Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.
Introduction
סרטן מייצג את אחד קבוצה הטרוגנית גנטית ביותר של מחלות, אשר שכיחות ותמותה גדל באופן דרמטי, במיוחד בקרב קשישים ברחבי העולם. הסרטן שמקורו clonally מתא ייזום גידול כי נמלט מנגנוני מדכא גידולים טמונים ומחלק יצא מכלל שליטה. ההצטברות ההדרגתית של נגעים גנטיים בשיתוף פעולה לקידום צמיחה, שגשוג תנועתיות תוך עיכוב מוות והבחנה הופכת את יתר השפירה הראשוני לתוך גידול ממאיר, הגרורה וקטלנית מאוד. זה הפך להיות ברור כי בנוסף שינויים גנטיים, התקדמות הגידול דורש שינויים stroma שמסביב crosstalk בין הגידול לבין מספר סוגי תאים (למשל, פיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ואת אנדותל) ב microenvironment שלה. הבנת העקרונות המולקולריים שבבסיס שינוי ממאיר כולל אינטראקציות stroma גידול היא בעל חשיבות רבה לפיתוח מונע וטיפולtion ואסטרטגיות המיון המוקדם, כמו גם טיפולים חדשים ויעילים להילחם גרורות סרטן עמידות לתרופות.
זבוב הפרות תסיסנית הפכו למערכת אטרקטיבית חקר הסרטן 1-4 בשל הזמן ההדור המהיר שלה, שימור מדהים של איתות צמתים בין זבובים ובני האדם, יתירות גנטית מוגבלת ועושר של כלים גנטיים מתקדמים המאפשרים מניפולציה של כמעט כל גן ב באופן מצומצם זמנית מרחבית. גנטי גידולים מוגדרים של ממאירות שונות יכולים להיות מהונדסים reproducibly תסיסנית ידי החדרת gain- ופסד של פונקצית מוטציות קבוצת משנה של אבות ב רקמת סוג ברה אחר באמצעות טכניקת MARCM 5. הכלי MARCM משלב FLP / FRT (FLP recombinase / FLP זיהוי מטרות) בתיווך רקומבינציה mitotic 6 עם FLP-אאוט 7 ו Gal4 / כטב"מ (רצף הפעלת Upstream) גן המטרה 8מערכות ביטוי 9. עם ביטוי שיטה זו של כל transgene כטב"מ מבוסס, כולל אונקוגן או cDNAs חלבון פלואורסצנטי או חזרות DNA הפוכות עבור להשתקת גני מושרה dsRNA, יוגבל שיבוט של תאים שאבד מוקד גנטי ספציפי וכן מדכא Gal4 עקב רקומבינציה (איור 1 א). תיקוני משובטים מסומנים פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבוני ניאון אדום (למשל, RFP, DsRed, mCherry) ניתן לעקוב בקלות ברחבי פיתוח, מבודד ונותח. חשוב לציין, התנהגותם ניתן להשוות ישירות לרקמת סוג הבר הסמוכה. לפיכך, שאלות ענייניות לתא אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות של נגעים גנטיים ניתן ללמוד בנוחות. בדומה ליונקים, רק שיבוטים שבו מספר נגעים שבעור משולבים להפוך לממאירים תסיסנית ו לשחזר סימני היכר עיקריים של סרטן יונק. הם overproliferate, להתחמק אפופטוזיס, לגרום דלקת, להיות בן אלמוות invasive, ובסופו של דבר הורג את המארח 10-17.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצור גנטי מוגדרים גידולים המשובטים בעיניים / מחושים ומוח הרקמות של זחלים תסיסנית באמצעות טכניקת MARCM. השיטה מסתמכת על מנייה בודק MARCM המבטא את recombinase FLP שמרים בשליטת המשפר חסר העיניים (eyFLP) 18,19. בדרך זו, שיבוטי GFP שכותרתו נוצרים בשני האפיתל peripodial ואת העמודים של EAD ואת neuroepithelium של המוח בכל שלבים עובריים זחל (איור 1 א ', ב' ו-התייחסות 20). משובטים ניתן בעקבות בקלות עד לבגרות כמו EAD מפתחת לתוך עין המבוגרת, כמוסת האנטנה והראש בעוד neuroepithelium מוליד neuroblasts המייצרים נוירונים באונה אופטיים מובחנים.
כדי להקל על אפיון מולקולרי, פונקציונלי פנוטיפי נרחב של רקמת הפסיפס, אנחנו דהסופר פרוטוקול לנתיחה של EAD והמוח מן זחלי instar השלישיים מתאר כיצד לעבד אותם במשך שלושה יישומים שונים: (i) זיהוי של כתבי ניאון מהונדסים immunostaining, (ii) כימות הפולשנות גידול (iii) ניתוח ביטוי גנים משנה באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) או רצף mRNA תפוקה גבוהה (mRNA-seq) (תרשים 1C).
פרוטוקול immunostaining יכול לשמש כדי לחזות חלבון כלשהו של עניין עם נוגדן ספציפי. כתבי תעתיק פלורסנט מהונדסים לספק מידע spatiotemporal נוח ומדויק על פעילות מסלול איתות מסוימת. תא שושלת כתבים ספציפיים, ומצד שני, משקפים שינויים איכותיים וכמותיים אוכלוסיות תאים בתוך הרקמה פסיפס ובקרב גידולים של גנוטיפים ברורים. כימות התנהגות פולשנית מקל על השוואה של ממאירות הגידול בין גנוטיפים. לבסוף, פרוטוקול המתאר איסוף ועיבוד של EAD פסיפס עבור בידוד RNA הוא מתאים הן יישומים במורד הזרם קטן בקנה מידה גדול כגון שעתוק לאחור ולאחריו qRT-PCR ו-seq mRNA רחב הגנום, בהתאמה. הנתונים האיכותיים והכמותיים המתקבלים מבחנים אלה מספקים תובנות רומן לתוך ההתנהגות החברתית של גידולים משובטים. יתר על כן, הם מייצרים בסיס איתן ללימודים תפקודיים על עצם את התפקיד של גנים בודדים, רשתות גנטיות microenvironment גידול בשלבים שונים והיבטים של tumorigenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עבודה זו מנצלת את eyFLP1; מעשה> y +> Gal4, כטב"מ- GFP; FRT82B, גיגית-Gal80 MARCM 82B הירוק הבוחן קו 11. חציית בתולות בוחן MARCM 82B הירוקה לזכרים של זנים כגון w; כטב"מ-A; כטב"מ-ב RNAi, גנוטיפ mut ג FRT82B יניב צאצאים שבו רקומבינציה mitotic תתרחש בין הזרועות התקינות של כרומוזומים ההומולוגיים 3 rd. בדרך זו, שיבוטים מוטציה הומוזיגוטים הגן c ממוקם דיסטלי לאתר FRT82B יופק בתוך neuroepithelium EAD והמוח. שיבוטים אלה יבטאו GFP, transgene ו dsRNA לכוורו הגן (איור 1 א). קווי הבוחן eyFLP-MARCM שונים עבור רקומבינציה על X, 2L, 2R, 3L ו 3R הוקמו והם זמינים בקהילה זבוב.
