Summary
이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
암 발생률과 사망률을 극적으로 전 세계적으로, 특히 노인들 사이에서 증가하고 질병의 가장 유 전적으로 이질적인 그룹 중 하나를 나타냅니다. 암은 고유의 종양 억제 메커니즘을 탈출하고 통제 분할하는 종양 시작 세포에서 클론 적 기인한다. 죽음과 분화를 억제하면서 협력 적 성장, 증식과 운동성을 촉진 유전자 병변의 점진적 축적은 매우 악성 전이성 치명적인 종양으로 초기 양성과 성장을 변환합니다. 이것은 유전 적 변형에 더하여, 종양 진행이 미세 환경에서 복수 종양 세포 유형 (예를 들어, 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 사이의 주변의 스트로마 및 크로스 토크의 변화를 필요로한다는 증거가되고있다. 종양 기질 상호 작용을 포함하여 악성 변환을 기본 분자 원리를 이해하는 것은 예방하기 개발에 매우 중요하다기 및 조기 검진 전략뿐만 아니라 새롭고 효과적인 치료법은 암 전이 및 약물 내성을 방지한다.
과일 초파리 비행은 빠른 생성 시간 때문에 암 연구 1-4위한 매력적인 시스템이되었다, 파리와 인간의 거의 모든 유전자의 조작을 용이하게 고급 유전자 도구의 제한으로 유전자 중복과 부 사이의 노드 신호의 놀라운 보존 일시적으로 공간적으로 제한 방법. 다양한 악성 종양 유전자 정의 재현성 MARCM 기술 5를 사용 달리 야생형 조직에서 전구 세포의 서브 세트에 이득 - 및 기능 상실 돌연변이를 도입함으로써 초파리 설계 될 수있다. MARCM 도구는 FLP / FRT는 (FLP 재조합 효소 / FLP 인식 대상이) FLP 아웃 7 GAL4 / UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 8 표적 유전자와 유사 분열 재조합 (6) - 중재 결합발현 시스템 구. dsRNA를 유도 유전자 침묵에 대한 종양 유전자 또는 형광 단백질 cDNA를 또는 반전 DNA의 반복을 포함한 모든 UAS 기반 유전자의이 방법의 표현으로, 특정 유전자 궤적과 재결합으로 인해 GAL4 리프레을 잃은 세포의 복제에 제한됩니다 (도 1A). 클론 패치가 녹색 형광 (GFP) 또는 적색 형광 단백질로 표시 (예를 들어, RFP,을 DsRed, mCherry)는 쉽게 개발, 격리 및 분석을 통해 추적 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이들 동작은 직접 인접하는 야생형 조직과 비교 될 수있다. 따라서, 질문은 유전 적 병변의 자율이 아닌 자율적 인 효과를 편리하게 공부하실 수 있습니다 세포 관련의. 포유 동물과 마찬가지로, 만 클론은 여러 종양 병변은 초파리에서 악성되고 포유 동물의 암의 주요 특징을 요점을 되풀이 결합된다. 그들은 세포 사멸을 회피 염증을 유발, 불멸과 INVA되고, overproliferate시브는 궁극적으로 호스트 10-17를 죽이는.
여기, 우리는 프로토콜이 MARCM 기술을 사용하여 초파리 유충의 눈 / 더듬이와 뇌 조직에서 유전자 정의 클론 종양을 생성하기 위해 설명합니다. 이 방법은 눈이없는 인핸서 (eyFLP) (18, 19)의 제어하에 효모 FLP 재조합 효소를 발현하는 MARCM 테스터 재고에 의존한다. 이러한 방식으로, GFP 표지 클론 peripodial 및 주상 EAD의 상피 세포 및 배아와 애벌레 단계 (그림 1A, B 및 기준 20)을 통해 뇌의 neuroepithelium 모두에서 생성됩니다. neuroepithelium는 차별화 된 광학 로브 뉴런을 생성 neuroblasts에 상승을 제공하면서 EAD가 성인 눈, 안테나와 머리 캡슐로 개발로 클론 쉽게 성인이 될 때까지 올 수 있습니다.
