Abstract
Recente fiber-bundel microendoscopy technieken in non-invasieve analyse van in vivo weefsel met behulp van beeldvormende technieken of een combinatie van spectroscopie technieken. Het combineren imaging en spectroscopie-technieken in een enkel optische sonde kan een vollediger analyse gezondheidstoestand weefsel verschaffen. In dit artikel worden twee ongelijke modaliteiten gecombineerd, hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy beeldvorming en diffuse reflectie spectroscopie, in een enkele optische sonde. Hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy beeldvorming is een techniek om weefsel apicale micro-architectuur visualiseren en, hoewel veelal een kwalitatieve techniek is doeltreffend realtime onderscheid tussen neoplastische en niet-neoplastische weefsels aangetoond. Diffuse reflectie spectroscopie is een techniek die weefsel fysiologische parameters kan extraheren waaronder lokale hemoglobinegehalte, melanine concentratie en zuurstofsaturatie. Dit artikel beschrijft de specificaties rerplicht aan de glasvezel-sonde te bouwen, hoe de instrumenten te bouwen, en dan toont de techniek voor in vivo menselijke huid. Dit werk is gebleken dat het weefsel micro-architectuur, in het bijzonder apicale huid keratinocyten, kan mede worden geregistreerd bij de bijbehorende fysiologische parameters. De instrumenten en vezel-bundel probe gepresenteerde geoptimaliseerd worden ofwel een handheld of endoscopisch-compatibel apparaat voor gebruik in verschillende orgaansystemen. Aanvullend klinisch onderzoek is nodig om de haalbaarheid van deze techniek verschillende epitheliale ziektetoestanden testen.
Introduction
Fiber-bundel microendoscopy technieken doorgaans analyseren vivo weefsel met behulp van beeldvormende technieken of combinatie van technieken spectroscopie. 1-3 Een dergelijke beeldvormende techniek, hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy, kan het weefsel apicale micro-architectuur met subcellulaire resolutie in een klein , microschaal field-of-view, onder toepassing van een topische contrastmiddel zoals proflavine, fluoresceïne of pyranine inkt. 1,3-11 Deze beeldvormingstechniek blijkt veelbelovende klinische prestaties in kwalitatief differentiëren zieke en gezonde epitheelweefsel in real-time met lage inter-observer variabiliteit. 8 Af en toe zal de onderzoekers fluorescentiemicroscopie data met een hoge resolutie te gebruiken om kwantitatieve functies zoals mobiele en nucleaire grootte of klier gebied halen, maar dit blijft vooral een kwalitatieve techniek gericht op het visualiseren van weefsel morfologie. 1,3,8- 10 anderzijds, spectroscopie technieken, zoalsals diffuse reflectie spectroscopie, zijn gericht op het verstrekken van functionele tissue informatie en hebben aangetoond veelbelovende klinische prestaties in kwantitatief vaststellen van kanker in meerdere organen. 2,12-15
Daarom is er een behoefte aan een inrichting waarin beide soorten modaliteiten verder kunnen verminderen inter-observer variabiliteit handhaven real-time visualisatie van weefsel micro-architectuur en een meer volledige analyse van gezondheid weefsel. Om dit doel te bereiken, werd een multimodaal probe-gebaseerde instrument gebouwd dat twee modaliteiten in één glasvezel-sonde combineert:. Hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy en sub-diffuse reflectie spectroscopie 11 Deze methode co-registers kwalitatief hoge-resolutie afbeeldingen van apicale weefsel morfologie (structurele eigenschappen) met kwantitatieve spectrale informatie (functionele eigenschappen) uit twee afzonderlijke weefsel dieptes waaronder lokale hemoglobinegehalte ([Hb]), melanine concentratie ([Mel]), en zuurstofverzadiging (São 2). 11,12,16 Dit specifieke sub-diffuse reflectie spectroscopie modaliteit maakt gebruik van twee source-detector scheidingen (VIB's) aan twee unieke weefsel dieptes proeven te voorzien een meer volledig beeld van de gezondheid van het weefsel door middel van steekproeven naar de kelder membraan en het onderliggende weefsel stroma. 11
De vezel-sonde bestaat uit een centrale 1 mm diameter beeld vezel met ongeveer 50.000 4,5 urn diameter vezelelementen, een mantel diameter van 1,1 mm en een totale coating diameter van 1,2 mm. Het beeld vezel wordt omringd door vijf 200 micrometer diameter vezels met een bekleding diameters van 220 urn. Elke 200 pm multimode vezel ligt een hart op hartafstand van 864 urn van het midden van het beeld vezel. Elk van de 200 um multimode vezels 25 ° uit elkaar. Met behulp van de meest linkse 200 urn multimode fiber als de "bron" vezels, en de extra three 200 um multimode vezels als "verzameling" vezels, creëert deze geometrie noodzakelijkerwijs drie center-to-center VIB van 374 um, 730 um, 1051 um en 1323 um. De vezelpunten zijn ingesloten in een cilindrische metalen behuizing die de afstanden tussen vezels constant blijft. De diameter van de cilindrische metalen behuizing is 3 mm. Het distale uiteinde (naar de vezeloptische sonde tip) van de vezeloptische sonde 2 voet lang. De sonde scheidt vervolgens in de zes verschillende individuele vezels bij het proximale uiteinde (naar de bezetting) wat een extra 2 voet lang, voor een totale lengte van 4 voet. Figuur 1 toont een weergave van de vezeloptische sonde.
