Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية توليد أورام نسيلي ملحوظ fluorescently، الذي يعرف وراثيا في ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي antennal (EAD) العين /. فهو يصف كيفية تشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث وكيفية معالجتها لتصور وتحديد التغييرات التعبير الجيني وغزو الورم.
Introduction
ويمثل سرطان واحدة من أكثر المجموعات غير المتجانسة وراثيا من الأمراض، التي يتزايد بشكل كبير، وخاصة بين كبار السن في جميع أنحاء العالم حدوث وفيات. السرطان ينشأ متطابق بسلالة من خلية بدء الورم الذي يهرب آليات القامع الورم الكامن ويقسم خارج نطاق السيطرة. تراكم تدريجي من الآفات الوراثية التي تعزز تعاوني النمو والانتشار والحركة في حين تمنع الموت والتمايز يحول فرط حميدة الأولي إلى ورم خبيث للغاية، المنتشر والقاتل. أصبح من الواضح أنه بالإضافة إلى تغيرات جينية، تطور الورم يتطلب تغييرات في سدى المحيطة بها، والحديث المتبادل بين أنواع الأورام ومتعددة الخلية (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والبطانية) في المكروية لها. فهم مبادئ الجزيئية الكامنة وراء التحول السرطاني بما في ذلك التفاعلات ورم سدى له أهمية كبيرة لتطوير الحيلولة دوناستراتيجيات نشوئها والفحص المبكر، فضلا عن علاجات جديدة وفعالة لمكافحة ورم خبيث من السرطان ومقاومة المخدرات.
أصبح ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة نظام جذابة لأبحاث السرطان 1-4 بسبب الوقت جيل سريع لها، والحفاظ على ملحوظا من الإشارات العقد بين الذباب والبشر، والتكرار الجيني المحدود وثروة من الأدوات الجينية المتقدمة التي تسهل التلاعب في الجينات أي تقريبا في بطريقة مقيدة مؤقتا ومكانيا. الأورام محددة وراثيا متفاوتة خبيثة يمكن هندستها بتكاثر في ذبابة الفاكهة عن طريق إدخال gain- والطفرات الخسارة من وظيفة في مجموعة فرعية من الأسلاف في الأنسجة نوع خلاف البرية باستخدام تقنية MARCM 5. الأداة MARCM يجمع FLP / FRT (FLP recombinase / FLP الاعتراف الهدف) بوساطة إعادة التركيب الإنقسامية 6 مع FLP التدريجي 7 و GAL4 / UAS (المنبع تنشيط تسلسل) الجين 8 الهدفنظم التعبير 9. مع هذا التعبير أسلوب أي التحوير أساس UAS، بما في ذلك الجين الورمي أو cDNAs بروتين فلوري أو تكرار الحمض النووي مقلوب لإسكات الجينات التي يسببها الرنا المزدوج الجديلة، سوف تقتصر على استنساخ الخلايا التي فقدت موضع الجيني المحدد وكاظمة GAL4 المقرر أن إعادة التركيب (الشكل 1A). بقع نسيلي التي تحمل علامة فلوري الأخضر (GFP) أو البروتينات الفلورية الحمراء (على سبيل المثال، طلب تقديم العروض، عن dsRed، mCherry) يمكن تعقبها بسهولة في جميع أنحاء التنمية، معزولة وتحليلها. الأهم من ذلك، يمكن مقارنة سلوكهم مباشرة إلى الأنسجة المجاورة نوع البرية. وبالتالي، ذات الصلة الأسئلة إلى الخلية آثار المستقلة وغير المستقلة من الآفات الوراثية يمكن دراستها بشكل ملائم. على غرار الثدييات، الحيوانات المستنسخة فقط التي يتم فيها مجتمعة تصبح عدة آفات أنكجنيك خبيث في ذبابة الفاكهة وألخص بصمات الرئيسية لسرطان الثدييات. أنها overproliferate، التهرب من موت الخلايا المبرمج، وحمل الالتهاب، تصبح خالدة وINVAالجديد إنجازا هاما، مما أسفر عن مقتل نهاية المطاف المضيف 10-17.
هنا، نحن تصف بروتوكول لتوليد أورام نسيلي محددة وراثيا في أنسجة العين / antennal والدماغ من يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام تقنية MARCM. يعتمد الأسلوب على MARCM الأسهم اختبار الذي يعبر عن FLP recombinase الخميرة تحت سيطرة محسن بلا عيون (eyFLP) 18،19. وبهذه الطريقة، يتم إنشاء الحيوانات المستنسخة GFP المسمى في كل من ظهارة peripodial وعمودية من هيئة البيئة والظهارة العصبية للدماغ طوال المراحل الجنينية واليرقات (الشكل 1A، B والمرجعية 20). الحيوانات المستنسخة يمكن اتباعها بسهولة حتى سن البلوغ كما يطور EAD في العين الكبار، هوائي ورئيس كبسولة في حين أن الظهارة العصبية تثير neuroblasts التي تنتج متباينة الخلايا العصبية الفص البصري.
لتسهيل التوصيف الجزيئي، وظيفية والمظهري واسعة من النسيج الفسيفساء، فإننا ديالكاتب بروتوكول لتشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث والخطوط العريضة لكيفية معالجتها لمدة ثلاثة تطبيقات مختلفة: (ط) الكشف عن صحفيين الفلورسنت المعدلة وراثيا والمناعية، (ب) الكمي لغزو الورم و (ج) تحليل يتغير التعبير الجيني باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) أو الإنتاجية العالية مرنا تسلسل (مرنا وما يليها) (الشكل 1C).
