahili parçacığı ile) alüminyum motor kolu içine (harici parçacığı ile) lif adaptör plakası vidalayın.
- Dört # 4-40 0.5. vidalar motor koluna özel yapılmış alüminyum motor kolu adaptörünü takın.
- Motor / Motor kol / motor gövdesi donanımını kurmak.
- özel olarak oluşturulmuş alüminyum motor gövdesi ve 400 adım adım motorunu edinin.
- Daha sonra vida step motor ve motor gövdesi üzerindeki delikler ve yukarı çizgi dört # 4-40 0,5 inç vida ile sabitleyin.
- Motor kol takımının açıklıktan step motor dönen motorun çubuğunu Yem ve alüminyum motor kolu adaptörü üzerindeki kilitleme vidasını sıkın.
- optik anahtar düzeneğini kurmak.
- Özel oluşturulmuş alüminyum optik anahtarı ve üç 1,0 inç lif adaptör plakaları edinin.
- Optik anahtarı dişli deliklere adaptör plakaları Konu.
- Dört # 4-40 0,5 inç vida ile optik anahtarı üzerine özel yapılmış alüminyum optik anahtar yüz plakasını takın.
- t merkezi delikten step motor dönen motorlu çubuk besleyerek optik anahtarı motor / motor kol / motor gövdesi donanımını takınO optik anahtarı.
- bir elektrik devre kartını ve step motor sürücüsünü edinin, ve sonra breadboard merkez oluk boyunca step motor sürücüsü yerleştirin.
- Step motor sürücüsü için (Şekil 3, 2.12), 12 V güç kaynağı ve step motor elektrik bağlantısı şemasını gözlemleyin.
- Motorlu optik anahtarın inşaatı tamamlamak için devre şemasına (Şekil 3, 2.12) 'de belirtildiği gibi step motor sürücüsü, 12 V güç kaynağı ve step motoru bağlayın.
- Daha önce inşa yakın bir optik breadboard veya optik tablo (Şekil 2, 1.24) yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi montaj geçiş bileşenleri ve tungsten-halojen ışık kaynağı optik vidalayın.
- Bir 550 um bir ucunu motor kol takımının 1,0 inç lif adaptör plakaya 0.22 NA yama kablosu takın.
- 550 mikron diğer ucunu, elyaf 0.22 NA patch kablo bağlamakveya USB spektrometresi.
- modelli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve alt dağınık yansıma spektroskopisi fiber demeti mikroendoskop tamamlanmasını bitirmek için enstrümantasyon üzerindeki ilgili 1,0 inç lif adaptör plakaları beş uzak prob kabloları vidalayın.
- Adım 1.9.2 belirtilen 1,0 inç lif adaptör plakaya merkezi 1 mm çaplı görüntü fiber kablo vidalayın.
- Adım 2.6 belirtilen 1,0 inç lif adaptör plakaya soldaki 200 mikron modlu fiber kablo vidalayın.
- Adım 2.9.2 belirtilen tungsten-halojen lamba bağlı soldaki 1.0 inç elyaf adaptörü 2. 200 mikron modlu fiber kablo vidalayın.
- Adım 2.9.2 belirtilen orta 1,0 inç lif adaptör plakaya 3. 200 mikron modlu fiber kablo vidalayın.
- Adım 2.9.2 belirtilen sağdaki 1,0 inç lif adaptör plakaya 4. 200 mikron modlu fiber kablo vidalayın.
Şekil 3:. Alt yaygın yansıma spektroskopisi yöntemi Meclisi alt dağınık yansıma spektroskopisi yöntemi 200 mikron modlu teslim fiber üzerinden ışığı odaklamak için bir objektif lens bağlanmış bir temel tungsten-halojen lamba kullanılarak inşa ve spektrometre edilebilir. Buna ek olarak, özel bir dahili motorlu optik anahtar her SDS arasında geçiş yapmak için lamba fiber-spektrometre yolu içinde inşa edilebilir. Optik anahtar bileşeni atlayabilir birden SDS dan elde etmek için birden fazla spektrometre kullanılarak Müfettişler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.Alt yaygın Yansıtma Spektroskopisi Şekli 3. Kalibrasyon
Not: following adımlar (Bölüm 3) spektral veri toplama (bölüm 4) öncesinde tamamlanması gerekir.