Figuur 1:. Fiber-optische sonde ontwerp van de glasvezel-sonde bestaat uit een 1 mm diameter image vezel en vier 200 pm multimode vezels. Dezefiguur toont voorstellingen van (a) de metalen einddop die de geometrie van de vezels dringt bij de meetsonde SDS van 374, 730 geven, en 1051 urn ten opzichte van de meest linkse 200 urn multimode vezel (schaalmaat ≈ 1 mm), (b) de vezels wordt beperkt binnen de metalen kap, waarin de vezel kernen, vezelbekleding en vezelbekleding (schaalmaat ≈ 1 mm), (c) de beschermende polyamide omhulsel rond vezels (schaalmaat ≈ 1 mm), (d ) de afgewerkte distale punt van de sonde, met de metalen vingergreep en enkele zwarte kabel die alle vezels (schaalmaat ≈ 4 mm), en (e) een beeld van de distale punt van de sonde (schaalmaat ≈ 4 mm). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze multimodale instrumentatie en bijbehorende technique is de eerste combinatie van deze modaliteiten binnen één sonde, hoewel andere gecombineerde structurele / functionele technieken bestaan die verschillende modaliteiten combineren. Bijvoorbeeld hyperspectrale combineert wide-field imaging kwantitatieve hemoglobine en melanine eigenschappen, 17,18 en andere technieken zijn ontwikkeld die optical coherence tomography (OCT) combineren met analyse van weefsel eiwitexpressie 19 te noemen. Dit artikel doet verslag van een compact en eenvoudig te implementeren instrumentatie opstelling die een algemene vezeloptische sonde die kan worden geoptimaliseerd voor verschillende doeleinden, waaronder endoscopisch gebruik in het lagere maagdarmkanaal en slokdarm of handheld probe voor toepassing in de mondholte gebruikt en externe huid plaatsing. 11,20
De hardware van deze instrumenten vereist zowel aangepaste data-acquisitie en post-processing code om diffuse reflectie spectra te verwerven en vervolgens te extraheren de resulterende volum-e gemiddelde weefsel fysiologische parameters, waaronder [Hb], [Mel], en São 2. De aangepaste data-acquisitie code werd gebouwd om de gelijktijdige aankoop van een camera (voor hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie) en een spectrometer (voor diffuse reflectie spectroscopie) mogelijk te maken. Drivers zijn vaak van websites de fabrikant integratie met verschillende programmeertalen mogelijk. De aangepaste post-processing code importeert a priori absorptie waarden van in vivo [Hb] en [Mel] 21 en vervolgens maakt gebruik van een eerder ontwikkelde lineaire optimalisatie fitting proces dat een ingerichte curve van de spectra creëert. 22 De ingebouwde curve wordt gebouwd door het minimaliseren van de χ 2 waarde tussen zichzelf en het ruwe spectrum en de bepaling van de weefsel fysiologische parameters ([Hb], [Mel] en SaO 2) van de gefitte curve en de laagste waarde χ 2. 22 de code kan worden aangepast om onderabsorptie van andere chromoforen ook, zoals de exogene pyranine inkt hier wordt gebruikt, zodat de beoogde fysiologische parameters worden niet beïnvloed.
Fysiologische indicatoren voor de gezondheid weefsel, zoals [Hb], [Mel] en SaO 2, kan worden gebruikt als meldingen van tumor respons op therapie of als indicatoren van lokale vascularisatie en angiogenese. 14,23 inclusief hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit helpt gids sonde plaatsing en biedt onderzoekers met een meer volledig beeld van de relatie tussen epitheelweefsel structuur en functie. In dit artikel, de bouw en de toepassing van de multimodale microendoscope wordt beschreven. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Review Board goedkeuring (IRB # 15-09-149) werd verkregen uit de Human programma Onderwerpen Onderzoek aan de Universiteit van Arkansas voor alle aspecten van deze studie. De beschreven methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen uitgevoerd, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers.