우리 드 모자이크 조직의 광범위한 분자 기능 및 표현형 특성을 용이하게하기 위해,서기관 세 번째 령 유충에서 EAD과 뇌의 해부에 대한 프로토콜은 세 가지 다른 응용 프로그램을 처리하는 방법을 간략하게 설명합니다 : (ⅰ) 형질 전환 형광 기자와 면역 검출, 종양 침입 및 (ⅲ) 분석 (II) 정량 유전자 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 또는 높은 처리량의 mRNA 서열 (mRNA의 서열 -) (도 1C)을 이용하여 변경한다.
면역 염색 프로토콜은 특정 항체와 관심있는 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 형질 전환 형광 전사 기자는 특정 신호 전달 경로의 활동에 편리하고 정확한 시공간 정보를 제공합니다. 세포 계보 특정 기자 한편, 모세 조직 내의 별개의 유전자형 간의 종양 세포 집단에 정량적 변화를 반영한다. 침략 행동의 정량은 유전자형 사이의 종양 악성 종양의 비교를 용이하게에스. 마지막으로, RNA 분리에 대한 모자이크 EAD의 수집 및 처리를 설명하는 프로토콜은 각각 QRT-PCR 및 게놈 전체의 mRNA-SEQ, 다음 역전사 등 모두 크고 작은 규모의 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다. 이 분석에서 얻어진 정성 및 정량 데이터는 클론 종양의 사회적 행동에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, 그들은 개인의 유전자, 유전자 네트워크와 다른 단계의 종양 미세 환경과 종양의 측면의 역할에 대한 기능 연구를위한 견고한 기초를 생산하고 있습니다.
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Protocol
참고 :이 작업은 eyFLP1을 활용; 행동> Y +> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, 욕조 - Gal80 MARCM 82B 그린 테스터 라인 (11). 같은 w 같은 계통의 남성에 MARCM 82B 그린 테스터 처녀를 넘어; UAS-A; UAS-B의 RNAi, FRT82B C의 MUT 유전자형은 유사 분열 재조합이 3 번째 상동 염색체의 오른쪽 팔 사이에 발생하는 자손을 얻을 것입니다. 이러한 방식으로, FRT82B 사이트 원위 위치 유전자 C의 클론 동형 접합 돌연변이는 EAD 뇌 neuroepithelium 내에서 발생한다. 이 클론 유전자 B (그림 1A)에 대한 GFP, 유전자 A와 dsRNA를 표현합니다. 는 X, 2L, 2R, 3L 및 3R에 재결합을위한 다양한 eyFLP-MARCM 테스터 라인을 설립하고, 비행 지역 사회 내에서 사용할 수있다.
1. 플라이 처리, 십자가, 및 준비
- 여러 보을 채워 실온에서 해당 MARCM 테스터 재고를 확장동시에 ttles. 충분한 처녀가 후속 십자가 수집 할 수 있도록 2-3 일마다 신선한 병으로 성인 플립.
참고 : 처녀를 수집 할 때,이 여성의 생식력을 타협으로 2 CO하는 장기간 노출을 피하십시오. - 실험의 규모에 따라 최소 10 MARCM 테스터 처녀와 (예를 들어, 형광 기자와 면역 염색의 영상의 경우) 또는 최소 30 처녀과 10 명의 남성 (예를 들어, 용 병 4 명의 남성을 사용하여 유리 병에 비행 십자가를 설정 RNA 분리 및 침입의 정량).
- 긴 하루를 16 시간 / 8 시간의 명암 사이클에서 25 ° C에서 자손을 올립니다. 유충의 재현 할 준비를 촉진하고 혼잡을 방지하기 위해 새로운 병 / 병에 매 24 시간을 부모 플립.
참고 : 달걀 누워 (AEL) 후 6 일에 시작, 후반 세번째 령 제어 애벌레 정지 공급은 방황 시작하고 pupariation를 입력합니다. 대조적으로, 유충 번데기 - 전이의 개시는 해제 될 수있다누워 또는 EAD가 증식 또는 악성 클론 종양 베어링과 애벌레의 존재.