بروتوكول المناعية يمكن استخدامها لتصور أي بروتين من الفائدة مع الأجسام المضادة المحددة. توفر المعدلة وراثيا للصحفيين النسخي الفلورسنت المعلومات الزمانية المكانية مريحة ودقيقة عن النشاط لمسار الإشارات معين. خلية نسب للصحفيين معين، من ناحية أخرى، تعكس التغييرات النوعية والكمية في أعداد الخلايا داخل الأنسجة الفسيفساء وبين الأورام من التراكيب الوراثية المتميزة. الكمي للسلوك الغازية يسهل المقارنة بين الأورام الخبيثة السرطانية بين النمط الجينيالصورة. وأخيرا، فإن بروتوكول يصف جمع ومعالجة EAD الفسيفساء لعزل الحمض النووي الريبي هو مناسبة للتطبيقات المصب الصغيرة والكبيرة مثل النسخ العكسي تليها QRT-PCR وعلى نطاق الجينوم مرنا وما يليها على التوالي. البيانات النوعية والكمية التي تم الحصول عليها من هذه المقايسات توفر رؤى جديدة في السلوك الاجتماعي للأورام نسيلي. وعلاوة على ذلك، فإنها تنتج أساسا متينا للدراسات وظيفية على دور الجينات الفردية والشبكات الوراثية والمكروية الورم في مراحل مختلفة، وجوانب من تكون الأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا العمل يستخدم في eyFLP1. عمل> ص +> GAL4، UAS-GFP. FRT82B وحوض استحمام-Gal80 MARCM 82B الأخضر خط اختبار 11. عبور العذارى اختبار MARCM 82B الأخضر للذكور السلالات مثل ث. UAS واحد. سوف UAS-B رني، FRT82B ج موت الوراثي ينتج ذرية التي سوف تحدث إعادة التركيب الإنقسامية بين أحضان اليمنى من الكروموسومات المتجانسة 3 الثالثة. وبهذه الطريقة، سيتم إنشاء استنساخ متحولة متماثل لج الجين الموجود البعيدة إلى الموقع FRT82B داخل هيئة البيئة والظهارة العصبية في الدماغ. وهذه الحيوانات المستنسخة التعبير عن GFP، التحوير ووالرنا المزدوج الجديلة لجين ب (الشكل 1A). وقد تم إنشاء العديد من خطوط اختبار eyFLP-MARCM لإعادة التركيب على X، 2L، 2R، 3L و3R وتتوفر داخل المجتمع الطاير.
1. يطير المناولة والصلبان، والتدريج
- توسيع المخزون MARCM اختبار المناسب في درجة حرارة الغرفة عن طريق ملء بو متعددةttles في نفس الوقت. الوجه البالغين في زجاجات جديدة كل 2-3 أيام حتى يمكن جمعها أن العذارى كافية لالصلبان اللاحقة.
ملاحظة: عندما جمع العذارى، تجنب التعرض لفترات طويلة إلى CO 2، وهذا يقوض خصوبة الإناث. - اعتمادا على حجم التجربة، وإنشاء تقاطعات ذبابة في قارورة استخدام لا يقل عن 10 العذارى اختبار MARCM و 4 ذكور (على سبيل المثال، للتصوير من الصحفيين الفلورسنت والمناعية) أو في زجاجات مع لا يقل عن 30 من الحور العين و 10 من الذكور (على سبيل المثال، ل عزل الحمض النووي الريبي وتقدير من الغزو).
- رفع ذرية عند 25 درجة مئوية تحت يوم طويل 16 ساعة / 8 ساعة دورة ضوء الظلام. الوجه الآباء في قوارير / زجاجات جديدة كل 24 ساعة لتسهيل انطلاق استنساخه من اليرقات ومنع الازدحام.
ملاحظة: ابتداء من يوم 6 بعد وضع البيض (AEL)، في وقت متأخر الثالثة السيطرة الطور توقف اليرقات التغذية، تبدأ تجول وتدخل pupariation. في المقابل، بداية التحول اليرقات، العذراء يمكن إزالةخلال الموسم أو غير موجودة في اليرقات مع EAD تحمل الأورام نسيلي المفرطة التصنع أو الخبيثة.
2. جمع ثالثا الطور يرقات
- لالمناعية، وجمع حوالي 20 في وقت متأخر الثالثة يرقات العمر (تجول على الحائط، وتلك من حجم الجسم مقارنة من الطعام). استخدام ملقط لاختيار بلطف اليرقات من القنينة أو زجاجة ونقلها إلى طبق الجنين زجاجية مملوءة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- لعزل الحمض النووي الريبي وتقدير من الغزو، وجمع ما لا يقل عن 80 في وقت متأخر الثالثة يرقات العمر (تجول على الحائط، وتلك من حجم الجسم مقارنة من الطعام). استخدام زجاجة بخ بخ برنامج تلفزيوني في زجاجة الطيران التي تحتوي على يرقات حتى يتم تغطية السطح.
- تنعيم الطبقات العليا من الطعام مع ملعقة وصب الهريس الأغذية التي تحتوي على اليرقات في طبق بتري. باستخدام ملقط، واختيار بلطف اليرقات ونقلها إلى طبق الجنين زجاجية مملوءة برنامج تلفزيوني.
- غسل اليرقات مع برنامج تلفزيوني الاتحاد الوطني للعمالايل تتم إزالة جميع المواد الغذائية المتبقية. تفقد اليرقات تحت مجهر تشريحي الفلورسنت مع 8 إلى 16X التكبير إلى تجاهل كل "اليرقات الفهد" التي تحمل البقع GFP إيجابية عشوائية في جميع أنحاء الجسم اليرقات (الشكل 2A، 2B وانظر القسم مناقشة).
ملاحظة: للحصول على عزل الحمض النووي الريبي تشمل خطوة الغسيل قبل الأخيرة في ETOH 70٪ لمدة 1 دقيقة. - ضع صحن يحتوي اليرقات مختارة في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى تشريح. اليرقات عملية في غضون 30 دقيقة لتجنب الآثار السلبية من البرد والجوع.
3. تشريح اليرقات
- لتشريح EAD تحت مجهر تشريحي، استخدم زوج واحد من ملقط للضغط بلطف على الجزء الأوسط من يرقة ضد أسفل الطبق الزجاجي. مع ملقط الثانية، والاستيلاء على السنانير الفم اليرقات وسحبها بعيدا عن الجسم (الشكل 2C).
ملاحظة: قوة جذب في كثير من الأحيان ما يكفي لكسر سيقان البصرية التي تربط EAD بايص لفصوص الدماغ. إذا كان الدماغ أو في أجزائه البقاء تعلق على EAD، وليس هو المطلوب وجودها لمزيد من التطبيقات، وقطع سيقان البصرية مع بمساعدة اثنين من أزواج من الملقط. للأورام الغازية (على سبيل المثال، رأس V12 scrib 1) العلاقة بين هيئة البيئة وفصوص الدماغ يصبح حجب نحو متزايد مع الوقت من خلال زيادة في النمو والخلايا المهاجرة نسيلي.- لإعداد مجمع EAD / الدماغ مع الحبل العصبي البطني سليمة (VNC) (الشكل 2D)، استخدام ملقط لقطع يرقة في وسط الجسم. تجاهل النصف الخلفي.
- عقد النصف الأمامي من الجسم اليرقات بين نصائح من احد ملقط، والوجه اليرقة من الداخل إلى الخارج عن طريق دفع في الفم السنانير مع غيض من ملقط الثانية وقبل المتداول بشرة أكثر من ذلك مع أول زوج ملقط.
- باستخدام ملقط إزالة بعناية جميع أنسجة غريبة (على سبيل المثال، الغدد اللعابية، الدهون في الجسم، والأمعاء)، في حين ترك الزوج EAD أومجمع EAD / الدماغ مرتبطة السنانير الفم. فصل السنانير الفم من بشرة الفوقية. تحرير VNC بقطع التوقعات محور عصبي يمتد إلى عضلات الجسم والبشرة (أرقام 1B، 2C، 2D).