1. Vergadering van de hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy Modality
Opmerking: De geschetste stappen voor de assemblage van de hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit kan in figuur 2 zichtbaar worden gemaakt.
- Plaats een 470 nm dichroïsche spiegel Binnen een 30 mm Cage Cube.
- Het verkrijgen van een 30 mm kooi kubus en verwijder de dichroïsche filter te monteren.
- Plaats een 470 nm dichroïsche spiegel in de dichroïsche filter te monteren.
- Re-insert en zet de dichroïsche filter monteren terug in de kooi kubus.
- Bevestig Cage trekstangen om de 30 mm Cage Cube.
- Securevier 1,5 inch kooiconstructie staven aan de voorzijde van de kooi kubus.
- Beveiligde vier 3,0 inch kooiconstructie staven aan de rechterkant van de kooi kubus.
- Secure twee 2,0 inch kooiconstructie staven schuin aan de linkerkant van de kooi kubus.
- Bouw een Kooi Plate / Lens Tube Vergadering.
- Zorg voor een 1,0 inch schroefdraad 30 mm kooi bord en bevestig een stress-vrij borgring aan de binnenkant van de kooi plaat met behulp van de meegeleverde threading.
- Schroef een 1,0 inch lens buis spanningsvrije borgring.
- Bevestig een tweede 1,0 inch schroefdraad 30 mm kooiplaat de 1,0 inch lens buis en pas de standaard borgringen zodat de twee platen kooi flush.
- Schuif de 1.0 inch Cage Plate / Lens Tube Vergadering op de linkerkant van de 30 mm Cage Cube.
- Bouw de haakse spiegel te monteren montage.
- Zorg voor een rechte hoek spiegel mount en een 1,0 inch UV-versterkte aluminium spiegel.
- Plaats de 1.0 inch UV-versterkte aluminium spiegel in de spiegel te monteren en vastdraaien.
- Beveiligde vier 2,0 inch kooiconstructie staven naar voren spiegelhouder
- Veilig twee 2,0 inch kooiconstructie staven schuin rechts van de kooi kubus.
- Sluit de rechter-hoek spiegel te monteren montage op de linkerkant van de 1,0 inch kooi plaat / lens binnenband door het plaatsen van de tegenstander kooiconstructie staven door de respectievelijke openingen van de 30 mm kooi plaat.
- Rijg een z-as vertaling te monteren door middel van de 3.0 inch kooiconstructie staven aan de rechterzijde van de assemblage.
- Bevestig een 10X achromatische objectieflens op de z-as vertaling mount.
- Bouw een 1,0 inch fiber adapter plaat / xy-as vertaling objectiefvatting montage.
- Het verkrijgen van een xy-as vertaling mount en een 1,0 inch fiber adapter plaat.
- Bevestig de 1,0 inch fiber adapter plaat in de xy-as vertaling lens mount.
- Slide thij 1,0 inch fiber adapter / xy-as vertaling lens mount assemblage in de voorkant van het objectief.
- Het verkrijgen van twee 0,5 inch lang, 1.0 inch diameter lens buizen, een 440/40 nm banddoorlaatfilter (excitatie filter) en een 525/36 nm banddoorlaatfilter (emissie-filter).
- Plaats elk filter in een 0,5 inch lang en 1,0 inch diameter lens buis, zodanig dat de pijl op de buitenzijde van het filter naar de zijde van de lens buis met uitwendige schroefdraad.
- Maak de filters om de montage.
- Het verkrijgen van twee standaard behoudende ringen.
- Zet de filters in de 0,5 inch lang, 1.0 inch diameter lens buizen met de standaard borgringen.
- Draai de lens buis met de excitatie filter aan de voorzijde van de kooi 30 mm kubus en draai de lens buis met de emissie filter om de haakse spiegelhouder.
- Draai de 0,5 inch lens buis met de emissie filter aan de voorzijde van de haakse spiegelhouder.
- obtain twee 1,0 inch schroefdraad 30 mm platen kooi en plaats ze voor de 0,5 inch lang en 1,0 inch diameter lens buizen met de filters.
- Met behulp van epoxy of sterke lijm, voeg een 455 nm LED om de kooi plaat is verbonden met de excitatie filter.
- Het verkrijgen van een 0,5 inch lang, 1.0 inch diameter lens buis en een 1,0 inch achromatische doublet buis lens met een brandpuntsafstand van 50 mm.