2. 세 번째 탈피 애벌레를 수집
- 면역 염색의 경우, 약 20 후반 세번째 령 유충 (벽에 방황하고 음식에서 비슷한 신체 사이즈들)를 수집합니다. 부드럽게 유리 병 또는 병에서 애벌레를 선택하고 인산염 완충 식염수 (PBS) 가득 배아 유리 접시에 그들을 전송하는 집게를 사용합니다.
- RNA 분리 및 침입의 정량화를 들어, 적어도 80 후반 세번째 령 유충 (벽에 방황하고 음식에서 비슷한 신체 사이즈들)를 수집합니다. 표면이 덮여 때까지 유충을 포함하는 비행 병에 PBS를 분출하기 위해 물총 병을 사용합니다.
- 주걱 음식의 상단 층을 연화 페트리 접시에 유충을 포함하는 식품 매쉬 붓는다. 집게를 사용하여 부드럽게 애벌레를 선택하고 PBS로 가득 배아의 유리 접시로 전송합니다.
- PBS의 UNT와 유충을 씻으십시오위원장 모든 잔여 음식이 제거됩니다. 애벌레 몸 전체 랜덤 GFP 양성 반점 (그림 2A, 2B 및 참조 토론 섹션)을 수행하는 모든 "표범 애벌레를"폐기 16X 배율로 8 형광 실체 현미경 아래의 유충을 검사합니다.
참고 : RNA 분리를 들어 1 분 동안 70 %의 EtOH의 끝에서 두 번째 세척 단계를 포함한다. - 해부 때까지 얼음에 PBS에서 선택한 애벌레가 들어있는 접시를 놓습니다. 30 분 내에 처리 유충은 추위와 굶주림의 부작용을 방지 할 수 있습니다.
애벌레 3. 해부
- 실체 현미경 하에서 EAD를 해부하기 위해 부드럽게 유리 접시 바닥에 대한 유충의 중간 부분을 눌러 포셉 한 쌍을 사용합니다. 두 번째 집게로, 애벌레 입 후크를 잡아 멀리 신체 (그림 2C)에서 그들을 잡아 당깁니다.
참고 : 당기는 힘은 EAD 파이를 연결하는 광섬유 줄기를 중단하는 것이 충분하다뇌 로브에 대한 연구. 뇌 또는 부품 EAD 부착 유지하고 그들의 존재는 상기 애플리케이션에 바람직하지 않은 경우, 겸자 두 쌍의 도움으로 광섬유 줄기 잘랐다. (예를 들어, RAS의 V12의 scrib 1) EAD 뇌 로브 사이의 연결이 점점 overgrowing와 클론 세포를 마이그레이션하여 시간에 가려된다 침습적 종양하십시오.- 온전한 복부 신경 코드 (VNC) (그림 2D)과 EAD / 뇌의 복잡한을 준비하려면 몸의 중앙에 유충을 잘라 집게를 사용합니다. 후방 절반을 폐기하십시오.
- 한 집게의 끝 사이의 애벌레 몸의 앞쪽 절반을 잡고, 두 번째 집게의 끝 입 후크에 눌러 첫 번째 집게 쌍과 그 위에 표피를 압연하여 애벌레 내부 아웃 플립.
- 조심스럽게 EAD 쌍을 남기면서 모든 외부 조직 (예를 들어, 침샘, 지방 본문 및 창자)을 제거하거나 집게를 사용하여입 후크에 연결된 EAD / 뇌 복잡한. 위에있는 표피에서 입 후크를 풀다. 몸의 근육과 표피 (도 1B, 2C, 2D)에 연장 축삭 돌기를 절단하여 VNC를 무료로 제공됩니다.
참고 : 입 고리가 집게로 조직의 안전 조작이 가능하고 세척하는 동안 조직을보다 효율적으로 침몰하고 쉽게 인식을 용이하게한다. PBS에 고정되지 않은 유지하면 상대적으로 빠른 EAD 변화 형태를 해부. 20 ~ 30 분에 해부 시간을 제한합니다. - 조직을 전송하려면, 코트 나머지 몸을 피펫 팅하여 P20의 마이크로 피펫 팁은 위아래로 여러 번 전기자. 큰 EAD / 두뇌 단지를 전송하려면, 가위로 P20의 마이크로 피펫 팁을 잘라.