- 455 LED nm, genişbant tungsten-halojen lamba, CMOS kamera, USB spektrometre, step motor ve motor kontrol kurulu dahil enstrümantasyon tüm bileşenleri, açın. tungsten-halojen lambası deklanşör açık olduğundan emin olun.
- Tüm ortam ışığı kapatın.
- özel veri toplama yazılımı açın.
- Uygun bir sıcaklığa ulaşması lamba için 30 dakika boyunca ve stabilize etmek spektrometre gelen doğal gürültü çalışan ekipman tutun.
- özel yapılmış, 3D baskılı kalibrasyon standart cihazın alt açılıĢında% 20 yaygın yansıma standardını yerleştirin.
- Geleneğin en soldaki yuvaya içinde fiber optik prob yerleştirin, 3D Şekil 4'te gösterildiği, lif tutucu basılmış. En soldaki yuva 2.1 mm, en yansıma standardına fiber optik prob ucundan dik mesafe giderir optimum mesafe hangi spektrometre ulaşan sinyal 374 mikron ilk SDS için maksimize edilir.
- spektrometre 374 um ilk SDS bağlanır, öyle ki en sol konumuna motorlu optik anahtar ayarlayın.
- 500 msn entegrasyon süresini ayarlayın. spektrometre doyurmak ama pratikte düşük entegrasyon süresini korumak için bu entegrasyon süresi seçilmelidir.
- Yazılımda "Spectrum Edinme" tıklayarak bir spektrum, R max, 374μm, kazanır.
- Yazılımda "Spectrum Edinme" tıklayarak, arka plan gürültüsünün, 374μm tungsten-halojen lambası deklanşör kapatın ve bir spektrum R karanlık kaydedin. edinilen kez, bir kez daha deklanşöre açın.
- Özel sağdaki yuvaya içinde fiber optik prob yerleştirin, 3D Şekil 4'te gösterildiği, lif tutucu basılmış. Sağdaki yuva fiber o gelen dik mesafe giderirspektrometre ulaşan sinyal 730 mikron ikinci SDS için maksimize edildiği optimum mesafe 3,9 mm yansıma standart, ptic prob ucu.
- spektrometre 730 um ikinci SDS bağlı şekilde orta konumuna motorlu optik anahtar ayarlayın.
- Yazılımda "Spectrum Edinme" tıklayarak bir spektrum, R max, 730μm, kazanır.
- Yazılımda "Spectrum Edinme" tıklayarak, arka plan gürültüsünün, 730μm tungsten-halojen lambası deklanşör kapatın ve bir spektrum R karanlık kaydedin.
- bir kez daha deklanşöre açın.
Şekil 4:. Alt yaygın yansıma spektroskopisi yöntemi kalibrasyonu öncesi deneysel kalibrasyon için, fiber optik prob ucu farklı yerleştirilmelidirSDS bağlı% 20 dağınık yansıma standardından dik mesafeler. Sürekli olarak tüm deneyler boyunca, bu dikey mesafe elde etmek için, bir ölçü ayarı cihazı 20% dağınık yansıtıcılık standarttan tesisinin mesafelerde probu tutmak için ((a) 'da gösterilen cihaz bir kesite) tasarlanmıştır. Bu özel fiber optik prob kurulumunda, tungsten halojen lamba ışık kaynağı-dedektör ayrımları optik anahtarı ile gösterilir, (b) 374 mikron ve 730 mikron (optik yol kaldırıldı Motor ve motor kolu ile (c) açıklık için). (D) Mesafeler 2.1 374 mikron SDS için mm, ve (e) 730 mikron SDS Kalibrasyon için gerekli olan 3.9 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.İn Vivo Veriler Acquisitio 4.İnsan Cilt dan n ve Optik Mülkiyet çıkarımı
Bu bölümde, modelli mikroendoskop tekniği, in vivo insan cildi üzerinde gösterilecektir.
- özel veri toplama yazılımını açın ve "Entegrasyon Time" tıklayarak spektrometre entegrasyon süresini ayarlamak ve bu durumda (adım 3.8) 500 msn olan kalibrasyon sırasında aynı şekilde ayarlayın.