- Plaats de buis lens in de lens buis zodanig dat de pijl op de buitenzijde van de lens naar de zijde van de lens buis met uitwendige schroefdraad.
- Schroef in de buis lens op de vergadering.
- Het verkrijgen van een standaard borgring.
- Zet de lens in de 0,5 inch lang, 1.0 inch diameter lens buis met de standaard borgring.
- Bevestig de lens buis met de buis lens op de meest linkse plaat kooi.
- Plaats een 30 mm kooi plaat voor de 0,5 inch lang, 1,0 inch diameter lens buis die de buis lens.
- Bevestig een stress borgring aan de binnenzijde van de 30 mm kooiplaat.
- Sluit een USB-monochrome camera om de kooi bord met de stress borgring.
- Construct de optische paal montage apparaten.
- Het verkrijgen van vier 0,5 inch functionarissen, vier 0,5 inch optische berichten, en vier montage bases.
- Bevestig de 0,5 inch optische berichten in de 0,5 inch functionarissen.
- Bevestig de 0,5 inch functionarissen op de montageplaat bases.
- Schroef de vier optische paal monteren apparaten op de schroefgaten onder de 30 mm kooi kubus, de haakse spiegel te monteren, de kooi plaat is verbonden met de LED en de kooi plaat aangesloten op de camera.
- Schroef in de vier de optische paal montage apparaten op een optische broodplank of optische tafel te eindigen de bouw van de hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit.
ftp_upload / 54564 / 54564fig2.jpg "/>
Figuur 2:. Montage van de hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit De hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit kunnen worden geconstrueerd door het bouwen van een schil van 1,0 inch diameter-sized componenten, met speciale zorg besteed aan de behandeling van de dichroïsche spiegel, objectief, excitatie / emissie-filters, en de buis lens. Glasoppervlakken van deze componenten moeten zorgvuldig worden behandeld met behulp van de lens papier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Montage van de Sub-diffuse reflectie spectroscopie Modality
Opmerking: De geschetste stappen voor de montage van de sub-diffuse reflectie spectroscopie modaliteit in figuur 3 zichtbaar is.
- Het verkrijgen van een wolfraam-halogeen lichtbron en, met epoxy of een sterke lijm, zorgen voor een 1,0 inch threaded 30 mm kooi plaat op de voorkant.
- Secure vier 3,0 inch kooiconstructie staven aan de kooi plaat.
- Bevestig een z-as vertaling bevestigen aan de kooi trekstangen.
- Schroef een 20X achromatische objectieflens op de z-as vertaling monteren.
- Bouw een fiber-adapter plaat / xy-as vertaling objectiefvatting montage.
- Het verkrijgen van een xy-as vertaling mount en een 1,0 inch fiber adapter plaat.
- Zet de fiber adapter plaat in de xy-as vertaling lens mount.
- Schuif de 1.0 inch fiber adapter / xy-vertaling mount assemblage in de voorkant van het objectief.
- Bouw de motor arm montage.
- Het verkrijgen van de custom-built aluminium motor arm en één SMA fiber adapter plaat.
- Schroef in de vezel-adapter plaat (met externe schroefdraad) in de aluminium motor arm (met interne schroefdraad).
- Bevestig de custom-built aluminium motor arm adapter aan de motor arm met vier # 4-40 0,5 in. Schroeven.
- Bouw de motor / motor arm / motorhuis montage.
- Het verkrijgen van de custom-built aluminium motorhuis en de 400-stap stepper motor.
- Lijn de schroefgaten in de stappenmotor en motorhuis en vervolgens vast met vier # 4-40 0,5 inch schroeven.
- Voed de draaiende motor stang van de stappenmotor door de opening van de motor arm assemblage en draai de borgschroef op de aluminium motor arm adapter.
- Bouw de optische schakelaar montage.
- Het verkrijgen van de custom-built aluminium optische schakelaar en drie 1,0 inch fiber adapter platen.
- Rijg de adapter platen in de schroefgaten in de optische schakelaar.
- Bevestig de custom-built aluminium optische schakelaar face-plaat op de optische schakelaar met vier # 4-40 0,5 inch schroeven.
- Bevestig de motor / motor arm / motorhuis montage aan de optische schakelaar door het voeren van de roterende motor stang van de stappenmotor door het gat in het midden van tHij optische schakelaar.
- Het verkrijgen van een elektrische circuit board en stappenmotor driver, en plaats dan de stappenmotor bestuurder over de centrale groef van de broodplank.
- Let op de elektrische aansluiting schema (Figuur 3, 2.12) voor de stappenmotor driver, 12 V voeding en stappenmotor.