ملاحظة: والسنانير الفم تسمح للتلاعب آمن من النسيج مع ملقط وتسهيل غرق أكثر كفاءة وسهولة التعرف على الأنسجة أثناء الغسل. تشريح EAD تغيير التشكل سريع نسبيا عندما أبقى غير المثبتة في برنامج تلفزيوني. يحدد الوقت تشريح ل20-30 دقيقة. - لنقل الأنسجة، ومعطف P20 micropipette غيض من قبل pipetting الجسم المتبقية جثث عدة مرات صعودا وهبوطا. لنقل المجمعات الكبيرة EAD / الدماغ، وقطع micropipette غيض P20 مع مقص.
ملاحظة: الإجراء طلاء أمر بالغ الأهمية لمنع الالتصاق وفقدان الأنسجة تشريح أثناء النقل. استخدام micropipette P20 يقلل من نقل برنامج تلفزيوني في حل تثبيتي، والحد من التخفيف غير المرغوب فيها.- لالمناعية، ونقلتشريح EAD في أنبوب 0.5 مل مليئة 400 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) مثبت. استخدام أنبوب 1.5 مل مع 1 مل PFA لEAD أكبر / المجمعات الدماغ المخصصة لالتهديف من الغزو.
تنبيه: PFA شديدة السمية. ارتداء القفازات والملابس الواقية. تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية. - لعزل الحمض النووي الريبي نقل EAD تشريح في طبق زجاج جديد مليئة برنامج تلفزيوني الباردة. استخدام ملقط لتنظيف EAD من الحلبة، والغدد الليمفاوية، للحد من التلوث العينة.
- فصل EAD من السنانير الفم عن طريق قطع الاتصال بين أقراص الهوائي والسنانير الفم باستخدام ملقط (الشكل 2E). لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي والجينات التحف التعبير، والحد من الوقت تشريح لمدة 30 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 7.
ملاحظة: باحث ذوي الخبرة يمكن تشريح حوالي 60 اليرقات في 30 دقيقة باستثناء الوقت اللازم لجمع اليرقات والغسيل. تعتمد مجموع عائدات RNA على حجم EAD التي تختلف بين الأنماط الجينية وdevelopmentaمراحل لتر. تشريح 80-100 أزواج السيطرة EAD من أواخر يرقات العمر الثالثة ينبغي أن تسفر 5-8 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع.
- لالمناعية، ونقلتشريح EAD في أنبوب 0.5 مل مليئة 400 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) مثبت. استخدام أنبوب 1.5 مل مع 1 مل PFA لEAD أكبر / المجمعات الدماغ المخصصة لالتهديف من الغزو.
4. إصلاح، المناعية، وتركيب
- إصلاح العينات في PFA تثبيتي لمدة 25 دقيقة في حين الإيماء في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تمديد الوقت تثبيت ما يصل إلى 60 دقيقة دون تغيير التشكل الأنسجة واستضداد من البروتينات.
- إزالة تثبيتي، وغسل العينات مع PBST (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100) ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة باستخدام nutator. استخدام كمية كافية من PBST لكل خطوة الغسيل (400 ميكرولتر أنبوب / 0.5 مل).
يعني الثابتة مجمعات / الدماغ EAD عن التهديف من الغزو لا تتطلب المناعية: ملاحظة. تبقى إشارة GFP مرئية جيدا بعد التثبيت. انتقل إلى الخطوة 4.4 لتشريح النهائي.- لالمناعية والأنسجة كتلة في 200 ميكرولتر من عرقلة الحل (PBST مع 0.3٪ BSA) لمدة 20 دقيقة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع متزمتالأجسام المضادة آرى مخففة في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في حين يهز بلطف. الرجوع إلى ورقة البيانات الأجسام المضادة الأولية أو الكتابات المنشورة عن الموصى تخفيف الأجسام المضادة.
ملاحظة: قد يحتاج تخفيف الأجسام المضادة الأولية على الوجه الأمثل. - وبعد خمسة 10 يغسل دقيقة في PBST، الأنسجة وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخفف في عرقلة الحل في حين يهز بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل العينات ثلاث مرات 10 دقيقة في PBST.
- احتضان مع متزمتالأجسام المضادة آرى مخففة في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في حين يهز بلطف. الرجوع إلى ورقة البيانات الأجسام المضادة الأولية أو الكتابات المنشورة عن الموصى تخفيف الأجسام المضادة.
- لالمناعية والأنسجة كتلة في 200 ميكرولتر من عرقلة الحل (PBST مع 0.3٪ BSA) لمدة 20 دقيقة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال PBST مع 500 ميكرولتر من محلول دابي تلطيخ. لتسمية F-الأكتين، إضافة phalloidin مترافق إلى صبغة الفلورسنت إلى حل دابي تلطيخ. بعد 15 الإيماءة دقيقة في الظلام، وغسل الأنسجة مرة واحدة لمدة 10 دقيقة مع PBST.
ملاحظة: يمكن أن يتم وضع العلامات F-الأكتين بشكل مستقل من تلطيخ دابي. - للخطوة تشريح النهائية، نقل أنسجة الظهر في طبق زجاجي برنامج تلفزيوني باستخدام بي 1 ملpette. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط مقطع من السنانير الفم.
- فصل العقول التي سيتم استخدامها لتقدير حجم غزو من هيئة البيئة عن طريق قطع ساق البصرية وEAD متضخمة قد تعيق التحليل.
- وضع قطرة من متوسطة تركيب (15 ميكرولتر ل22 ملم × 22 ملم ساترة) على شريحة موضوعية. مع مساعدة من ملقط نصائح، توزيع المتوسطة إلى طبقة رقيقة. نقل EAD، والعقول أو المجمعات EAD / الدماغ في المتوسطة المتزايدة مع micropipette P20.
- استخدام النصائح ملقط أو قضيب التنغستن لتوزيع الأنسجة وتصويب VNC على الشريحة.
- لتجنب تشكيل فقاعات في حين تصاعد، أول لمسة حافة واحدة من ساترة إلى تصاعد المتوسط ومن ثم انخفاض ببطء على المتوسطة المتزايدة بمساعدة ملقط. استخدام قطع صغيرة من ورق الترشيح أو أنسجة مسح لاستيعاب المتوسطة تصاعد الزائدة حول حواف ساترة.
ملاحظة: DABCO / بولي (كحول الفينيل) 4-88 تصاعد يصلب المتوسطةفي 4 درجات مئوية في غضون ساعة. ويمكن تخزين الشرائح لعدة أشهر في 4 درجات مئوية.
5. متحد البؤر التصوير
- الحصول على أقسام مبائر واحدة ومداخن باستخدام مجهر متحد البؤر مجهزة 20X والأهداف النفط 40X 60X و.