- Araştırmacının uygulamaya farklılık gösterebilir verileri elde etmek için cilt alanı belirlemek. Bu durumda, önkol ince deri bir gösteri olarak seçildi.
- cilt alan saç içeriyorsa, tek kullanımlık steril ustura ile saç kaldırmak.
- pyranine mürekkep içeren bir standart sarı vurgulayıcı, elde etmek ve hafifçe seçilen cilt alanını işaretleyin.
- 455 nm LED açın ve tungsten-halojen lamba için deklanşöre kapatın.
- cilt ile hafif temas probu yerleştirin.
- Sonda a taşıdoku lekeli alana yuvarlak yazılımı görüntüleme penceresinde apikal keratinosit mimarisinin canlı yüksek çözünürlüklü beslemesini görüntülemek için.
- Yazılımda, "Poz Time" ve "Gain" linkine tıklayarak uygun değerleri yazarak ve ardından "Ayarları Uygula" tıklayarak, görüntü doygunluğu önlemek için, 150 milisaniye ve bu durumda 10 dB kazanç, uygun bir pozlama süresi ve kazanç seçin arayüzü.
- yazılım arayüzü de "Edinme Image" tıklayarak bir görüntü kazanır.
- Aynı görüntü yerinde prob tutarken, 455 nm LED kapatın ve tungsten-halojen lamba için deklanşöre açın.
- spektrometre 374 mikron ikinci SDS bağlanır şekilde sol pozisyona motorlu optik anahtarını ayarlayın.
- Yazılım arayüzü de "Spectra Edinme" tıklayarak, spektrumları, R dokusu, 374μm kazanır.
- orta pozisyonu gibi th Motorlu optik anahtarını ayarlayınspektrometresi 730 um ikinci SDS bağlanır.
- Yazılım arayüzü de "Spectra Edinme" tıklayarak, spektrumları, R dokusu, 730μm kazanır.
- Özel post-processing yazılımını açın.
- Yazılım tarafından istendiğinde verilerin kaydedildiği klasörden iki in vivo spektrumları "Çalıştır" tıklayarak post-processing yazılımı çalıştırın ve yüksek çözünürlüklü floresan görüntü, dört kalibrasyon spektrumları seçin ve.
NOT: özel yazılım aşağıdaki denklemler kullanılarak gerçek mutlak yansıma (R abs, 374μm ve R abs, 730μm) alır.
sonrası işlem kodu, daha önceden tarif edildiği gibi, dağınık yansıtıcılık spektrumları ile donatılmış bir eğri hesaplar (denklem 1 ve 2) ve daha sonra dete([Hb], [Mel], ve SaO 2) de dahil olmak üzere doku fizyolojik parametreleri rmines. 11,22,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol ardından, araştırmacı bakış tam alan (Şekil 5) ile doku sitenin içinde odak yüksek çözünürlüklü görüntü elde edecek. Bir standart sarı İşaretleyici'den pyranine mürekkeple boyanmış bu tür proflavine bir boya ile boyanmış, eğer tek tek hücre çekirdekleri görülebileceği ise hücrelerin ana hatları görülebilir. Spektral satın alınmasının ardından, post-processing yazılım alt dağınık yansıma spektrumları uygun ve [Hb], [Mel değerlerini belirlemek için in vivo hemoglobin konsantrasyonu ([Hb]) ve melanin konsantrasyonlarında ([Mel]) 21 a priori bilgi kullanır ] ve doku oksijen doygunluğu, Şekil 5'te gösterildiği gibi (SaO 2). sonrası işlem programı, geniş bir fizyolojik sınırları kullanır ([Hb] = 0-150 mg / ml [Mel] = 0-30 mg / ml, Sao 2 =% 0-100) kalibre spektrumları sığdırmak için. 21
Şekil 5:. Eş-kayıt in vivo insan normal deri ve benign melanositik nevus gelen nitel ve nicel verilerin bir yüksek çözünürlüklü floresan görüntü (bir standart sarı vurgulayıcı itibaren) bir pyranine-mürekkep elde edilmiştir benign melanositik nevüs ve komşu normal deri lekeli 150 msn bir pozlama süresi ile doku. keratinositlerin ana hatları açıkça her iki görüntülerde görünür olabilir. Normal cilt dokusu sitesi ve melanositik nevüs 0.78 ve 10.20 mg 1.63 ve 0.86 mg / ml, melanin konsantrasyonları hemoglobin konsantrasyonları / ml, sırasıyla,% 99 benzer oksijen satürasyonu ile. Bu rakam eş kayıt nitel yapısal ve nicel fonksiyonel bilgilerin yararını göstermektedir. Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