주 : 코팅 절차는 전송 중에 점착 및 해부 조직의 손실을 방지하기 위해 중요하다. P20 마이크로 피펫을 사용하면 원치 않는 한계 희석, 정착액 PBS 용액으로의 전달을 최소화한다.- 면역 염색의 경우, 전송400 ㎕를 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 고정액으로 가득 0.5 ML 튜브로 EAD를 해부. 큰 EAD 1 ml의 PFA 1.5 ML 튜브를 사용하여 / 뇌 단지는 침입의 득점에 대한 의미.
주의 : PFA는 매우 독성이다. 보호 장갑과 복을 착용 할 것. 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. - RNA 분리를 들어 차가운 PBS로 가득 찬 새로운 유리 접시에 해부 EAD를 전송합니다. 샘플 오염을 최소화하기 위해, 링과 림프 땀샘에서 EAD를 청소 집게를 사용합니다.
- 집게 (도 2E)을 사용하여 상기 안테나 디스크 입 후크 사이의 접속을 절단하여 후크 입에서 EAD를 분리. RNA 분해 및 유전자 발현 유물을 방지하기 위해, 30 분에 해부 시간을 제한 할 수 있습니다. 7 단계로 진행합니다.
참고 : 숙련 된 연구자가 애벌레 수집 및 세척에 필요한 30 분을 제외한 시간에 약 60 유충을 해부 할 수 있습니다. 총 RNA 수익률은 유전자형과 developmenta 사이에 다릅니다 EAD 크기에 따라 달라집니다리터 단계. 후반 세번째 령 유충 80-100 제어 EAD 쌍 해부 5-8 μg의 총 RNA를 생성한다.
- 면역 염색의 경우, 전송400 ㎕를 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 고정액으로 가득 0.5 ML 튜브로 EAD를 해부. 큰 EAD 1 ml의 PFA 1.5 ML 튜브를 사용하여 / 뇌 단지는 침입의 득점에 대한 의미.
4. 고정, 면역 염색 및 장착
- 실온에서 하향 경사하면서 25 분 동안 PFA의 정착액에 샘플을 수정합니다. 정착 시간은 조직 형태학 및 단백질의 항원 성 변화없이 60 분까지 연장 될 수있다.
- nutator를 사용하여 10 분 동안 세 번 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS) PBST로 정착 및 세척 샘플을 제거합니다. 각 세척 단계 (400 μL / 0.5 ML 튜브)에 대한 PBST의 충분한 양을 사용합니다.
참고 : 고정 EAD / 뇌 복합체는 면역 염색을 필요로하지 않는 침입의 득점에 대한 의미. GFP 신호가 고정 된 후에도 계속 표시됩니다. 최종 해부를 위해 4.4 단계로 진행합니다.- 면역 염색을 위해, 실온에서 교반과 함께 20 분 동안 (0.3 % BSA와 PBST) 블로킹 용액 200 μL의 블록 조직.
- 꼼꼼한으로 품어가볍게 흔들어 섞으면 진 항체를 4 ℃에서 밤새 블로킹 용액 100 ㎕로 희석 하였다. 권장 항체 희석 차 항체 데이터 시트 또는 게시 된 문헌을 참조하십시오.
참고 : 차 항체 희석 최적화해야 할 수 있습니다. - 부드럽게 어두운 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 2 시간 동안 진탕하면서 또는 PBST에서 5 ~ 10 분간 세척 이후, 형광 이차 항체로 염색 된 조직을 차단 용액으로 희석 하였다.
- 워시 샘플을 세 번 PBST에서 10 분.
- 꼼꼼한으로 품어가볍게 흔들어 섞으면 진 항체를 4 ℃에서 밤새 블로킹 용액 100 ㎕로 희석 하였다. 권장 항체 희석 차 항체 데이터 시트 또는 게시 된 문헌을 참조하십시오.
- 면역 염색을 위해, 실온에서 교반과 함께 20 분 동안 (0.3 % BSA와 PBST) 블로킹 용액 200 μL의 블록 조직.