- منع بكسل التشبع. استخدام معلمات الحصول على الصور نفسها بما في ذلك دقة وضوح الصورة، والليزر مدخلات الطاقة، وزيادة، ويقابل، والإطار المتوسط، حجم خطوة في زي سلسلة والحفاظ على هذه الإعدادات لكافة الأنماط الوراثية للسماح لمقارنة شدة بكسل بين التراكيب الوراثية المختلفة 21،22.
ملاحظة: للحصول على تصور لهيئة البيئة / مجمع الدماغ، وتوليد أقصى قدر التوقعات وغرزة منها، الصور المجاورة. لإعداد الصورة النهائية، استخدم آخر برامج معالجة الصور لتجميع الفريق ولضبط السطوع والتباين.
6. الكمي لغزو الورم
- تعريف نظام التهديف من شأنها أن تميز مستويات مختلفة من invasivenes الورمليالي النظر في نمط المكاني للغزو وكمية من الخلايا GFP إيجابية تنتشر في الدماغ وفنك. إعداد ورقة تقييم للوثائق (الشكل 3A).
- جبل لا يقل عن 80 الثابتة العقول سليمة لكل النمط الجيني على شريحة واحدة باستخدام 40 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة في 24 ملم × 50 ملم ساترة.
- للسماح التهديف غير متحيزة، اطلب من طرف محايد لتجهيل الشرائح، بحيث الإجراء التهديف غير متحيزة. تقييم الشرائح مجهولة المصدر من قبل اثنين من أعضاء مختبر مستقل. الكشف عن المورثات فقط بعد الانتهاء من فرز الأصوات.
- تقييم درجة خباثة من قبل التهديف أعمى من العقول التي شنت تحت مجهر تشريحي الفلورسنت مجهزة بمجموعة مرشح GFP. استخدام علامة لتسمية العقول التي تم عرضها بالفعل لتجنب العد المزدوج (الشكل 3B).
- حساب النسبة المئوية من العقول الوقوع في كل فئة من الفئات الغازية محددة في التركيب الوراثي. تحديد الصورة الإحصائيةignificance باستخدام اختبار مربع كاي (الشكل 3C).
7. عزل الحمض النووي الريبي، الدناز العلاج، وفحص الجودة
ملاحظة: جميع الكواشف (حلول، بلستيكور) المستخدمة في الخطوات التالية يجب أن تكون خالية من النشاط ريبونوكلياز. دائما ارتداء القفازات واستخدام غطاء الكيميائي للعمل مع المذيبات العضوية.
- نقل EAD نظيفة مع المغلفة طرف P20 micropipette في أنبوب 1.5 مل.
- السماح بالوعة الأنسجة إلى أسفل الأنبوب، وإزالة بعناية برنامج تلفزيوني واستبدالها مع 100 ميكرولتر كاشف RNA تحلل (يكفي لمدة تصل إلى 140 EAD).
- الأنسجة ليز قبل vortexing. في هذه المرحلة، يمكن أن العينات تكون عميقة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية أو معالجتها مباشرة مع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي القياسية.
ملاحظة: عينات من المورثات مماثلة من جولات تشريح متعددة يمكن تجميعها مرة واحدة في الحمض النووي الريبي تحلل كاشف. - ملء حجم العينة إلى 0.9 مل مع كاشف RNA تحلل. إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم ومزيج عينات vigorously لمدة 15-20 ثانية.
- بعد 2-3 حضانة دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وأجهزة الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل عديم اللون العلوي المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في أنبوب جديد من دون إزعاج البيني. البقاء بعيدا عن البيني كما أنه يحتوي على البروتينات والحمض النووي الجيني.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم تعافى حوالي 60٪ من حجم كاشف RNA تحلل تستخدم لالتجانس. - ترسيب الحمض النووي الريبي إضافة 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل. دوامة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف ويغسل بيليه RNA مرة واحدة مع 600 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول. بعد دوامة قصيرة والطرد المركزي (10000 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية) تجاهل كل الايثانول والسماح للبيليه RNA الهواء الجاف لمدة 5-10 دقائق وضع أنبوب مفتوحة على منديل نظيف مسح.
ملاحظة: بيليه RNA قد تكون واضحة على أنه صغير مبهمة الأبيض ST /ناضجة في الجزء السفلي من أنبوب أو غير مرئية. قطرات الايثانول المتبقية يمكن إزالتها بعناية مع طرف P10 micropipette. - حل الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من DEPC المياه المعالجة قبل vortexing أو تمرير حل عدة مرات خلال قمة ماصة.
- للحد من التلوث مع الحمض النووي الجيني، علاج الحمض النووي الريبي مجموع مع الدناز بإضافة 50 ميكرولتر من مزيج يحتوي على 1 ميكرولتر من الدناز (يو 2 / ميكرولتر) و 10 ميكرولتر من 10X العازلة الدناز في المياه المعالجة DEPC. دوامة وتدور باستمرار.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة التدفئة لمدة 30 إلى 40 دقيقة. بعد الحضانة، وإضافة 100 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC في كل عينة.
- لتعطيل النشاط الأنزيمي والجيش الملكي النيبالي نظيف من الدناز، إضافة 200 ميكرولتر من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1) حل، دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نقل بعناية المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في أنبوب جديد. إضافة حجم مساو (200 ميكرولتر)من الكلوروفورم، وخلط وكرر الخطوة الطرد المركزي من فوق.
- جمع بعناية المرحلة العليا ويعجل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2 أعد DEPC H 2 O و 2.5 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج دقيق من قبل vortexing.
ملاحظة: إضافة 0.5 ميكرولتر الجليكوجين (20 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى خليط هطول الأمطار تساعد على تصور بيليه الحمض النووي الريبي. لتقليل الخسائر RNA، استخدم صلكنزد، وأنابيب microcentrifuge 1.5 مل منخفضة ملزم. - ترسيب الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
ملاحظة: يمكن حمل الحضانة بين عشية وضحاها. عينات يمكن وضعها في -80 ° C كذلك. - بيليه RNA عن طريق الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. غسل والجافة بيليه بعد وصف في 7.9.
- حل الحمض النووي الريبي في 10-15 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
- تحديد كمية ونقاء من الحمض النووي الريبي عن طريق قياس OD في 230 نانومتر و 260 نانومتر و 280 نانومتر باستخدام مطياف. حساب RNA المشتركncentration عن طريق تطبيق الاتفاقية أن 1 OD في 260 نانومتر يساوي 40 ميكروغرام / مل RNA.