- Sluit de stappenmotor driver, 12V en stepper motor zoals beschreven in het schema (figuur 3, 2,12) te voltooien bouw van de gemotoriseerde optische schakelaar.
- Schroef in de optische schakelaar componenten en wolfraam-halogeen lichtbron een optische breadboard of optische tafel in de buurt van de eerder gebouwde (figuur 2, 1.24) hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy montage.
- Bevestig het ene uiteinde van een 550 urn, 0,22 NA patch-kabel aan op de 1,0 inch fiber adapter plaat van de motor arm montage.
- Sluit het andere uiteinde van de 550 urn, 0,22 NA patchkabel om de vezel te verbindenof de USB spectrometer.
- Schroef in de vijf distale probe kabels aan op de respectieve 1,0 inch fiber adapter platen op de instrumentatie de voltooiing van de multimodale hoge-resolutie beeldvorming en sub-diffuse reflectie spectroscopie fiber-bundel microendoscope afmaken.
- Schroef in de centrale 1 mm het diameter glasvezelkabel aan de in stap 1.9.2 genoemde 1,0 inch fiber adapter plaat.
- Schroef in de meest linkse 200 urn multimode fiber-kabel op de in stap 2.6 genoemde 1,0 inch fiber adapter plaat.
- Schroef in de 2e 200 urn multimode fiber-kabel aan op de meest linkse 1,0 inch fiber adapter verbonden aan de in stap 2.9.2 genoemde wolfraam-halogeenlamp.
- Schroef in de 3 e 200 pm multimode fiber-kabel aan op de middelste 1,0 inch fiber adapter in stap 2.9.2 genoemde plaat.
- Schroef in de 4e 200 pm multimode fiber-kabel aan op de meest rechtse 1,0 inch fiber adapter in stap 2.9.2 genoemde plaat.
Figuur 3:. Montage van de sub-diffuse reflectie spectroscopie modaliteit De sub-diffuse reflectie spectroscopie modaliteit kunnen worden geconstrueerd onder toepassing van een eenvoudige halogeenlampen gekoppeld met een objectieflens om licht te focusseren via 200 urn multimode levering vezel, en een spectrometer. Bovendien kan een custom-built gemotoriseerde optische schakelaar worden gebouwd binnen de lamp-fiber-spectrometer pad om te schakelen tussen de SDS. De onderzoekers met behulp van meerdere spectrometers voor het verwerven van meerdere VIB's kan de optische schakelaar component te omzeilen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.3. De kalibratie van de Sub-diffuse reflectie spectroscopie Modality
Opmerking: de fadat stappen (deel 3) moet voorafgaand aan spectrale het verzamelen van gegevens (hoofdstuk 4) worden ingevuld.
- Schakel alle onderdelen van de apparatuur, inclusief de 455 nm LED, breedband halogeenlampen, CMOS-camera, USB spectrometer, stappenmotor en motorbesturing. Zorg ervoor dat de sluiter op de wolfraam-halogeenlamp is open.
- Schakel alle omgevingslicht.
- Open de aangepaste data-acquisitie software.
- Houd installeren die gedurende 30 min voor de lamp bereikt een geschikte temperatuur en gedurende inherente lawaai van de spectrometer te stabiliseren.
- Plaats een 20% diffuse reflectiestandaard in de onderste opening van de custom-built, 3D geprint kalibratiestandaard apparaat.
- Plaats de vezeloptische sonde in het meest linkse sleuf van de aangepaste, 3D geprint vezel-houder, getoond in figuur 4. De meest linkse sleuf bepaalt de loodrechte afstand van de vezeloptische sonde de reflectiestandaard bij 2,1 mm, hetgeen de optimum afstand waarin het signaal bereikt de spectrometer wordt gemaximaliseerd voor de eerste VIB van 374 urn.
- Stel de gemotoriseerde optische schakelaar naar de meest linkse positie zodanig dat de spectrometer is verbonden met de eerste SDS van 374 urn.
- Stel de integratie tijd tot 500 msec. Deze integratie keer moet worden gekozen om de spectrometer niet te verzadigen, maar handhaven van een praktisch lage integratie tijd.
- Het verwerven van een spectrum, R max, 374μm, door te klikken op 'Acquire Spectrum' in de software.
- Sluit de sluiter op de wolfraam-halogeenlamp en een spectrum, R donker opnemen, 374μm, achtergrondlawaai, door te klikken op 'Acquire Spectrum' in de software. Eenmaal verworven, opent de sluiter weer.