- DAPI 염색 용액 500 μL와 PBST를 교체합니다. F - 굴지 레이블을 지정하려면, DAPI 염색 용액에 형광 염료를 결합 팔로이 딘을 추가합니다. 어둠 속에서 15 분 장동 후, PBST 10 분 동안 한 번 조직을 씻으십시오.
주 : F 액틴 라벨링 DAPI 염색과 독립적으로 수행 될 수있다. - 최종 해부 단계를 들면, 1 ml의 파이를 사용하여 PBS 채워진 유리 접시에 다시 조직을 전송pette. 입 후크를 클립 집게의 두 쌍을 사용.
- 분석을 방해 할 수 있습니다 자란 EAD로 광학 줄기를 절단하여 EAD에서 침입의 정량에 사용되는 뇌를 분리합니다.
- 객관적인 슬라이드에 장착 매체의 드롭 (A 22mm X 22mm의 coverslip에 15 μl를) 놓습니다. 집게 팁의 도움으로, 얇은 층으로 매체를 배포 할 수 있습니다. P20의 마이크로 피펫으로 장착 매체에 EAD, 뇌 또는 EAD / 두뇌 단지를 전송합니다.
- 조직을 배포하고 슬라이드에 VNC를 곧게 포셉의 조언, 텅스텐 막대를 사용합니다.
- 설치하는 동안 거품, 첫 번째 터치 한 설치 매체에 커버 슬립의 가장자리와 집게의 도움으로 장착 매체에 천천히 이하의 형성을 방지 할 수 있습니다. 커버 슬립의 가장자리 주위 초과 장착 매체를 흡수 닦아 필터 종이 또는 조직의 작은 조각을 사용합니다.
참고 : DABCO / 폴리 (비닐 알코올) 4-88 설치 매체 굳어시간 내에서 4 ° C에서. 슬라이드는 4 ℃에서 달 동안 저장 될 수있다.
5. 공 촛점 이미징
- 20X, 40X 및 60X 오일 목표에 장착 된 공 초점 현미경을 사용하여 단일 공 촛점 섹션과 스택을 획득.
- 픽셀 포화를 방지합니다. 오프셋 화상 해상도, 레이저 입력 전력, 이득 프레임 평균화하는 Z 시리즈의 스텝 크기를 포함하여 동일한 이미지 포착 파라미터를 사용하여 상이한 유전자형 (21, 22) 사이의 픽셀 세기들의 비교를 허용하는 모든 유전자형에 대한 위치 설정을 유지한다.
참고 : EAD / 두뇌 단지의 시각화를 들어, 최대 돌기를 생성하고 각각의 이웃 이미지 만들기. 최종 이미지 준비, 패널 조립 후 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 밝기와 대비를 조정합니다.
종양 침윤 6. 정량
- 종양 invasivenes의 다른 수준을 특성화하는 채점 시스템을 정의침윤의 공간적 패턴과 뇌 VNC에 확산 GFP 양성 세포의 양을 고려이야. 문서 (그림 3A)에 대한 평가 시트를 준비합니다.
- 마운트는 적어도 80 24mm X 50mm의 coverslip에 따라 장착 매체의 40 μl를 사용하여 하나의 슬라이드에 각각의 유전자형에 대한 손상 머리를 고정.
- 편견 득점을 허용하려면, 채점 절차는 편견되도록, 슬라이드를 익명화하는 중립적 인 파티를 부탁드립니다. 독립적으로 두 실험실 구성원 익명 처리 슬라이드를 평가합니다. 계산이 완료된 후에 만 유전자형이 개시되어있다.
- GFP 필터 세트가 장착 된 형광 실체 현미경 아래에 장착 뇌의 블라인드 점수에 의해 악성 종양의 정도를 평가합니다. 이미 이중 계산 (그림 3B)를 방지하기 위해 본 한 두뇌에 라벨 마커를 사용합니다.
- 유전자형에 따라 정의 된 침습성 각 범주에 떨어지는 두뇌의 비율을 계산합니다. 통계들 결정ignificance 카이 제곱 테스트 (그림 3C)를 사용하여.
7. RNA 분리, DNase의 치료 및 품질 검사
참고 : 다음 단계에 사용 된 모든 시약 (솔루션, plasticware은)의 RNase 활동이 없어야합니다. 항상 장갑을 착용 및 유기 용제 작업 화학 후드를 사용합니다.