ملاحظة: نسبة و260/280 من الحمض النووي الريبي "النقي" يساوي 2.0 في حين ينبغي أن يكون نسبة و260/230 في مجموعة من 2،0-2،2. عينات الحمض النووي الريبي مع ونسبة 260/280 ما بين 1.7 و 2.0 هي مناسبة للتطبيقات المصب مثل التوليف [كدنا]. لإعداد مكتبات مرنا وما يليها نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي يجب أن يتم التحقق باستخدام نظام الكهربائي الآلي. وينبغي أن تكون نسبة 28S / 18S فوق 1.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتدليل على إمكانات تقنية eyFLP-MARCM لتوليد بقع بعلامات GFP من التراكيب الوراثية المحددة في ذبابة الفاكهة EAD، والناجم عن ثلاثة أنواع من الحيوانات المستنسخة: (1) التحكم في التعبير عن GFP فقط، (2) الأورام الخبيثة معربا عن شكل أنكجنيك من الصغيرة G-بروتين رأس (رأس V12) في خلفية فقدان متماثل من خربشات الورم القامع الجينات (scrib 1)، و (3) زيادة في النمو ولكن غير الغازية رأس V12 scrib 1 JNK استنساخ DN، حيث كيناز في يونيو-N-الطرفية (JNK) تم المعطل من التعبير عن شكله السائد سلبية (الشكل 4، الجدول رقم 1 لالمورثات). وقد تبين أن الغزو من رأس V12 scrib 1 الأورام نسيلي يتطلب تفعيل الشاذة من الإشارات JNK والنسخ في المصب عوامل 10،12،23،24. وعلاوة على ذلك، رأس V12 scrib 1 ذبابة الفاكهة، مما أدى إلى تسلل الخلايا المناعية (وتسمى hemocytes) في EAD 14،25.
رصد مستويات والتوزيع المكاني للنشاط JNK داخل النسيج الفسيفساء وبين الأورام من التراكيب الوراثية المتميزة وراثيا المعمول بها، كان يعمل-JNK استجابة مراسل TRE-عن dsRed 26. المجهر متحد البؤر من EAD تشريح، الثابتة وEAD / كشفت المجمعات الدماغ upregulation ملحوظ في النشاط مراسل TRE-عن dsRed في الأنسجة تحمل الخبيث رأس V12 scrib 1 الأورام (الشكل 4B). وعن dsRed إشارة المسمى رأس V12 scrib 1 الحيوانات المستنسخة في EAD (الشكل 4B)، وكذلك الخلايا السرطانية تنتشر على فصوص المخ وغزو VNC (الشكل 4E، 4F). في المقابل، فإن activi مراسل TRE-عن dsRedبقي تاي المقيد إلى سلسلة من الخلايا التي تمتد من antennal إلى الجزء عين أقراص التحكم (الشكل 4A). حجب JNK إشارات أدى إلى انخفاض هائل في إشارة TRE-عن dsRed في رأس نسيلي V12 scrib 1 الأورام JNK DN (الشكل 4C، 4D). وبالتالي توفر هذه البيانات دليلا وظيفية لمتطلبات JNK يشير إلى تفعيل استجابة النسخي TRE التي تعتمد في رأس الخبيث V12 scrib 1 الأورام. وhmlΔ-عن dsRed مراسل نسب محددة، وضعت لتعقب ذبابة الفاكهة hemocytes 27،28 أظهر تراكم الخلايا المناعية في أنسجة تحمل الخبيث رأس V12 scrib 1 الأورام (الشكل 5B). في المقابل، تم الكشف فقط hemocytes الفردية أو بقع قليلة كرية دموية المحلية في الرقابة وV12 رأس scrib 1 JNK DN فسيفساء EAD وأنسجة المخ(الشكل 5A، 5C). المناعية مع عموم كرية دموية المضادة للأجسام المضادة Hemese (H2) 29 أكدت هوية الخلايا المناعية من hmlΔ-عن dsRed خلايا إيجابية (الشكل 5D، 5E). وتمشيا مع التقارير المنشورة 12،23،24، تقدير غير متحيز للغزو الورم أيد دورا مركزيا من JNK يشير في تعزيز غزو ورم في الفص المخ المجاورة وVNC (الشكل 3C). وأخيرا، تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من EAD الفسيفساء. تعرض العينات إما إلى QRT-PCR أو تحليلها على نظام الكهربائي الآلي لنوعية وكمية. ويبين الشكل 6A upregulation كبير تعتمد على JNK من الفلزي مصفوفة 1 (mmp1) نسخة في EAD تحمل الخبيثة رأس V12 scrib 1 الأورام نسيلي، مما يؤكد سابقا نتائج الدراسة التي نشرت 12،24،30،31. وأظهر تقييم الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام نظام الكهربائي الآلي ركان قبعة ثلاث عينات EAD مستقلة نسبة 28S / 18S فوق 1.8 (الشكل 6B). ومع ذلك، كان EAD 2 RNA المتدهورة جزئيا، التي تعكسها مسحة على هلام (الشكل 6C). في المقابل، كان EAD 3 عينة على تركيز منخفض. فرق متعددة ذات الوزن الجزئي العالي على الصورة هلام (الشكل 6B) وقمم صغيرة على رحلاني (الشكل 6C)، اقترح أيضا تلوث الحمض النووي. وبالتالي، فإن EAD فقط 1 عينة تكون مناسبة لإعداد مكتبة مرنا وما يليها.