- Plaats de glasvezel-sonde in de meest rechtse slot van de aangepaste, 3D geprint fiber-houder, gedemonstreerd in figuur 4. De meest rechtse slot bepaalt de loodrechte afstand van de vezel-optic sonde de reflectiestandaard bij 3,9 mm, dat is de optimale afstand waar het signaal bereikt de spectrometer wordt gemaximaliseerd tweede VIB van 730 urn.
- Stel de gemotoriseerde optische schakelaar in de middelste stand, zodat de spectrometer is verbonden met de tweede SDS van 730 urn.
- Het verwerven van een spectrum, R max, 730μm, door te klikken op 'Acquire Spectrum' in de software.
- Sluit de sluiter op de wolfraam-halogeenlamp en een spectrum, R donker opnemen, 730μm, achtergrondlawaai, door te klikken op 'Acquire Spectrum' in de software.
- Open de sluiter weer.
Figuur 4:. De kalibratie van de sub-diffuse reflectie spectroscopie modaliteit voor pre-experimentele kalibratie, de glasvezel-sonde moet worden op verschillende geplaatstloodrechte afstanden van de 20% diffuse reflectiestandaard afhankelijk van de SDS. Deze loodrechte afstanden voor alle experimenten consistent bereiken werd kalibratiestandaard inrichting uitgevoerd (inrichting doorsnede getoond in (a)) naar de sonde op exacte afstanden van de 20% diffuse reflectiestandaard houden. In deze specifieke vezeloptische sonde opstart, wordt licht van de wolfraam-halogeenlamp weergegeven door de optische schakelaar bij de bron-detector scheidingen of (b) 374 urn en (c) 730 urn (met motor en de arm uit de optische baan voor de duidelijkheid). Afstanden van (d) 2,1 mm voor de 374 micrometer SDS, en (e) 3.9 mm voor de 730 micrometer SDS zijn nodig voor de kalibratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.4. In vivo gegevens Acquisition en optische Property Winning in Menselijke huid
In dit deel zal de multimodale microendoscope techniek worden aangetoond in vivo menselijke huid.
- Open de aangepaste data-acquisitie software en pas de spectrometer integratie tijd door te klikken op "Integratie Time" en zet het zo dat het hetzelfde is als tijdens de kalibratie, die 500 msec in dit geval (stap 3.8) was.
- Bepaal het oppervlak van de huid om te verwerven, die kan verschillen over de toepassing van de onderzoeker. In dit geval is de dunne huid van de onderarm werd gekozen als demonstratie.
- Als de huid haren bevat, verwijder het haar met een wegwerp steriel scheermes.
- Zorg voor een standaard gele markeerstift, die pyranine inkt bevat, en licht markeer de gekozen huidgebied.
- Schakel de 455 nm LED en sluit op de ontspanknop om de wolfraam-halogeenlamp.
- Plaats de sonde in zachte aanraking met de huid.
- Verplaats de sonde eenround van het behandelde weefselgebied een live hoge resolutie toevoer van apicale keratinocyt architectuur bekijken op het weergavevenster van de software.
- Kies een geschikte belichtingstijd en gain, 150 msec en 10 dB winst in dit geval om de afbeelding verzadiging te voorkomen, door te klikken op "Exposure Time" en "Gain", typen in de juiste waarden, en vervolgens te klikken op "Apply Settings" in de software interface.
- Verwerven van een beeld door te klikken op "Acquire Image" in de software-interface.
- Terwijl de sonde op hetzelfde beeld site, zet de 455 nm LED en open de sluiter om de wolfraam-halogeenlamp.
- Stel de gemotoriseerde optische schakelaar naar links zodanig dat de spectrometer is verbonden met de tweede SDS van 374 urn.
- Verwerven spectra, R weefsel, 374μm, door te klikken op 'Acquire Spectra' in de software-interface.
- Stel de gemotoriseerde optische schakelaar in de middelste stand zoals thde spectrometer is verbonden met de tweede SDS van 730 urn.
- Verwerven spectra, R weefsel, 730μm, door te klikken op 'Acquire Spectra' in de software-interface.
- Open de aangepaste post-processing software.
- Voer de post-processing software door te klikken op "Run" en selecteer de afbeelding in hoge resolutie fluorescentie, vier kalibratie spectra, en de twee in vivo spectra van de map waarin de gegevens werden opgeslagen als daarom wordt gevraagd door de software.
LET OP: De aangepaste software verkrijgt de ware absolute reflectie (R abs, 374μm en R abs, 730μm) met behulp van de volgende vergelijkingen.