modelli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve burada rapor alt dağınık yansıma spektroskopisi fiber demeti mikroendoskop optimize edilmiş ve insan veya hayvan çalışmaları için endoskopik veya el kullanımı dahil çeşitli uygulamalar için araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Bu nedenle iki farklı doku derinliklerinden hemoglobin konsantrasyonunun melanin konsantrasyonu ve doku oksijen doygunluğu ölçümleri yanında vivo apikal doku mikro mimarisinde görselleştirmek için esnek bir yöntem sağlar. Bu makalede, fluoresan kontrast maddesi olarak pyranine mürekkep kullanılarak, yüksek çözünürlüklü bir sistem ve alt dağınık yansıtıcılık görüntüleme sistemi monte edilmesi için bir protokol ana hatları ve in vivo insan dokularında uygulanmasını gösterilen fiber optik prob için özellikleri açıklanmaktadır doku görselleştirme. Bu proflavine ya da floresana gibi diğer boyalar, yerine uygun onayı ile pyranine mürekkep kullanılabilir. 4-7,11
"> Herhangi bir prob özelliği, bu tasarım modifiye edilebilir. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntemi için, 1 mm çapında bir görüntü, fiber 4.5 um sabit bir alt hücresel uzaysal çözünürlük sonuçlanan 4.5 um aralığı ile 50.000 bireysel çekirdek liflerin oluşuyordu 0.14 ve 1.40 mm. 50 mm odak uzaklığına sahip bir tüp objektif arasındaki çaplarda hazır bu görüntü lifleri bulabilirsiniz küçük veya daha büyük alan-görünümü elde etmek için farklı bir boyutta görüntü fiber isteyen. Müfettişler CMOS sensör şekilde seçildi tam 1 mm alan-view görüntü fiberden ele geçirdi. büyütme ve örnekleme sıklığını artırmak, ancak alan-view azalacak tüp lens odak uzunluğunu artırarak, objektif lens sabit tutarak zaman. 11 Böylece, büyütme objektif lens, odak tüp lens uzunluğu, görüntü sensörünün boyutu ve görüntü lif büyüklüğü ve ihtiyaca göre optimize edilmelidir olabilir. Son olarak, filtreler ve uyarma ışıkKaynak floresan boyalar uyarım / emisyon spektrumları bağlı olarak değiştirilebilir. 4-7 prob ve yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi aletleri değiştirmenin yanı sıra, alt dağınık yansıtıcılık spektroskopisi aletleri değiştirilebilir.alt dağınık yansıtıcılık spektroskopisi yöntemi, farklı büyüklükte modlu fiberler, her SDS de kullanılabilir. Küçük çaplı modlu fiberler teslim ve daha küçük bir alana ışık toplamak mümkün olacak, ancak lif çapları az 200 mikron kullanılması halinde sinyal-gürültü artırmak için aynı aralıklı liflerin bir dizi kullanılması tavsiye edilir. deri veya ağız dokuları analiz Müfettişler, araştırmacılar prob boyutu ile ilgili ilave kısıtlamalar karşı karşıya gelecek, saha-view ve sinyal-gürültü, ancak bu tür yemek borusunda veya gastrointestinal olarak dar aydınlık organlarda artırmak için genel bir büyük prob yararlanabilir özellikle manastır biyopsi portu ile uyumluluk içinional endoskoplar. modifiye edilebilir 8 Diğer spektroskopi parçalar genişbant ışık kaynağı ve motorlu optik anahtarı bulunmaktadır. Diğer ışık kaynakları ve sinyal-gürültü ve alt entegrasyon kat artabilir ksenon ark lambaları ve LED'ler de dahil olmak üzere, diğer çalışmalar kullanılmıştır, ancak bir tungsten halojen lambası, bu durumda seçilmiştir. 2,15,20 motorlu optik anahtar burada sunulan özel üç SDS kadar işlemek için inşa edildi, ancak fazla veya daha az girişleri içerecek şekilde modifiye edilebilir. Motorlu optik anahtar sinyal-gürültü azaltılması, geniş bant ışık kaynağı ve spektrometre arasında ek bir optik bileşen eklemek olmadığını belirtmek gerekir. Anahtar aynı anda veri elde birden spektrometre ile araştırmacılar için gerekli olabilir, ancak bir optik anahtar bileşeni de dahil olmak üzere sonuçta SDS başına yaklaşık $ 3,000 USD ile enstrümantasyon maliyetini düşürür olmayabilir.