الشكل 1: مخططات النظام MARCM لجيل من الفسيفساء الوراثية في ذبابة الفاكهة EAD والتطبيقات المصب (A) نظام MARCM تمكن جيل من بقع نسيلي مع الآفات الوراثية المعرفة في نوع خلاف البرية (متخالف).سياق الكلام. التعبير عن FLP تحت سيطرة أحد المروجين محددة الأنسجة (على سبيل المثال، بلا عيون) يحفز إعادة التركيب بين العنصرين FRT المرافقة كاسيت إيقاف ملحوظ مع (ذ) الجين الأصفر (عمل> ص +> GAL4). على إزالة كاسيت إيقاف، وأعرب بتواجد مطلق GAL4 النسخي المنشط (ACT-GAL4) يمكن أن تدفع التعبير عن أي التحوير أساس UAS مثل UAS-GFP (أيضا UAS الراس V12). في خلية الوالدين، ومع ذلك، يتم حظر النشاط GAL4 من قبل كاظمة Gal80 التي يسيطر عليها من قبل المروج تويولين (حوض-Gal80) التعبير. في المرحلة G2 من دورة الخلية، FLP تتوسط صرف الصبغي غير شقيقة بين الكروموسومات المتجانسة البعيدة إلى المواقع FRT. فإن فصل الكروموسومات المؤتلف خلال الانقسام يؤدي إلى خليتين ابنة، واحد يجري متحولة متماثل لمكان الجيني معين (على سبيل المثال، scrib
الشكل 2: الفرز من يرقات العمر الثالث والأمثلة النموذجية لهيئة البيئة وهيئة البيئة / المجمعات المخ تستخدم للتطبيقات المصب مختلفة (AB) الميكروسكوب فلوري السيطرة يرقات تحمل الحيوانات المستنسخة GFP المسمى الطور الثالث الناجم مع اختبار eyFLP-MARCM 82B الخضراء. (A) يرقة السيطرة التمثيلية مع الحيوانات المستنسخة يقتصر على EAD والدماغ الفصوص. (ب) مثال على "يرقة الفهد" التي تحمل الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم. الصور (C) Brightfield من تشريح EAD والمجمعات (D) EAD / الدماغ تعلق على السنانير الفم، و (E) EAD تنظيفها من جميع الأنسجة الغريبة بما في ذلك الفم السنانير. الحانات النطاق = 2 مم (AB) و 500 ميكرون (CE).fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3):. الكمي لغزو الورم (A) صور متحد البؤر فلوري من أدمغة تشريح من رأس V12 scrib 1 اليرقات (7 أيام AEL) تمثل أمثلة حقيقية من أربع درجات مختلفة من غزو الورم تتراوح من غير الغازية (نقاط 0)، واحد فص الدماغ غزت (النتيجة 1)، وكلاهما فصوص الدماغ غزت (نقاط 2) إلى غزو الورم قوية مع الأنسجة نسيلي تغطي كلا الفصين الدماغ وتدخل VNC (نقاط 3). الصور هي التوقعات من أقسام متحد البؤر متعددة وأمثلة لتصبح النتيجة 2 و 3 وخياطة من 2 × 2 صور مبائر. الحانات النطاق = 100 ميكرون. (ب) مثال على شريحة المجهر مجهولة المصدر مع العقول الثابتة المستخدمة لمنحازةوسجل تحت مجهر تشريحي الفلورسنت. يتم وضع علامة العقول يسجل هدفا من ركلة جزاء لمنع تسجيل مكررة. شريط مقياس = 500 ميكرون (C) بالمقارنة مع الغازية عالية رأس V12 scrib 1 الأورام، وتثبيط JNK الإنذار (رأس V12 scrib 1 JNK DN) الغزو القضاء على الخلايا نسيلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تفعيل النسخي مراسل TRE-عن dsRed في "V12" رأس الخبيثة scrib '1 الأورام نسيلي يعتمد-JNK (A. TRE-عن dsRed الحساسة JNK شريط ضيق من الخلايا يمتد من antennal إلى جانب العين (السهام). (ب) قد تحسن النشاط لمراسل TRE-عن dsRed بشكل ملحوظ في رأس V12 scrib 1 الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية مقارنة المحيطة غير نسيلي ظهارة EAD. (C) تثبيط نشاط JNK أدى إلى انخفاض واضح في كثافة عن dsRed إشارة في رأس V12 scrib 1 JNK استنساخ DN. (D) مواصلة تعزيز إشارة عن dsRed كشف تفعيل غير ذاتي من JNK يشير في الخلايا المحيطة رأس V12 scrib 1 JNK استنساخ DN. (E) في يوم 8 AEL، رأس V12 scrib 1 خلايا overgrew كامل EAD وانتشارها في فصوص الدماغ إلى فنك (السهم). (F) الخلايا نسيلي غزو VNC (قرب منطقة موقد أثرى arked بواسطة السهم في E) للإشارة عن dsRed. (AC) مشاهدة توقعات أقسام متحد البؤر متعددة، (E) هو مخيط من 3X3 الصور مبائر و (D، F) تمثل مقطع واحد. الحانات النطاق = 50 ميكرون. EAD، العين / قرص antennal. BL، فص الدماغ. فنك، الحبل العصبي البطني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: النسب المحددة HML Δ -DsRed مراسل المعدلة وراثيا يكشف إثراء رأس V12 scrib 1 المصاحب الورم hemocytes (A) في EAD السيطرة، hmlΔ-عن dsRed المسمى مراسل كرية دموية CLU محاصرون sters في المسافات البادئة من العين وظهارة antennal. (ب) الأنسجة هيئة البيئة والدماغ تتألف من scrib رأس V12 أظهرت 1 الأورام بعلامات GFP زيادة عدد hemocytes منتشرة في جميع أنحاء الأنسجة نسيلي. (ج) عدد hemocytes المرتبطة انخفضت بشكل كبير على تثبيط إشارات JNK في رأس V12 scrib 1 JNK DN فسيفساء النسيج. وصفت (DE) HmlΔ-عن dsRed hemocytes إيجابية أيضا مع H2 الضد يكشف عن عموم كرية دموية علامة Hemese. (AC) ومخيط مشاهدة توقعات أقسام متحد البؤر متعددة، (A) هو مخيط من 2 × 2 و(قبل الميلاد) من 3 × 3 صور مبائر. (DE) تمثيل أقسام احدة. الحانات النطاق = 100 ميكرون (AC) و 10 ميكرون (DE). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وكان تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن EAD تشريح (A) مثال ممثل النتائج QRT-PCR باستخدام أربعة مكررات البيولوجية لكل الوراثي مستويات النص Mmp1 تطبيع لrp49: الرقم 6.. وحسبت أضعاف التغيرات في التعبير الجيني باستخدام معيار نسبي طريقة منحنى 32. البيانات هي القيم يعني ± ووزارة شؤون المرأة. *** P <0.001 باستخدام أونبايريد الذيل يومين الطالب اختبار t مع تباين غير المتكافئ. (B، C) تقييم الجودة الشاملة RNA وكمية باستخدام نظام الكهربائي الآلي. صورة هلام الظاهرية (ب) تبين شريطين بارزة من 18S و 28S rRNAs التي تتوافق مع قمم واضحة المعالم على electropherograms (C). تنعكس تلوث الحمض النووي والحمض النووي الريبي تدهور بنسبةمير (السهام) وشرائح extranumerary وقمم (السهام). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ذبابة سلالات | المصدر / تعليقات |
| eyFLP1. عمل> ص +> GAL4، UAS-GFP. FRT82B وحوض استحمام-Gal80 | eyFLP-82B MARCM الخضراء تستر 11 |