Naverwerking code, zoals eerder beschreven, berekent een gefitte curve om de diffuse reflectie spectra (vergelijkingen 1 en 2) en vervolgens determines weefsel fysiologische parameters, waaronder ([Hb], [Mel], en São 2). 11,22,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na dit protocol zal de onderzoeker een in-focus hoge-resolutiebeeld van de weefselplaats te verkrijgen met volledige gezichtsveld (figuur 5). Overzichten van cellen kan worden gezien als gekleurd met pyranine inkt uit een standaard gele markeerstift, terwijl individuele cel kernen kan worden gezien als gekleurd met een kleurstof, zoals proflavine. Na spectrale acquisitie, de post-processing software maakt gebruik van a priori kennis van de in vivo hemoglobine concentratie ([Hb]) en melanine concentraties ([Mel]) 21 naar de sub-diffuse reflectie spectra te passen en te bepalen waarden voor [Hb], [Mel ] en weefsel zuurstofverzadiging (SaO 2) zoals getoond in figuur 5. De post-processing software gebruikt breed fysiologische grenzen ([Hb] = 0-150 mg / ml, [Mel] = 0,30 mg / ml en SaO 2 = 0-100%) met de geijkte spectra passen. 21
Figuur 5:. Co-registratie kwalitatieve en kwantitatieve gegevens van in vivo humane normale huid en een goedaardige moedervlek Een afbeelding in hoge resolutie fluorescentie werd verkregen van een pyranine-inkt (uit een standaard gele markeerstift) bevlekt goedaardige moedervlek en aangrenzende normale huid weefsel met een belichtingstijd van 150 msec. Overzichten van keratinocyten kan zijn duidelijk zichtbaar in beide beelden. De normale huidweefsel zelf en moedervlek had hemoglobineconcentraties van 1,63 en 0,86 mg / ml, melanine concentraties van 0,78 en 10,20 mg / ml, met gelijke zuurstofverzadigingen van 99%. Deze figuur toont het voordeel van co-registratie kwalitatieve en kwantitatieve structurele functionele informatie. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De multimodale hoge resolutie beeldvorming en sub-diffuse reflectie spectroscopie fiber-bundel microendoscope hier vermeld kunnen worden geoptimaliseerd en gebruikt door onderzoekers voor verschillende toepassingen zoals endoscopische of handheld gebruik ervan voor menselijke of dierlijke studies. Dit geeft dus een flexibele methode voor het visualiseren in vivo apicale weefsel micro-architectuur naast metingen van het hemoglobinegehalte, melanine concentratie, en weefsel zuurstofverzadiging uit twee verschillende weefsel dieptes. Dit artikel beschrijft de specificaties van de vezeloptische sonde, schetste een protocol voor het samenstellen van de hoge-resolutie beeldvormingssysteem en sub-diffuse reflectantie afbeeldingssysteem en getoond zijn toepassing in menselijke weefsels in vivo, gebruik pyranine inkt als fluorescerende contrastmiddel weefsel visualisatie. Andere inktsoorten, zoals proflavine of fluoresceïne, kan worden gebruikt in plaats van pyranine inkt met geschikte goedkeuring. 4-7,11
"> Any eigenschap probe kan worden gewijzigd in dit ontwerp. Voor hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit, de 1 mm beeld vezeldiameter bestond uit 50.000 individuele kernvezels met 4,5 micrometer tussenruimte, waardoor een constante subcellulaire ruimtelijke resolutie van 4,5 urn . de onderzoekers willen een ander beeld sized vezel tot een kleinere of grotere field-of-view te verkrijgen kan deze afbeelding vezels gemakkelijk beschikbaar met een diameter tussen 0,14 en 1,40 mm. een buis lens met een brandpuntsafstand van 50 mm te vinden is, zodanig dat de CMOS-sensor gekozen gevangen volledige 1 mm field-of-view in zoals vezels. Bij het houden van de objectieflens constant, waardoor de brandpuntsafstand van de buis lens vergroting en bemonsteringsfrequentie verhogen maar field-of-view verlagen. 11 Zo is de vergroting van de objectieflens, brandpuntsafstand van de lens buis, grootte van de beeldsensor, en de grootte van het beeld en vezel kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van de behoefte. Tenslotte filters en excitatielichtbron kan worden aangepast afhankelijk van de excitatie / emissie spectra van fluorescente kleurstoffen. 