1. טיפול טוס, צלבים, ו Staging
- הרחב את המניה בודק MARCM המתאים בטמפרטורת החדר על ידי אכלוס bo מרוביםttles בעת ובעונה אחת. תהפוך את המבוגרים לתוך בקבוקים טריים כל 2-3 ימים, כך בתולות מספיק שניתן לגבות עבור צלבים שלאחר מכן.
הערה: בעת איסוף בתולות, למנוע חשיפה ממושכת ל- CO 2 כמו זה פוגע בפוריות נשית. - בהתאם בסולם של הניסוי, להגדיר צלבים לטוס צלוחיות באמצעות לפחות 10 בתולות בוחן MARCM ו -4 גברים (למשל, הדמיה של כתבי ניאון ו immunostaining) או בבקבוקים עם לפחות 30 בתולות ו -10 גברים (למשל, עבור בידוד RNA וכימות הפולשנות).
- תרי צאצאים של 25 מעלות צלזיוס מתחת יום ארוך 16 שעות / 8 שעות מחזור אור כהה. תהפכו להורים לתוך צלוחיות / בקבוקים חדשים כל 24 שעות כדי להקל staging לשחזור של הזחלים כדי למנוע צפיפות יתר.
הערה: החל ביום 6 לאחר ההטלה (AEL), ההאכלה להפסיק זחלים מלא instar השלישית המנוחה, להתחיל נדודים וזן pupariation. לעומת זאת, תחילת מעבר זחל-הגלמים ניתן לדההנח או אפסי זחלים עם EAD נושאות גידולים המשובטים hyperplastic או ממאיר.
2. איסוף שלישי Instar זחלים
- עבור immunostaining, לאסוף כ -20 זחלי instar שלישיים מאוחר (נדודים על הקיר לבין אלה של גודל בגוף מקביל מהמזון). שימוש במלקחיים כדי להרים זחלים בעדינים מהבקבוקון או הבקבוק ולהעביר אותם לתוך צלחת זכוכית עובר מלאה מלוח פוספט שנאגר (PBS).
- עבור בידוד RNA וכימותי הפולשנות, לאסוף לפחות 80 זחלי instar שלישיים מאוחר (נדודים על הקיר לבין אלה של גודל בגוף מקביל מהמזון). השתמש בקבוק להשפריץ להשפריץ PBS לתוך בקבוק מרחף שמכיל זחלים עד פני השטח מכוסים.
- לרכך את השכבות העליונות של מזון עם מרית ויוצקים את מחית מזון המכיל הזחלים לתוך צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים זחלים ולהעביר אותם לתוך צלחת זכוכית עובר המלאה PBS.
- לשטוף זחלים עם PBS until כל האוכל שיורית מוסר. בדוק את הזחלים תחת סטראו הניאון עם 8 עד 16X הגדלה כדי להתעלם מכל "הזחלים נמר" שנושאים כתמי GFP החיובי אקראיים בכל גוף הזחל (איור 2 א, 2 ב ו ראה סעיף דיון).
הערה: עבור בידוד RNA כולל שלב כביסת הלפני אחרון 70% EtOH דקות 1. - מניח את הצלחת המכילה זחלים שנבחרו ב PBS על קרח עד לנתיחה. זחלי תהליך בתוך 30 דקות כדי למנוע תופעות לוואי של קור ורעב.
3. Dissection של הזחלים
- כדי לנתח את EAD תחת סטראו, להשתמש זוג אחד של מלקחיים ללחוץ על החלק האמצעי בעדינות של הזחל נגד בתחתית צלחת זכוכית. בעזרת המלקחיים השניים, לתפוס את פי ווי זחל ולמשוך אותם מהגוף (איור 2 ג).
הערה: כוח המשיכה היא לעתים קרובות מספיק כדי לשבור את גבעולי הראיה המקשר את EAD פאיr אל האונות במוח. אם המוח או חלקיו להישאר קשור EAD ונוכחותם אינה רצויה עבור יישומים נוספים, לחתוך את הגבעולים האופטיים עם עזרה של שני זוגות מלקחיים. עבור גידולי פולשני (למשל, ראס V12 scrib 1) הקשר בין EAD ואת האונות במוח הופך מוסתר יותר ויותר עם הזמן על ידי overgrowing ו תאים נודדים המשובטים.- כדי להכין את מורכבות EAD / המוח עם חוט עצב גחון ללא פגע (VNC) (איור 2 ד), להשתמש במלקחיים כדי לחתוך זחל באמצע הגוף. מחק את חצי האחוריים.
- החזק את החצי הקדמי של גוף הזחל בין הקצים אחד מלקחיים, להעיף את הזחל מבפנים החוצה, בכך שדחפו ווי הפה עם קצה המלקחיים השניים על ידי גלגול לציפורן על זה עם זוג המלקחיים הראשון.
- בעזרת מלקחיים להסיר את כל הרקמות הזרות בקפידה (למשל, בלוטות רוק, שומן גוף, ואת הבטן) תוך השארת זוג EAD אובמתחם EAD / המוח מחובר ווי הפה. להתיר את הפה ווים מן לציפורן שמעליה. לשחרר את VNC על ידי ניתוק תחזיות axonal הארכת השרירים בגוף האפידרמיס (1B דמויות, 2C, 2D).
הערה: פי הווים לאפשר מניפולציה בטוחה של רקמות עם מלקחיים להקל טביעתה יעילה יותר והכרה קלה של רקמות במהלך כביסה. גזור מורפולוגיה שינוי EAD יחסית מהר כאשר כל הזמן מבולבל ב PBS. הגבל את הזמן לנתיחה כדי 20-30 דקות. - כדי להעביר את רקמות, מעיל טיפ micropipette P20 ידי pipetting הגוף הנותרים שלדי מספר פעמים למעלה ולמטה. כדי להעביר את מתחמי EAD / מוח גדול יותר, לחתוך את קצה micropipette P20 במספריים.