- 1.5 ml의 튜브에 코팅 된 P20의 마이크로 피펫 팁과 깨끗한 EAD를 전송합니다.
- 튜브의 바닥 조직 싱크하자, 조심스럽게 PBS를 제거하고 100 μl의 RNA 용해 시약 (최대 140 EAD에 대한 충분한)로 교체합니다.
- 텍싱에 의해를 Lyse 조직. 이 시점에서, 샘플을 액체 질소에 냉동 깊은 -80 ℃에서 보관하거나 직접 표준 RNA 분리 프로토콜을 사용하여 처리 될 수있다.
참고 : 여러 해부 라운드에서 유사한 유전자형의 샘플 RNA 용해 시약에 한 번 풀 수 있습니다. - RNA 용해 시약 0.9 ml의에 샘플 볼륨을 입력합니다. 클로로포름의 0.2 ML을 추가하고 vigoro 샘플을 혼합15 ~ 20 초 동안 usly.
- 실온에서 2 내지 3 분 인큐베이션 후, 4 ℃에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리.
- 상간을 방해하지 않고 새로운 튜브로 무색 위 수성 상을 포함하는 RNA를 전송합니다. 이 단백질과 게놈 DNA가 들어 있으므로 멀리 계면에서 그대로.
주 : 회수 볼륨 균질화 사용 RNA 용해 시약의 부피의 약 60 %이어야한다. - 이소 프로필 알코올 0.5ml를 첨가하여 RNA를 침전. 볼텍스하고 실온에서 10 분 동안 샘플을 배양한다.
- 4 ℃에서 15 분 동안 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 75 % 에탄올 600 μL로 한 번 RNA 펠렛을 씻는다. 짧은 소용돌이와 원심 분리 (4 ℃에서 7 분간 10,000 XG) 후 모두 에탄올을 취소하고 5 ~ 10 분 깨끗한 조직 닦아에게에 오픈 튜브를 배치하기위한 RNA 펠릿 공기가 건조 할 수 있습니다.
참고 : RNA 펠렛은 작은 불투명 / 화이트 성으로 볼 수 있습니다튜브 또는 눈에 보이지 않는 하단의 잘 익은. 나머지 에탄올 방울 신중 P10의 마이크로 피펫 팁으로 제거 할 수 있습니다. - 피펫 팁을 몇 번 텍싱 또는 솔루션을 전달하여 DEPC 처리 된 물 50 μL의 RNA를 녹여.
- 게놈 DNA의 오염을 최소화하기 위해, DNase의 1 μL (2 U / μL) 및 DEPC 처리 된 물에 10 배의 DNase 완충액 10 μl를 함유하는 혼합물 50 μl를 첨가하여 전체 RNA의 DNase로 치료. 소용돌이와 스핀 다운.
- 수조 또는 30 내지 40 분 동안 가열 블럭에서 37 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 배양 후, 각 샘플에 DEPC 처리 된 물 100 μl를 추가합니다.
- , DNase의에서 효소 활동하고 깨끗한 RNA를 비활성화 페놀의 200 μl를 추가하려면 : 4 ° C에서 7 분 동안 10,000 XG에서 1 분 원심 분리기에 대한 샘플 솔루션, 소용돌이 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (1 ~ 25 : 24).
- 조심스럽게 새로운 튜브에 RNA를 함유하는 상부 수 성상을 전송. 동일한 볼륨을 추가 (200 μL)클로로포름, 혼합 위에서 원심 분리 단계를 반복합니다.
- 신중 상부 상 모아서 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피를 첨가하여 RNA를 침전, pH가 5.2 100 % 에탄올 DEPC H 2 O 2.5 권으로 제조. 텍싱에 의해 철저하게 섞는다.
참고 : 침전 믹스 0.5 μL 글리코겐 (20 μg의 / μl를) 추가는 RNA 펠렛을 시각화하는 데 도움이됩니다. 실리콘이 낮은 바인딩 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 사용하여, RNA의 손실을 최소화한다. - 적어도 1 시간 동안 -20 ℃에서 RNA를 침전.