4-7 Naast het modificeren van de probe en hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy instrumentatie, kan de sub-diffuse reflectie spectroscopie instrumenten worden aangepast.Voor de sub-diffuse reflectie spectroscopie modaliteit, kan verschillende grootte multimode vezels worden gebruikt bij iedere SDS. Kleinere diameter multimode vezels kunnen leveren en laat licht over een kleiner gebied, maar het wordt aanbevolen om een serie van identieke afstand vezels om signaal-ruisverhouding te verhogen indien vezeldiameters kleiner dan 200 urn gebruikt. Onderzoekers analyseren huid of slijmvlies kan profiteren van een algemeen grotere probe field-of-view en signaal-ruis, maar smaller lichtgevende organen, zoals de slokdarm of maag-darmkanaal te verhogen, onderzoekers een toegevoegde beperkingen inzake probe grootte gezicht, vooral op compatibiliteit met de biopsiepoort van conventional endoscopen. 8 Overige spectroscopie componenten die kunnen worden gewijzigd zijn de breedband-lichtbron en gemotoriseerde optische schakelaar. Een wolfraam-halogeenlamp is gekozen casu hoewel andere lichtbronnen en zijn gebruikt in andere studies, waaronder xenonlamp en LED's, welk signaal-ruis en lagere integratietijden kunnen verhogen. De 2,15,20 gemotoriseerde optische schakelaar hier gepresenteerde is speciaal gebouwd om te verwerken tot drie VIB's, maar kan worden aangepast om meer of minder input omvat. Opgemerkt wordt dat de gemotoriseerde optische schakelaar heeft extra optische component toe tussen de breedband lichtbron en spectrometer, afnemende signaal-ruis. De schakelaar kan niet noodzakelijk zijn voor onderzoekers met meerdere spectrometers die gegevens gelijktijdig te verwerven, maar met inbegrip van een optische schakelaar component uiteindelijk vermindert instrumentatie kosten met ongeveer $ 3000 USD per SDS.
De bouw van de instrumentatie (
Met betrekking tot het oplossen van problemen, spectra resulteert in een slechte past (gemiddeldprocent, groter dan 10% tussen ruwe data en ingerichte) volgen onbetrouwbare waarden opleveren voor de drie weefsels fysiologische parameters ([Hb], [Mel] en SaO 2) hier gepresenteerde. Armen past hoogstwaarschijnlijk het gevolg van hetzij beweging tussen de probe en huidplaats tijdens data-acquisitie, smalle randvoorwaarden in naverwerking code of onbetrouwbare a priori waarden van [Hb] en [Mel]. 11,21,24, 26 Verbeteringen in deze drie veel voorkomende fout gebeurtenissen moet de juiste montage van sub-diffuse reflectie spectra te lossen. Aldus kunnen gegevensverzameling verbeterd door vermindering spectrometer integratietijd om bewegingsartefacten te verminderen in de spectra. Daarnaast randvoorwaarden vertegenwoordigen het bereik van mogelijke computationele uitgangswaarden voor [Hb], [Mel], en São 2 volgende post-processing. In deze onderzoeken randvoorwaarden waren 0-10 mg / ml van [Hb], 21,22 0-40 mg / ml voor [Mel], 27,28 en 0-100% voor SaO 2,
De belangrijkste beperking bij het multimodale beeldvorming en spectroscopie fiber-bundel microendoscopy platform is het ontbreken van een groothoek beeldvormende modaliteit. De hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy modaliteit heeft een cirkelvormig gebied rondom zicht die 1 mm in diameter, waardoor het moeilijk om een groot weefselgebied snel scannen. Eén rekenmethode om deze beperking te overwinnen is het mosaIcking, een techniek die gebruikt wordt om een bredere field-of-view te bieden door het stapelen van aangrenzende micro-schaal beelden in een enkele, grotere afbeelding kaart. 10 Dergelijke image mozaieken is eerder aangetoond door Prieto et al. aan het colon afbeelding functies te onderzoeken. 10 An instrumentatie modificatie dit omzeilen zou maken de sonde verenigbaar met de biopsiepoort van een conventionele endoscoop, zoals de probe door Parikh et al. colorectale neoplasie onderzoeken. 8 deze eigenschap combineert de voordelen van een breed-of-view met micro-schaal beeldvorming van hoge-resolutie fluorescentie microendoscopy. 8
Kortom, deze techniek werd aangetoond in vivo menselijke huid en geeft de waarde van gelijktijdig registreren hoge resolutie tissue micro-architectuur beelden met de onderliggende melanine concentratie hemoglobineconcentratie en weefsel zuurstofverzadiging (Figuur 5). dit technique kan worden gebruikt door onderzoekers die de koppeling tussen structurele en functionele abnormaliteiten weefsel in vivo of analyseren weefsel functionele veranderingen in afwezigheid van observeerbare structurele veranderingen te onderzoeken. Toekomstige studies zal de haalbaarheid van deze techniek in verschillende epitheliale ziektetoestanden onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