הערה: הליך הציפוי הוא קריטי כדי למנוע הידבקות ואובדן הרקמה גזורה במהלך העברה. שימוש micropipette P20 ממזער את העברת PBS לתוך פתרון מקבע, הגבלת דילול רצוי.- עבור immunostaining, להעבירגזור EAD לתוך צינור 0.5 מ"ל מלא 400 μl paraformaldehyde 4% מקבע (PFA). השתמש 1.5 צינור מ"ל עם 1 מ"ל PFA עבור EAD גדול / מתחמי המוח מיועד הניקוד הפולשנות.
זהירות: PFA היא רעילה ביותר. יש להשתמש בכפפות וביגוד מגן. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים או ריריות. - עבור בידוד RNA להעביר את EAD גזור לתוך צלחת זכוכית חדשה מלאות PBS קר. שימוש במלקחיים כדי לנקות EAD מבלוטות טבעת הלימפה, כדי למזער זיהומים מדגמים.
- לנתק את EAD מן הפה הווים על ידי ניתוק הקשר בין דיסקי אנטנת ווי פה באמצעות מלקחיים (2E איור). כדי למנוע שפלת RNA וממצאי ביטוי גנים, להגביל את זמן הניתוח עד 30 דקות. עבור לשלב 7.
הערה: חוקר מנוסה יכול לנתח כ -60 זחלים בזמן למעט 30 דקות הדרוש לאיסוף כביסת זחלים. תשואות RNA סה"כ תלוי בגודל EAD שמשתנה בין גנוטיפים developmentaבשלבי l. דיסקציה של זוגות 80-100 מלא EAD מן זחלי instar שלישיים מנוחים אמורה להניב רנ"א הכל 5-8 מיקרוגרם.
- עבור immunostaining, להעבירגזור EAD לתוך צינור 0.5 מ"ל מלא 400 μl paraformaldehyde 4% מקבע (PFA). השתמש 1.5 צינור מ"ל עם 1 מ"ל PFA עבור EAD גדול / מתחמי המוח מיועד הניקוד הפולשנות.
תיקון 4., Immunostaining, ו השמה
- תקן דגימות מקבע PFA במשך 25 דקות תוך nutating בטמפרטורת החדר. שעת הקיבעון יכול להתארך עד 60 דקות מבלי לשנות מורפולוגיה רקמות ואת antigenicity של חלבונים.
- הסר את דגימות מקבע לשטוף עם PBST (PBS עם 0.1% Triton X-100) שלוש פעמים במשך 10 דקות באמצעות nutator. השתמש נפח מספיק של PBST עבור כל צעד כביסה (400 μl / 0.5 צינור מ"ל).
הערה: קבוע מתחמי EAD / המוח מיועד הניקוד הפולשנות אינם דורשים immunostaining. אות ה- GFP נשארה גם גלויה לאחר קיבוע. עבור לשלב 4.4 לנתיחה הסופית.- עבור immunostaining, רקמת בלוק 200 μl של פתרון לחסימת (PBST עם 0.3% BSA) במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם חסודהנוגדנים האר"י מדוללים 100 μl של פתרון חסימת הלילה ב 4 ° C תוך רעד בעדינות. עיין גיליון נוגדן ראשוני או ספרות שפורסמה בגין דילול נוגדן מומלץ.
הערה: דילול הנוגדן הראשוני עלול צריך להיות מותאם. - לאחר חמש שוטף 10 דקות ב PBST, רקמת הכתם עם נוגדנים משני ניאון מדולל חסימת פתרון תוך רעד בעדינות במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף דגימות שלוש פעמים 10 דקות PBST.
- דגירה עם חסודהנוגדנים האר"י מדוללים 100 μl של פתרון חסימת הלילה ב 4 ° C תוך רעד בעדינות. עיין גיליון נוגדן ראשוני או ספרות שפורסמה בגין דילול נוגדן מומלץ.
- עבור immunostaining, רקמת בלוק 200 μl של פתרון לחסימת (PBST עם 0.3% BSA) במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.
- החלף PBST עם 500 μl של פתרון DAPI מכתים. כדי לתייג F- אקטין, להוסיף phalloidin מצומדות כדי פלורסנט לצבוע פתרון DAPI מכתים. לאחר 15 דקות nutation בחושך, לשטוף רקמות פעם במשך 10 דקות עם PBST.
הערה: F- אקטין תיוג יכול להתבצע באופן עצמאי של מכתים DAPI. - עבור השלב הסופי לנתיחה, להעביר רקמות בחזרה לתוך צלחת זכוכית PBS מלא באמצעות pi 1 מ"לpette. באמצעות שני זוגות מלקחיים קליפ את פי ווים.
- הפרד את המוח אשר ישמש כימות של הפולשנות מן EAD על ידי חיתוך הגבעול האופטי כמו EAD מגודל עלול להקשות על הניתוח.
- מניח ירידה של מדיום ההרכבה (15 μl עבור coverslip 22 מ"מ x 22 מ"מ) על שקופית אובייקטיבית. בעזרת טיפים מלקחיים, להפיץ המדיום לתוך שכבה דקה. העבר EAD, המוח או מתחמי EAD / המוח לתוך המדיום גובר עם micropipette P20.
- השתמש בעצות מלקחיים או מוט טונגסטן להפיץ רקמות וליישר את VNC בשקופית.
- כדי למנוע היווצרות של בועות תוך הרכבה, המגע הראשון קצה אחד של coverslip אל המדיום גובר ואז מורידים לאט על הרכבה בינונית בעזרת מלקחיים. השתמש חתיכות קטנות של נייר סינון או רקמות לנגב לספוג הרכבה בינונית עודף בקצוות coverslip.
הערה: DABCO / פולי (ויניל אלכוהול) 4-88 הרכבה מתקשה בינוניב 4 ° C תוך שעה. שקופיות יכול להיות מאוחסן במשך חודשים 4 ° C.
5. הדמיה Confocal
- רוכשת חלקים confocal יחיד ערימות באמצעות מיקרוסקופ confocal מצויד 20X, מטרות שמן 40X ו 60X.
- למנוע רווית פיקסל. השתמש באותם פרמטרים רכישת התמונה כולל רזולוציית התמונה, כוח קלט לייזר, רווח, אופסט, מיצוע מסגרת, גודל צעד בסדרה-z ולשמור הגדרות אלה עבור כל גנוטיפים כדי לאפשר השוואתם של עוצמות פיקסל בין גנוטיפים שונים 21,22.