enstrümantasyon İnşaatı (
sorun giderme ile ilgili olarak, spektrumları yoksul uyan sonuçlanan (ortalamaYüzde hataları ham veri ve monte veriler arasında% 10'dan fazla), üç doku fizyolojik parametreler için güvenilmez değerleri verecektir ([Hb], [Mel], ve SaO 2) Burada sunulan. Kötü uyan veri toplama sırasında prob ve cilt sitesi arasındaki hareketin ya büyük olasılıkla sonucudur, post-processing kodu veya [Hb] ve [Mel]. 11,21,24 güvenilmez önsel değerleri dar sınır koşulları, bu üç genel hata oluşumları 26 İyileştirmeler alt dağınık yansıma spektrumları doğru takılmasını düzeltmek gerekir. Böylece, veri toplama spektrumları içinde hareket eserler azaltmak için spektrometre entegrasyon süresini azaltarak geliştirilebilir. Ayrıca, sınır şartları post-processing aşağıdaki [Hb], [Mel], ve SaO 2 için olası hesaplama çıkış değerlerinin aralığını temsil etmektedir. Bu çalışmalarda, sınır koşulları, [Hb] için 0-10 mg / ml, SaO 2 [Mel] için 21,22 0-40 mg / ml, 27,28 ve% 0-100 idi
Bu multimodal görüntüleme ve spektroskopi fiber demeti mikroendoskopi platformu birincil sınırlama geniş açılı görüntüleme yöntemi olmamasıdır. yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi yöntemi hızla dokusunun büyük bir alanını taramak için güçleştirir, çapı 1 mm dairesel alan-of-görünüme sahiptir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmenin bir hesaplama yöntemi görüntü mosa olduğunuIcking, kullanılan bir tekniktir, tek bir büyük resim haritası içine bitişik mikro ölçekli görüntüleri istifleme tarafından daha geniş bir alanı-view sağlamak. 10 Böyle bir görüntü Mozaikleme önce Prieto ve arkadaşları tarafından ortaya konmuştur. kolon görüntü özelliklerini araştırmak için. 10 bir bu sınırlamayı aşmak için enstrümantasyon modifikasyon gibi Parikh ve ark tarafından sunulan sonda olarak, geleneksel bir endoskop biyopsi portu ile prob uyumlu hale olacaktır. kolorektal neoplazi araştırmak için. 8 Bu özellik, geniş alan-view avantajlarını birleştirir yüksek çözünürlüklü floresan mikroendoskopi mikro ölçekli görüntüleme ile. 8
Genel olarak, bu teknik in vivo insan cildi üzerinde gösterdi ve altta yatan melanin konsantrasyonu, hemoglobin ve doku oksijen doygunluğu (Şekil 5) ile birlikte kayıt yüksek çözünürlüklü doku mikro-mimari görüntülerin değerini gösterir oldu. bu teknigiique gözlemlenebilir yapısal değişikliklerin yokluğunda in vivo olarak yapısal ve fonksiyonel doku anormallikleri arasındaki bağlantıyı ya da analiz doku fonksiyonel değişiklikleri araştırmak isteyen araştırmacılar tarafından da kullanılabilir. Gelecekteki çalışmalar çeşitli epitel hastalık durumlarında bu tekniğin uygulanabilirliğini araştırmak olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