참고 : 배양 밤새 수행 할 수 있습니다. 샘플뿐만 아니라 -80 ° C에 배치 될 수있다. - 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 RNA. 세척하고 7.9의 기술에 다음과 같은 건조 펠렛.
- DEPC 처리 된 물 10 ~ 15 μL에서 RNA를 녹인다. -80 ° C에서 보관 RNA.
- 230 nm의, 260 nm의 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서 OD를 측정하여 RNA의 양과 순도를 결정합니다. RNA 공동 계산협약을 적용하여 ncentration 40 μg의 / ㎖ RNA와 동일한 nm의 260에서 1 OD 그.
참고 :하는 A 230분의 260 비율은 2.0-2.2의 범위에 있어야하는 동안 "순수한"RNA의 280 분의 260 비율은 2.0 같습니다. 1.7와 2.0 사이는 A 260/280 비율 RNA 샘플은 cDNA 합성 등의 하류 어플리케이션에 적합하다. mRNA의 서열 - 라이브러리의 제조를위한 RNA의 질과 양을 자동 전기 시스템을 이용하여 확인한다. 28S / 18S 비율은 1.8 이상이어야합니다.
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Representative Results
초파리 EAD에 정의 된 유전자형 GFP 마크 패치를 생성하는 eyFLP-MARCM 기술의 가능성을 증명하기 위해, 클론의 세 가지 유형이 유도되었다 : 경우 1 제어 발현 GFP (2) 악성 종양이 작고의 종양 형태를 나타내는 종양 억제 유전자 낙서의 동형 접합 손실 (scrib 1)의 배경에서 G 단백질 라스 (라스 V12), (3) overgrowing하지만 비 침습적 라스 V12 scrib 1 JNK DN 클론의 6월-N 말단 키나제 (JNK)이 지배적 음성 형태 (그림 4, 유전자형 표 1)의 발현에 의해 불 활성화되었다. 라스 V12의 scrib 1 클론 종양의 침입이 JNK 신호 전달의 비정상적인 활성화가 필요하며 하류 전사가 10,12,23,24 요인 것으로 나타났다. 또한, 라스 V12의 scrib 1 14,25에 면역 세포 (라고 혈구 세포)의 침투의 결과로, 초파리 유충에서 강력한 염증 반응을 촉진한다.
수준과 모자이크 조직 내 JNK 활동의 공간적 분포와 별개의 유전자형의 종양 사이를 모니터링하려면, 기존의 형질 전환은, JNK 응답 TRE-을 DsRed 기자 (26)를 사용 하였다. 해부, 고정 EAD와 EAD의 공 초점 현미경 / 뇌 단지 악성 라스 V12의 scrib 1 종양 (그림 4B)를 베어링 조직의 TRE-을 DsRed 기자 활동의 현저한 상향 조절 한 것으로 밝혀졌습니다. 을 DsRed 신호 라벨 라스 V12의 scrib 뇌 로브를 통해 확산 및 VNC (그림 4E, 4F)를 침입 EAD (그림 4B)뿐만 아니라 종양 세포에 1 클론. 대조적으로, TRE-을 DsRed 기자 activiTY은 제어 디스크 (도 4a ')의 안구 부분에 공중선으로부터 연장 셀 스트링에 한정 남았다. JNK 신호를 차단하면 클론 라스의 V12의 scrib 1 JNK DN 종양 (그림 4C, 4D)에서 TRE-을 DsRed 신호의 극적인 감소 귀착되었다. 이러한 데이터는 따라서 악성 라스 V12의 scrib 한 종양의 TRE에 의존하는 전사 반응을 활성화하기 위해 신호 JNK의 요구 사항에 대한 기능 증거를 제공합니다. 초파리를 추적 고안 혈통 특정 hmlΔ-을 DsRed 기자, 27, 28 악성 라스 V12의 scrib 1 종양 (그림 5B)를 베어링 조직에서 면역 세포의 축적을 보여 주었다 혈구. 