הערה: להדמיה של מורכבות EAD / מוח, ליצור תחזיות מקסימלית לתפור בהתאמה, תמונות שכנות. להכנת תמונה סופית, השתמש בתוכנה לעיבוד תמונות פוסט להרכבה בלוח וכדי לכוון את הבהירות והניגודיות.
כימות 6. גידול הפולשנות
- גדר שיטת ניקוד שתאפיין את הרמות השונות של invasivenes גידולזה בהתחשב דפוס המרחבים של פלישה ואת כמות תאי GFP החיובי מתפשטים לתוך מוח VNC. הכן מגיליונות ההערכה למסמכים (איור 3 א).
- הר לפחות 80 קבוע המוח ללא שינוי בכל גנוטיפ בשקופית אחת באמצעות 40 μl של הרכבה בינונית לכל 24 מ"מ x 50 מ"מ coverslip.
- כדי לאפשר ניקוד משוחד, לשאול צד ניטראלי לאנונימי השקופיות, כך שנוהל הניקוד משוחד. להעריך שקופיות ואנונימי ידי שני חברי המעבדה באופן עצמאי. לחשוף גנוטיפים רק לאחר הספירה נגמרה.
- להעריך את מידת ממאירות על ידי הבקיע עיוור של המוח רכוב תחת סטראו פלורסנט מצויד להגדיר מסנן GFP. השתמש סמן כדי לתייג את המוח כי נצפה כבר להימנע מספירה כפולה (איור 3 ב).
- חישוב אחוזי המוח נופל לתוך אחת מהקטגוריות פולשנית המוגדרות לכל גנוטיפ. קבע את הים הסטטיסטיignificance באמצעות מבחן חי בריבוע (איור 3 ג).
7. בידוד RNA, טיפול DNase, ולבדוק את איכות
הערה: כל ריאגנטים (פתרונות, plasticware) שמשמש בשלבים הבאים צריך להיות חופשי של פעילות RNase. תמיד ללבוש כפפות ולהשתמש במנדף כימי לעבודה עם ממסים אורגניים.
- מעביר את EAD הנקי עם טיפ micropipette P20 מצופה לתוך 1.5 מיליליטר צינור.
- בואו כיור רקמה על החלק התחתון של הצינור, להסיר בזהירות PBS ולהחליפה 100 מגיב μl תמוגה RNA (מספיק עד 140 EAD).
- Lyse הרקמה על ידי vortexing. בשלב זה, דגימות יכולות להיות עמוקות קפוא בחנקן נוזלי מאוחסן ב -80 ° C או מעובד באופן ישיר עם פרוטוקול בידוד RNA סטנדרטי.
הערה: דוגמאות של גנוטיפים דומה סיבובים לנתיחה מרובים ניתן ונקווה פעם מגיב תמוגה RNA. - מלאו את נפח דגימה 0.9 מ"ל עם מגיב תמוגה RNA. להוסיף 0.2 מ"ל של כלורופורם ומערבבים דגימות Vigorously במשך 15-20 שניות.
- לאחר דגירה 2 עד 3 דקות בטמפרטורת החדר, בצנטריפוגה דגימות XG 10,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- העבר בשלב מימית העליון חסר צבע RNA המכיל לתוך צינור טרי מבלי להפריע את שלבי הביניים. התרחקו שלבי מכיוון שהיא מכילה חלבונים ו- DNA הגנומי.
הערה: נפח התאושש צריך להיות כ -60% מנפח של מגיב תמוגה RNA המשמש המגון. - לזרז את הרנ"א על ידי הוספת 0.5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. וורטקס דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה דגימות XG 10,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C..
- בטל supernatant ולשטוף את גלולת RNA פעם עם 600 μl של אתנול 75%. אחרי מערבולת צנטריפוגה קצרה (XG 10,000 במשך 7 דקות ב 4 ° C) וזורק את כל אתנול ולתת גלולת RNA-אוויר יבש למשך 5-10 דקות צבת הצינור הפתוח על רקמות נקיות לנגב.
הערה: גלולת RNA עשויה להיות גלויה כמו st לבן / אטום זעירבשלים בתחתית הצינור או סמויה. טיפות אתנול הנותרים ניתן להסיר בזהירות עם קצה micropipette P10. - ממיסים רנ"א 50 μl מים DEPC שטופלו על ידי vortexing או עובר פתרון כמה פעמים באמצעות קצה פיפטה.
- כדי למזער זיהום עם הדנ"א הגנומי, לטפל RNA הכולל עם DNase על ידי הוספת 50 μl של תערובת המכילה 1 μl של DNase (2 U / μl) ו -10 μl של 10x חיץ DNase במים DEPC שטופלו. וורטקס ו ספין למטה.
- דגירת דגימות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום במשך 30 עד 40 דקות. לאחר דגירה, להוסיף 100 μl של מים DEPC שטופלו לתוך מדגם זה.
- כדי להשבית את הפעילות האנזימטית ו- RNA נקייה DNase, להוסיף 200 μl של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25: 24: 1) פתרון, מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות דגימות ב XG 10,000 במשך 7 דקות ב 4 ° C.
- להעביר בזהירות את השלב מהימי העליון המכיל RNA לתוך צינור טרי. להוסיף נפח שווה (200 μl)של כלורופורם, לערבב וחזור על צעד צנטריפוגה מלמעלה.
- אסוף בקפידה השלב העליון המשקע RNA על ידי הוספת 1/10 נפח של נתרן אצטט M 3, pH 5.2 ערוכים DEPC H 2 O ו 2.5 כרכים של אתנול 100%. מערבבים היטב על ידי vortexing.
הערה: הוספת 0.5 גליקוגן μl (20 מיקרוגרם / μl) כדי שילוב ממטרים עוזרת לדמיין גלולת RNA. כדי להקטין את איבוד RNA, השתמש siliconized, נמוך מחייב צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge. - משקע RNA ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 שעה.
ההערה: הדגירה עלולה להתבצע בין לילה. דוגמאות ניתן להציב ב -80 ° C, כמו גם. - גלולה הרנ"א על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. לשטוף גלולה ויבשה, לאחר התיאור 7.9.
- ממיסים רנ"א 10-15 μl מים DEPC שטופלו. RNA החנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- לקבוע כמות וטוהר של RNA על ידי מדידת OD ב 230 ננומטר, 260 ננומטר ו -280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. חישוב שיתוף RNAncentration ידי החלת האמנה כי 1 OD ב 260 ננומטר שווה 40 מיקרוגרם / מ"ל RNA.