| ث. V12 UAS الراس. FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| ث. V12 UAS الراس. UAS-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| ث. hmlΔ-عن dsRed. FRT82B | هذه الدراسة، ث. hmlΔ-عن dsRed من كاتيا بروكنر 28 |
| ث. UAS الراس V12 hmlΔ-عن dsRed. FRT82B scrib 1 / TM6B | هذه الدراسة |
| ث. UAS الراس V12 hmlΔ-عن dsRed. UAS-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | هذه الدراسة |
| ث. TRE-عن dsRed. FRT82B | هذه الدراسة، ث. TRE-عن dsRed من ديرك Bohmann 26 |
| ث. UAS الراس V12 TRE-عن dsRed. FRT82B scrib 1 / TM6B | هذه الدراسة |
| ث. UAS الراس V12 TRE-عن dsRed. UAS-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | هذه الدراسة |
الجدول 1: ملخص لخطوط ذبابة الفاكهة المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنيات لتوليد الفسيفساء الوراثية في ذبابة الفاكهة هي من ضمن الأدوات الأكثر تطورا لتحليل والتلاعب وظيفة الجين 33. وقد ثبت أن نظام eyFLP-MARCM قوية وقوية لأنها تتيح للتحريض ملحوظ بصريا، استنساخ محددة وراثيا بطريقة مقيدة مكانيا، أي في الأنسجة حيث محسن بلا عيون نشط 9،18. وهذا أمر مهم خاصة عندما يتم الجمع بين آفات جينية متعددة في نفس الخلايا. بينما تسمح هذه البقع الشاذة للغاية نمو اليرقات عندما يقتصر على EAD والدماغ neuroepithelia، فإنها يمكن أن تسبب الفتك عندما المنتشرة في جميع أنحاء الجسم اليرقات كما في حالة FLP (hsFLP) استنساخ تسيطر صدمة للحرارة. إلى حد كبير، تحريض من الحيوانات المستنسخة في الظهارة EAD الطيران التي تنشيط الجينات المسرطنة تتحد مع فقدان المكثفات ورم يلخص نشوء وتطور الأورام الظهارية الصلبة في بعض السرطانات البشرية. هوويفر، كما ان النظام حدودها التي سيتم مناقشتها لفترة وجيزة. وبالنظر إلى أن الحشرات لديها نظام الدورة الدموية مفتوحة، الانبثاث الحقيقية كما لوحظ في السرطانات البشرية لا تحدث. وبالتالي فإن عملية معقدة من نشر النقيلي لا يمكن أن تكون على غرار بإخلاص في ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، وأورام EAD مثل الحيوانات المستنسخة رأس V12 scrib 1 تفعل عرض خصائص الخبيثة لأنها كسر الغشاء القاعدي المحيطة EAD وغزو الدماغ المجاورة 11،12،31. درجة عدوانية الورم ويمكن قياس ومقارنة بين التراكيب الوراثية المختلفة كما هو موضح في هذه الدراسة. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن وجود آفات جينية محددة في EAD فسيفساء قد تؤثر على توقيت التنموي ومدة نمو اليرقات. وانطلاق من اليرقات تحديد ما إذا كان تحليل الأنسجة الفسيفساء وسيتم ذلك باستخدام حيوانات من نفس المرحلة الزمني أو التنموية. أداء التجربة الرائدة لتقييم تأثيرجديد النمط الجيني نسيلي EAD على توقيت التنموي أمر مرغوب فيه.
هناك قيود التقنية أيضا. لأول مرة، وعدد من المورثات نسيلي المختلفة التي يمكن أن يبنى مع أداة eyFLP-MARCM كبيرة ولكن ليس بلا حدود. على سبيل المثال، والجمع بين اثنين من الأليلات الطافرة الموجودة على الكروموسومات المختلفة يعوقها انخفاض كفاءة إعادة التركيب على كل من الكروموسومات في وقت واحد، والجينات الموجودة على كروموسوم الرابع صغير يتعذر الوصول بشكل عام. الجينات ضربة قاضية باستخدام رني المعدلة وراثيا هو حل بديل. ومع ذلك، فمن المهم أن ندرك أن لا يتم التعبير عن الجينات المحورة فور إعادة التركيب الإنقسامية - وليس حتى مع تدهور كاظمة Gal80. ونشاط الجهاز التعبير / UAS GAL4 يمكن أن تتعزز من خلال زراعة اليرقات في 29 درجة مئوية. غير أنه من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن درجة الحرارة المرتفعة تؤثر مختلف المعالم التنموية والفسيولوجية والجزيئية بما في ذلك معدل النمو، توقيت التنموي، metaboliخ والتعبير الجيني 34-37. وبالتالي، فإن التكيف مع البروتوكولات المقدمة مثل التدريج اليرقات أو عدد EAD تشريح لتحديد ملامح Transcriptome على أن يكون ضروريا.
في اختبار eyFLP-MARCM ليست من بين أصح السلالات. الجينات المحورة متعددة في وسط الجينوم واحد يطير اللياقة البدنية والخصوبة. تتطلب هذه المخزونات اهتمام إضافي لمواصلة وتوسيع لمجموعات كبيرة من الإناث البكر. وكما هو موثق في هذه الدراسة، فإن خط اختبار MARCM 82B الخضراء 11، على الرغم قابلة للحياة، هو عندما متماثل غير مستقرة وراثيا. وهذا واضح من مظهر عفوي من "اليرقات الفهد" التي تعرض، الحيوانات المستنسخة GFP المسمى خارج الرحم في مختلف الأنسجة المتعددة الصبغيات بما في ذلك الأمعاء، القصبات الهوائية، الدهون في الجسم، والبشرة اليرقات. تحدث هذه الظاهرة في جميع الصلبان مستقلة عن التركيب الوراثي للأب. نحن نفترض أن البقع GFP خارج الرحم تنتج عن غير المنضبط، إعادة التركيب العشوائي بين FR اثنينمواقع تي في كاسيت FLP خارج، مما تسبب في إزالة علامة + أصفر و "كاسيت إيقاف". في الأنسجة المتعددة الصبغيات، قد يكون تويولين المروج يحركها Gal80 كاظمة غير كافية لمنع النشاط GAL4. وجود خلايا معدلة وراثيا في الأنسجة الأخرى من هيئة البيئة والدماغ يمكن أن تثير إشارات المنهجية التي قد تؤثر على سلوك الحيوانات المستنسخة التجريبية. ولذلك ينبغي هذه "اليرقات الفهد" أن تستبعد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، نعيد تأسيس بشكل روتيني اختبار MARCM 82B الخضراء من الصلبان واحدة بين الذكور والإناث.
وعلى الرغم من المخاطر المذكورة أعلاه، فإن تطبيقات نظام eyFLP-MARCM لدراسة وظائف الجينات والتفاعلات بين الأورام نسيلي وبيئتهم متعددة. مقدمة من / نظم التعبير ثنائي مستقل UAS GAL4 مثل LexA / LexOp 38 أو المخدرات QF السيطرة / أن QUAS / QS 39،40 توفير دفع غرامة السيطرة على إكسب التحويرression و / أو وضع العلامات في وقت واحد والتلاعب من السكان مختلفة من الخلايا بما في ذلك نسيلي والخلايا وhemocytes الظهارية غير نسيلي. هذه الأنسجة الفسيفساء يمكن معالجتها مرة أخرى وفقا لبروتوكولات هو موضح هنا.