הערה: היחס 260/280 של "טהור" RNA שווה 2.0 ואילו יחס 260/230 צריך להיות בטווח של 2.0-2.2. דגימות רנ"א עם יחס 260/280 בין 1.7 ו -2.0 מתאימות ליישומים במורד כגון סינתזת cDNA. עבור הכנת ספריות mRNA-seq את האיכות והכמות של RNA צריכה להיבדק באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית. יחס 28S / 18S צריך להיות מעל 1.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את הפוטנציאל של טכניקת eyFLP-MARCM ליצור תיקוני מסומן GFP של גנוטיפים שהוגדרו תסיסנית EAD, שלושה סוגים של שיבוטים היו מושרים: (1) GFP להביע בקרה בלבד (2) גידולים ממאירים הבעת טופס שבעור של קטן G- חלבון ראס (ראס V12) ב רקע של אובדן הומוזיגוטים של שרבוט גנים מדכאי סרטן (scrib 1) ו- (3) overgrowing אבל לא פולשנית ראס V12 scrib 1 JNK שיבוטים DN, שבו קינאז יוני- N-terminal (JNK) היה מובטל ידי ביטוי בצורה שלילית הדומיננטית שלה (האיור 4, לוח 1 עבור גנוטיפים). הוכח כי הפולשנות של גידולים המשובטים scrib 1 V12 ראס דורשת הפעלה סוטה של איתות JNK ותעתיק ההמשך שלה בגורמי 10,12,23,24. יתר על כן, ראס V12 scrib 1 תסיסנית, וכתוצאה מכך חדירת תאי מערכת החיסון (המכונה hemocytes) לתוך 14,25 EAD.
כדי לפקח על רמות הפריסה המרחבית של פעילות JNK בתוך הרקמה פסיפס ובקרב גידולים של גנוטיפים שונים, מהונדס הוקמה, הכתב JNK המגיבים TRE-DsRed הועסק 26. מיקרוסקופיה Confocal של EAD גזור, קבוע EAD / מתחמי המוח גילה upregulation ניכרת של פעילות הכתב TRE-DsRed ברקמות נושאות גידולים V12 scrib 1 ראס ממאיר (איור 4B). Scrib V12 ראס DsRed שכותרתו אות 1 שיבוטים EAD (איור 4B) וכן תאים סרטניים המשתרעת על האונות במוח ופולשת לתוך VNC (איור 4E, 4F). לעומת זאת, פעילויותיו כתב TRE-DsRedty נשארה מוגבלת למחרוזת של תאים המשתרעים המחושים לחלק העין של דיסקי ביקורת (איור 4 א '). חסימת איתות JNK הביאו לירידה דרמטית של האות TRE-DsRed ב scrib V12 ראס המשובטים 1 גידולים JNK DN (איור 4C, 4D). נתונים אלה ובכך לספק ראיות פונקציונליות עבור דרישה של JNK איתות כדי להפעיל את תגובת תעתיק TRE התלויה בגידולי V12 scrib 1 ראס מהמאיר. עיתונאי השושלת ספציפי hmlΔ-DsRed, המציאו לאיתור תסיסנית hemocytes 27,28 הראה הצטברות של תאי מערכת החיסון ברקמות נושאות scrib V12 ראס ממאיר 1 גידולים (איור 5). בניגוד לכך, רק hemocytes אחת או כמה תיקוני hemocyte מקומיים אותרו scrib המלא ראס V12 1 JNK DN הפסיפס EAD ורקמות מוח(איור 5 א, 5 ג). Immunostaining עם נוגדנים נגד Hemese הפאן hemocyte (H2) 29 אישר את זהות התא החיסונית של תאים חיוביים hmlΔ-DsRed (5D איור, 5E). 12,23,24 בקנה אחד עם דיווחים שפורסמו, כימות משוחדת הפולשנות גידול אומתה תפקיד מרכזי של JNK איתות בקידום חדיר גידול לתוך אונות המוח הסמוכות VNC (איור 3 ג). לבסוף, RNA הכולל היה מבודד מן EAD פסיפס. דגימות היו נתונים או כדי qRT-PCR או מנותח על מערכת אלקטרופורזה אוטומטית איכות וכמות. איור 6 א תערוכות upregulation JNK התלוי המשמעותית של מטלו מטריקס 1 (mmp1) תמליל EAD נושאות V12 ראס ממאיר scrib 1 גידולים משובטים, המאשרת את בעבר הממצאים המתפרסמים 12,24,30,31. הערכה של רנ"א סך באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית הראתה tכובע משולש דגימות EAD עצמאיות היו יחס 28S / 18S מעל 1.8 (איור 6). עם זאת, RNA EAD 2 היה מושפל חלקית, דבר שהתבטא בגידול למרוח על הג'ל (איור 6 ג). לעומת זאת, מדגם EAD 3 היה ריכוז נמוך. להקות מרובות של משקל מולקולרי גבוה יותר על תמונת ג'ל (6B איור) ופסגות קטנות על electropherogram (איור 6 ג), גם הציעו זיהום הדנ"א. לפיכך, רק מדגם EAD 1 יהיה מתאים כנה של ספריית mRNA-seq.
איור 1: שרטוטים של מערכת MARCM עבור דור של פסיפסים גנטיים תסיסנית EAD והיישומים במורד זרם (א) מערכת MARCM מאפשרת דור של טלאים משובטים עם נגעים גנטיים שהוגדרו סוג פראי אחר (הטרוזיגוטיים).הקשר. הביטוי של FLP תחת שליטה של מקדם רקמות ספציפיות (למשל, חסר עיניים) מזרז רקומבינציה בין שני האלמנטים FRT איגוף את הקלטת STOP המסומנות גן צהוב (Y) (מעשה> y +> Gal4). לאחר ההסרה של קלטת STOP, הביע בכל מקום בגוף activator תעתיק Gal4 (מעשה-Gal4) יכול לנהוג ביטוי של כל transgene כטב"מ מבוסס כגון כטב"מ- GFP (גם כטב"מ-ras V12). בתא הורים, לעומת זאת, פעילות Gal4 חסומה באמצעות מדכא Gal80 שביטויים נשלטים על ידי אמרגן טובולין (גיגית-Gal80). בשלב G2 של מחזור התא, FLP כטווח להעברת של כרומטידה אחות הלא בין כרומוזומים הומולוגיים דיסטלי באתרי FRT. הפרדה של הכרומוזומים רקומביננטי במהלך מיטוזה יהיה להצמיח שני לתאי הבת, מוטציה הומוזיגוטים להיות אחד עבור מוקד גנומית מסוים (למשל, scrib
איור 2: מיון של זחלי instar שלישיים דוגמאות מייצגות של EAD ו- EAD / מוח מתחמים לשמש ליישומים במורד זרם שונים (AB) micrographs פלורסנט של שיבוטי GFP שכותרתו מלאי נושאות זחלי instar השלישי מושרים עם בוחן eyFLP-MARCM 82B הירוק.. (א) זחל שליטת נציג עם שיבוטים מוגבלים אונות EAD והמוח. (ב) דוגמא של "זחל נמר" נושאת שיבוטי GFP החיובי ברקמות שונות בגוף. (ג) תמונות Brightfield של גזור EAD ו- (ד) מתחמי EAD / מוח מצורף פי הווים, ו (ה) EAD ניקו מכל רקמת הזרים כולל ווי פה. ברי סולם = 2 מ"מ (AB) ו- 500 מיקרומטר (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. כימות הפולשנות גידול (א) תמונות confocal פלורסנט של מוח גזור מראס V12 scrib 1 זחלים (7 ימים AEL) מייצגים את הדוגמות האמיתיות של ארבע הדרגות השונות של הפולשנות גידול החל פולשני (ציון 0), אחד אונה במוח פלש (ניקוד 1), בשתי אונות במוח פלש (ציון 2) על חדירת גידול חזקה עם רקמת משובטים מכסה בשני אונות במוח והזנת VNC (ציון 3). תמונות הינן מידע צופה פני סעיפים confocal מרובים ודוגמאות ציון 2 ו -3 הם תפרו מ 2 x 2 תמונות confocal. ברי סולם = 100 מיקרומטר. (ב) דוגמא שקופיות מיקרוסקופ אנונימי עם מוח קבוע המשמשת לייצור משוחדהבקיע תחת סטראו ניאון. מוח קלע מסומן עם עט כדי למנוע רישום כפול. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (C) בהשוואה לגידולי scrib 1 V12 ראס פולשני מאוד, עיכוב של JNK איתות (ראס V12 scrib 1 JNK DN) פלישה בוטלה של תאים משובטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הפעלת כתב TRE-DsRed תעתיק 'V12' ראס ממאירי הגידולים המשובטים '1 scrib הוא תלוי JNK (א. TRE-DsRed שכותרתו פס דק של תאים בורחים מחושים לחלק עין (ראשי חץ). (ב) פעילות של הכתב TRE-DsRed שופרה באופן ניכר בראס V12 scrib 1 שיבוטים GFP חיובי לעומת האפיתל EAD הלא משובט שמסביב. (ג) עיכוב של פעילות JNK הביא לירידה מובהקת עוצמת האות DsRed שיבוטים ראס V12 scrib 1 JNK DN. (ד) שיפור נוסף של אות DsRed חשף את ההפעלה הלא אוטונומית של JNK איתות בתאים המקיפים את שיבוטי V12 ראס scrib 1 JNK DN. (ה) ביום 8 AEL, ראס V12 scrib 1 תאים overgrew הדיאלוג האירופי-הערבי כולו ומפזרים מעל את האונות במוח אל VNC (חץ). (F) התאים המשובטים פלישה VNC (תקריב של מטר באזורarked ידי החץ E) הועשרו לאות DsRed. (AC) תחזיות צג סעיפי confocal מרובים, (E) הן תפורות מתמונות confocal 3x3 ו (D, F) מייצג סעיף בודד. ברי סולם = 50 מיקרומטר. EAD, עין / דיסק מחושים; BL, אונה במוח; VNC, חוט עצב גחון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. Lineage ספציפי hml Δ -DsRed הכתב מהונדס מגלה העשרת ראס V12 scrib 1 גידולים הקשורים hemocytes (א) EAD שליטה, hmlΔ-DsRed שכותרתו הכתב CLU hemocyte sters כלוא בתוך החריצים של עין האפיתל מחושים. (ב) רקמת EAD והמוח מורכבת ראס V12 scrib 1 גידולים מסומן GFP הראה הגדלת מספר hemocytes פזורים בכל רחבי רקמות המשובטים. (ג) מספר hemocytes הקשורים ירידה דרמטית על עיכוב של איתות JNK בראס V12 scrib 1 JNK רקמות פסיפס DN. (DE) HmlΔ-DsRed hemocytes חיובית גם תויגו עם H2-נוגדן המאתר את Hemese סמן הפאן hemocyte. (AC) תחזיות צג סעיפי confocal המרובה, (א) הוא תפורים מ 2 x 2 ו (BC) הם תפרו מן 3 x 3 תמונות confocal. (DE) המייצגים מקטעים יחידים. ברי סולם = 100 מיקרומטר (AC) ו -10 מיקרומטר (DE). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:.. הערכת הכמות והאיכות של רנ"א סך מבודד EAD הגזור (א) דוגמא מייצגת של תוצאות qRT-PCR באמצעות ארבע חזרות ביולוגיות עבור כל גנוטיפ Mmp1 רמות תמליל היה מנורמל rp49. מקפלים שינויים בביטוי הגנים חושבו בשיטת עקומת סטנדרט ביחס 32. הנתונים הם ערכים ממוצעים ± SEM; *** P <0.001 באמצעות שני הזנב המזווג של סטודנט מבחן t עם שונות שוויוניות. (B, C) הערכת איכות הכוללת RNA וכמות באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית. התמונה ג'ל הווירטואלית (ב) מציגה את שתי להקות בולטות של 18S ו -28 rRNAs כי מתאים הפסגות המוגדרות היטב על electropherograms (C). זיהום הדנ"א והשפלה RNA באים לידי ביטוי כמוmear (ראשי חץ) ולהקות ופסגות extranumerary (חיצים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| זנים טוס | מקור / תגובות |