طريقة لتشريح المجمعات / الدماغ الفسيفساء EAD وEAD من يرقات العمر الثالث (قسم البروتوكول 3) يمكن تطبيقها على مراحل النمو السابقة كذلك. وجدير بالذكر أن بروتوكول للمجمعات EAD / الدماغ يسمح استرداد الجناح، haltere والساق أقراص تخيلي. وينبغي أن تستخدم هذه لعزل الحمض النووي الريبي (أقسام بروتوكول 3.3.2 و 7)، وقرص من الفائدة يجب أن تنظف من الأنسجة الغريبة ومعالجتها على نحو مماثل إلى الهيئة. وبالنظر إلى حجم أصغر، ينبغي زيادة عدد haltere والساق الأقراص التي تم جمعها للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي.
ويستند هذا البروتوكول لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من (القسم بروتوكول 7) EAD على RNA تحلل كاشف متاح من الخامس تجاري مختلفendors (انظر قائمة المواد / المعدات). النجاح الشامل الإجراء يعتمد بشكل رئيسي على: (أ) وجود عدد كاف من اليرقات، (ب) أن تكون سريعة ودقيقة في حين تشريح، و (ج) حفظ عينات مجانية من RNases. حفظ مساحة العمل والأدوات نظيفة، وارتداء قفازات، وذلك باستخدام ريبونوكلياز خالية وير البلاستيك والحلول، وحفظ عينات على الجليد عن الحد من تدهور الحمض النووي الريبي. لمنع التلوث من الحمض النووي الريبي مع أي الحمض النووي الجيني قد لا تتم إزالتها بالكامل من قبل العلاج الدناز (قسم البروتوكول 7.11)، فمن الأهمية بمكان لتجنب البيني عند جمع المرحلة المائية للمرة الأولى (القسم بروتوكول 7.6). كلا تلوث الحمض النووي RNA وتدهور يمكن كشف عن طريق تشغيل عينات على نظام الكهربائي الآلي (الشكل 6B، 6C). بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي لديه تطبيقها على نطاق أوسع. وقد تم استخدامه بنجاح لاستخراج الحمض النووي الريبي من اليرقات كاملة في مراحل نمو مختلفة، من الكبار، ومختلفأجهزة اليرقات. كان الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها مناسبة لكلا QRT-PCR وتحليل Transcriptome على نطاق الجينوم التي كتبها مرنا وما يليها 20،24،41،42. مقارنة QRT-PCR يحدد مقدار عشرات من mRNAs المختارة على الأكثر، يسمح متحيز مرنا تسلسل يحلل التعبير على نطاق الجينوم. وهكذا، يمكن للمرء أن يقارن التوقيعات Transcriptome على كامل الأورام الناجمة عن الآفات وراثية محددة في مراحل متميزة من تكون الأورام 24. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن RNA يأتي من أقراص بأكملها، بحيث النتائج لا تعكس سوى تغييرات في استنساخ ولكن أيضا في الأنسجة المحيطة بها، غير نسيلي. أداء الخلية الفلورسنت تفعيل الفرز (FACS) على EAD فسيفساء فصلها عن طريق التكيف البروتوكولات المتاحة يمكن تطبيقها 43،44 لتحديد توقيع النسخي من فئات معينة من السكان الخلوي، على سبيل المثال، نسيلي (GFP +) وغير نسيلي (GFP -) الخلايا.
بروتوكول تثبيت والمناعية الموصوفة هنا هي مناسبة لsimulالتصور taneous من البروتينات في المصالح مع الأجسام المضادة ونشاط للصحفيين المعدلة وراثيا محددة. يتم الاحتفاظ كل من إشارة GFP بمناسبة الخلايا نسيلي وعن dsRed مضان تنتج إما عن طريق اثنين من الصحفيين المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة طوال تثبيت والمناعية ويمكن تصور مباشرة بواسطة المجهر متحد البؤر. ومع ذلك، يمكن أن الأجسام المضادة ضد البروتينات الفلورية تضخيم قوة إشارة. وبالمثل، فإن استخدام أجسام مضادة لمكافحة β غالاكتوزيداز تسهيل الكشف عن صحفيين المعدلة وراثيا على أساس الجين lacZ البكتيرية. ويمكن تقييم الأنشطة مراسل النسبية عن طريق قياس كثافة بكسل النسبية من الحيوانات المستنسخة مقابل غير نسيلي النسيج باستخدام صورة برامج التحليل (على سبيل المثال، فيجي، يماغيج). عند مقارنة النشاط الصحفي بين المورثات نسيلي مختلفة، يجب أن تبقى إعدادات التقاط صور ثابتة (القسم بروتوكول 5 والمراجع 21،22). على الرغم من أن البروتوكول يعمل بشكل جيد مع العديد من مختلفntibodies، قد يكون من الضروري لتحسين تركيز الأجسام المضادة الموصى بها. قد تكون هناك حاجة أيضا تغييرات في تثبيت الوقت ونوع وتركيز المنظفات (تريتون X-100، توين-20، سابونين) وتثبيتي (8٪ PFA، 4٪ الفورمالديهايد، ETOH).
وخلافا للبروتوكولات التي نوقشت أعلاه، وتحديد حجم الورم الغازية يقتصر على مرحلة اليرقات الطور الثالث ومجمع EAD / الدماغ. ومع ذلك، يمكن أن تنطبق منطقها العام لأي الدراسات الكمية التي يحتاج فيها التحيز المعرفي التي ينبغي تجنبها. وتتطلب هذه الطريقة دقة. كما يزيد الورم الخبيث في الوقت المناسب، لا بد من مقارنة اليرقات من نفس الفئة العمرية (على سبيل المثال، 7 أو 8 أيام بعد وضع البيض). مع مرور الوقت ورم نسيلي يمكن اكتسى نطاق واسع، ولكن قد تبقى الخلايا السرطانية داخل EAD. الخطوة التي يتم فيها فصل العقول من EAD (القسم بروتوكول 4.4.1) ولذلك فإن الحرجة لتجنب التهم الغازية إيجابية كاذبة. سوف تركيب أدمغة مع هيئة البيئة تعلق فلاتأون الأنسجة، مما تسبب في EAD متضخمة لتغطية هياكل الدماغ وبالتالي منع أي تقدير. من الناحية المثالية، فإن واحدة ترغب في التقاط عملية الغازية مباشرة في يرقة المعيشة. للصحفيين المعدلة وراثيا لتصور تتوفر السكان خلية متورطة والأنسجة، ويمكن دمجه مع نظام eyFLP-MARCM. للأسف، تستغرق العملية الغازية عدة ساعات إلى أيام، والإطار الزمني الذي يتنافى مع الحفاظ على اليرقات على قيد الحياة في حين لا يزال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