| eyFLP1; מעשה> y +> Gal4, כטב"מ- GFP; FRT82B, גיגית-Gal80 | eyFLP-MARCM 82B הירוק Tester 11 |
| w; כטב"מ-ras V12; FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; כטב"מ-ras V12; כטב"מ-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | במחקר זה, w; hmlΔ-DsRed מן קטיה ברוקנר 28 |
| w; כטב"מ-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B | מחקר זה |
| w; כטב"מ-ras V12 hmlΔ-DsRed; כטב"מ-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | מחקר זה |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | במחקר זה, w; TRE-DsRed מ דירק Bohmann 26 |
| w; כטב"מ-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B | מחקר זה |
| w; כטב"מ-ras V12 TRE-DsRed; כטב"מ-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | מחקר זה |
טבלה 1: סיכום של קווי תסיסנית השתמשו במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקות כדי ליצור פסיפסים גנטיים תסיסנית הם בין הכלים המתוחכמים ביותר לניתוח וטיפול גן פונקצית 33. מערכת eyFLP-MARCM הוכיחה חזקה ויציבה שכן היא מאפשרת האינדוקציה של מסומן באופן ויזואלי, שיבוטים מוגדרים גנטי באופן מוגבל מרחבית, כלומר, ברקמות שבו משפר חסר העיניים היא 9,18 פעיל. הדבר חשוב במיוחד כאשר נגעים גנטיים מרובים משולבים אותם התאים. למרות היותו מאוד אלה תיקונים סוטים להתיר התפתחות זחל כאשר מוגבל neuroepithelia EAD והמוח, הם עלולים לגרום הקטלניות כאשר מפוזרים בכל גוף הזחל כמו במקרה של חום הלם שבשליטת FLP (hsFLP) שיבוטים. באופן משמעותי, אינדוקציה של שיבוטים באפיתל EAD הזבוב שבו מופעלת אונקוגנים לשלב עם פסד של מדכאי גידול משכפלים את ההופעה ואת ההתפתחות של גידולי אפיתל מוצקים בכמה סוגי סרטן אנושיים. הוwever, המערכת גם יש מגבלות שיידונו בקצרה. בהתחשב בכך יש חרקים מערכת דם פתוחה, גרורות נכון כפי שנצפו גם בגידולים בבני אדם לא מתרחשות. לכן התהליך המורכב של הפצת גרורתי לא יכול להיות מודל בנאמנות תסיסנית. אף על פי כן, גידולי EAD כגון שיבוטי V12 scrib 1 ראס לעשות להציג נכסים ממאירים כפי שהוא לשבור את קרום הבסיס סביב EAD ולפלוש המוח הסמוך 11,12,31. מידת האגרסיביות של הגידול ניתן לכמת ולעומת בין גנוטיפים שונים כמתואר במחקר זה. כמו כן, חשוב לציין כי הנוכחות של נגעים גנטיים ספציפיים EAD פסיפס עשויה להשפיע עיתוי התפתחותי ומשך צמיחת זחל. Staging של זחלים יקבע אם אנליזה של רקמת פסיפס תיעשה באמצעות חיות מאותו השלב הכרונולוגי או התפתחותית. ביצוע ניסוי פיילוט על מנת להעריך את ההשפעה שלגנוטיפ EAD המשובט החדש על עיתוי התפתחות רצוי.
ישנן מגבלות טכניות גם כן. ראשית, מספר גנוטיפים משובטים שונים שיכול להיבנות עם כלי eyFLP-MARCM הוא נהדר, אבל לא אינסופי. לדוגמא, שילוב של שני אללים מוטנטים הנמצאים על כרומוזומים שונים מתעכבים עקב יעילות נמוכה של רקומבינציה בשני כרומוזומים בעת ובעונה אחת, גנים בכרומוזום הרביעי הקטן אינם נגישים בדרך כלל. ג'ין מציאה באמצעות RNAi המהונדס היא פתרון חלופי. עם זאת, חשוב להבין כי transgenes אינם באים לידי ביטוי מיד עם רקומבינציה mitotic - לא עד מדכא Gal80 נפגעת. הפעילות של מערכת ביטוי Gal4 / כטב"מ ניתן לשפר על ידי זחלים גדלו ב 29 מעלות צלזיוס. היא, לעומת זאת, חשובה לזכור כי טמפרטורה גבוהה משפיעה שונים פרמטרים התפתחותיים, פיסיולוגיים מולקולריים כולל קצב צמיחה, עיתוי התפתחותי, metaboliSM ו ביטוי גנים 34-37. לפיכך, עיבודים לפרוטוקולים סיפק כגון הבימוי של הזחלים או מספר EAD גזור עבור פרופיל transcriptome יהיה צורך.
בודקי eyFLP-MARCM אינם מאותם הזנים הבריאים. Transgenes המרובה פשרת הגנום אחד לטוס כושר פוריות. מניות אלו דורשות תשומת לב מיוחדת להישמר והרחיבו עבור אוספים גדולים של נקבות בתולה. כפי שתועד במחקר זה, הקו הבוחן MARCM 82B גרין 11, למרות קיימא כאשר הומוזיגוטים, הוא גנטי יציב. זה ברור מן המראה ספונטנית של "נמר הזחלים" המציגים חוץ רחמי, שיבוטים GFP שכותרתו בתוך רקמות polyploid שונים, כולל המעי, tracheae, שומן הגוף, ואת האפידרמיס הזחל. תופעה זו מתרחשת בכל החוצה עצמאית של גנוטיפ האבהי. אנו מניחים כי התיקונים GFP חוץ רחמי לנבוע רקומבינציה לא מבוקרת, סטוכסטיים בין השניים FRאתרי T ב קלטת FLP-אאוט, גרימת הסרת הסמן + הצהוב בתוך "קסטת STOP". ברקמות polyploid, את מדכא Gal80 טובולין מונחה האמרגן עשוי להיות מספיק כדי לחסום את הפעילות Gal4. הנוכחות של תאים מהונדסים גנטי ברקמות אחרות מאשר EAD והמוח יכולה לעורר אותות מערכתיים שעשויות להשפיע על התנהגות של השיבוטים הניסיוניים. אלה "זחלים נמר" ולכן צריכים להיות מחוץ ניתוחים. יתר על כן, אנו שגרתי להקים מחדש את הבוחן MARCM 82B הירוק מן צלבים זכר-נקבה אחת.
למרות החסרונות שהוזכרו לעיל, היישומים של מערכת eyFLP-MARCM ללמוד פונקציות גן ואת יחסי הגומלין בין גידולים המשובטים לבין סביבתם הם מגוונים. מבוא של מערכות ביטוי בינארי Gal4 / כטב"מ-עצמאיים כגון LexA / LexOp 38 או QF לשליטה סמים / QUAS / QS 39,40 יספק בקרה טובה על transgene expression ו / או תיוג סימולטני מניפולציה של אוכלוסיות תאים שונות כולל תאי אפיתל משובטים, הלא משובטים ו hemocytes. רקמות פסיפס כזה יכול להיות מעובד שוב על פי פרוטוקולים המתואר כאן.
השיטה לנתיחה של מתחמי פסיפס EAD ו- EAD / המוח מן הזחלים instar השלישי (באזור פרוטוקול 3) יכול להיות מיושם על שלבי התפתחות מוקדם גם כן. חשוב לציין, פרוטוקול עבור מתחמי EAD / המוח מאפשר התאוששות של הכנף, הבוכניות ורגל דיסקים דמותי. האם אלה לשמש בידוד RNA (סעיפי פרוטוקול 3.3.2 ו -7), הדיסק של עניין יש לנקות מרקמות זרות ומעובד בדומה EAD. בהתחשב בגודל הקטן שלהם, מספר דיסקים הבוכניות ורגל שנאספו צריך להיות מוגבר לרכוש כמות מספקת של RNA.
הפרוטוקול להפקת RNA הכולל EAD (סעיף 7 לפרוטוקול) מבוסס על מגיב תמוגה RNA זמינה נ מסחרי שונהendors (ראה רשימה של חומרים / ציוד). ההצלחה הכוללת של ההליך תלוי בעיקר: (i) שיש מספר מספיק של הזחלים, (ii) להיות מהיר ומדויק תוך ביתור, וכן (iii) שמירה על דוגמיות חינם מ RNases. שמירה על שטח ומכשירי עבודה נקייה, לובש כפפות, באמצעות כלי פלסטיק RNase ללא ופתרונות, ושמירה על דגימות קרח בכל להפחית השפלה RNA. כדי למנוע זיהום של RNA עם כל הדנ"א הגנומי שעשויים לא יוסר לחלוטין על ידי טיפול DNase (באזור הפרוטוקול 7.11), הוא קריטי כדי למנוע שלבים בעת לקיחת השלב מהימי בפעם הראשונה (סעיף פרוטוקול 7.6). שניהם זיהום הדנ"א ושפלת RNA יכולים להתגלות על ידי הפעלת דגימות על מערכת אלקטרופורזה אוטומטית (איור 6, 6 ג '). פרוטוקול בידוד RNA יש יישום רחב יותר. זה כבר נעשה שימוש בהצלחה להפקת RNA זחלים כולו בשלבי התפתחותיים שונים, ממבוגרים, שונהאברי זחל. רנ"א המתקבל היה מתאים הן qRT-PCR וניתוח transcriptome הגנום כולו על ידי 20,24,41,42 mRNA-seq. לעומת qRT-PCR כי מכמת עשרות mRNAs שנבחרה לכל היותר, רצף ה- mRNA משוחד מתיר הבעה פעורת הגנום מנתחת. לפיכך, אפשר להשוות חתימות transcriptome שלמות של גידולים המושרה על ידי נגעים גנטיים ספציפיים על שלבים שונים של tumorigenesis 24. חשוב לזכור כי RNA מגיע מהתקליטורים כולו, כך תוצאות לא משקפות רק שינויי השיבוטים אלא גם ברקמות שמסביב, הלא המשובטות. ביצוע תא להפעיל פלורסנט מיון (FACS) על EAD פסיפס ניתק ידי התאמת פרוטוקולים זמינים 43,44 יכול להיות מיושם כדי לקבוע חתימת תעתיק של אוכלוסיות הסלולר ספציפיות, למשל, משובטים (GFP +) ולא משובט (GFP -) תאים.
פרוטוקול קיבעון immunostaining המתואר כאן הוא מתאים מכשירי כושרלהדמית taneous של חלבונים בעלי עניין עם נוגדנים פעילות ספציפיים של כתבים מהונדסים. הן אות ה- GFP סימון תאים משובטים קרינת DsRed המיוצרים על ידי אחד משני הכתבים המהונדסים נעשו שימוש במחקר זה נשמרת לאורך קיבעון immunostaining וניתן מדמיינת ישירות על ידי מיקרוסקופ confocal. עם זאת, נוגדנים כנגד חלבוני ניאון יכול להגביר את עוצמת האות. באופן דומה, שימוש נוגדן אנטי β-galactosidase יקל זיהוי של כתבים מהונדסים המבוססים על גן lacZ חיידקים. פעילויות כתב יחסית ניתן להעריך על ידי מדידת עוצמות פיקסל היחסית של שיבוטים מול תוכנת ניתוח תמונה באמצעות רקמות שאינן משובטת (למשל, פיג'י, ImageJ). בהשוואת פעילות כתב בין גנוטיפים משובטים שונים, הגדרות רכישת תמונה חייבות להישמר קבוע (באזור הפרוטוקול 5 והפניות 21,22). אף על פי הפרוטוקול עובד היטב עם רב ושוניםntibodies, זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל ריכוזי נוגדנים מומלצים. שינויים ייתכן כי יידרשו גם ב קיבעון זמן, סוג וריכוז חומר ניקוי (Triton X-100, Tween-20, סאפונין) ו מקבע (8% PFA, 4% פורמלדהיד, EtOH).
בניגוד הפרוטוקולים שנדונו לעיל, כימות הפולשנות גידול מוגבלות בשלב זחל instar השלישי במתחם EAD / המוח. אף על פי כן, הרציונל הכולל שלה ניתן להחיל על כל מחקרים כמותיים שבהם הטיה קוגניטיבית צריך להימנע. השיטה מחייבת יסודיות. כתוצאה מגדילה ממאירות הגידול בזמן, זה הכרחי כדי להשוות הזחלים של בני אותו גיל (למשל, 7 או 8 ימים לאחר ההטלה). עם זמן גידול משובט יכול לגדול יותר בצורה מסיבית, אך התאים הסרטניים יכולים להישאר בתוך EAD. השלב שבו המוח מופרד (באזור פרוטוקול 4.4.1) EAD לכן קריטי כדי למנוע ספירת הפולשנות חיובית שגויה. התקנת המוח עם EAD המצורפת, פלאטen הרקמות, בגרימת EAD מגודל לכיסוי מבנים המוח ובכך למנוע כל כימות. באופן אידיאלי, אחד היה רוצה לצייר את התהליך פולשנית ישירות זחל החיים. כתבים מהונדסים כדי להמחיש את אוכלוסיות תאים המעורבות ורקמות זמינות וניתן לשלבו עם מערכת eyFLP-MARCM. למרבה הצער, תהליך פולשני לוקח כמה שעות עד ימים, מסגרת זמן שאינו עולה בקנה אחד עם שמירה על הזחלים בחיים ועדיין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