반면, 개별 혈구 세포 또는 몇 지역화 된 혈구 패치는 제어 및 RAS의 V12 scrib 1 JNK DN 모자이크 EAD 뇌 조직에서 검출되었다(그림 5A, 5C). 범 혈구 항 Hemese 항체로 면역 염색 (H2)는 29 hmlΔ-을 DsRed 양성 세포 (그림 5D, 5E)의 면역 세포의 신원을 확인했다. 게시 된 보고서 12,23,24과 일치, 종양 침입의 편견 정량은 인접한 뇌 로브와 VNC (그림 3C)에 종양의 침윤을 촉진 신호 JNK의 중심 역할을 뒷받침. 마지막으로, 총 RNA는 모자이크 EAD에서 분리 하였다. 샘플은 질과 양에 대한 자동화 된 전기 시스템에 QRT-PCR에 하나를 사용하거나 분석 하였다. 그림 6a는 기질 금속의 중요한 JNK 종속 상향 조절을 보여줍니다 1 (MMP1) EAD 이전에 확인, 악성 라스의 V12의 scrib 1 클론 종양 베어링의 성적 증명서 발표 결과 12,24,30,31. 자동화 된 전기 영동 시스템을 사용하여 총 RNA의 평가 t 나타났다모자 3 개의 독립적 인 EAD 샘플은 1.8 (그림 6B) 위의 28S / 18S 비율을했다. 그러나, EAD 2 RNA는 겔 (그림 6C)에 도말하여 반영, 부분적으로 저하했다. 반대로, EAD 3 샘플은 낮은 농도를 가지고 있었다. electropherogram (그림 6C)에 젤 이미지 (그림 6B)와 작은 봉우리에 고 분자량의 여러 밴드, 또한 DNA 오염을 제안했다. 따라서, 만 EAD 한 샘플의 mRNA-서열 라이브러리의 제조에 적합한 것이다.
도 1 : 초파리 EAD 하류 어플리케이션에서 유전 모자이크 생성 용 MARCM 시스템의 회로도 (A)를 MARCM 시스템 달리 야생형 정의 유전자 병변 클론 패치를 생성 할 수있다 (이형).문맥. 조직 특이 적 프로모터 (예를 들면 눈이없는)의 제어하에 FLP의 발현은 STOP 카세트의 측면에 두 개의 FRT 요소 사이의 재조합은 옐로우 (Y) 유전자 (법> Y +> GAL4)로 표시된 촉매. 정지 카세트를 제거하면,이 도처 UAS-GFP (또한 UAS 라스 V12)와 같은 UAS 기반 유전자의 발현을 구동 할 수 GAL4의 전사 활성화 (ACT-GAL4)를 표명했다. 부모의 셀에서, 그러나, GAL4 활성은 그 표현식 튜 불린 프로모터 (정조 Gal80)에 의해 제어되는 Gal80 리프레에 의해 차단된다. 세포주기의 G2 단계에서 FLP는 FRT 부위에 선단 상동 염색체 사이의 비 자매 염색 분체 교환을 중재한다. 유사 분열시 염색체 재조합의 분리가 두 개의 딸 세포 특정 유전자 유전자좌 하나 인 동형 접합성 돌연변이를 야기 할 것이다 (예 scrib
그림 2 : 세 번째 령 유충 및 EAD와 EAD의 대표적인 예의 정렬은 / 두뇌 단지 다른 다운 스트림 응용 프로그램에 사용되는 eyFLP-MARCM 82B 그린 테스터로 유도 세 번째 령 유충 베어링 제어 GFP 표지 클론 (AB) 형광 현미경 사진.. EAD 뇌 로브 제한 클론 (A) 대표 제어 유충. (B) 몸 전체에 다양한 조직에서 GFP 양성 클론을 들고 "표범 애벌레"의 예. 입 후크를 포함한 모든 외부 조직에서 청소 해부 EAD 입 후크에 부착 (D) EAD / 뇌 단지 및 (E) EAD의 (C) 브라이트 이미지. 스케일 바 = 2mm (AB) 500 μm의 (CE).fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 종양 침입의 정량 (A) 두뇌의 형광 공 초점 이미지 (7 일 AEL)는 (0 점수) 비 침습적에 이르기까지 종양 침입의 네 가지 등급의 실제 예를 나타내는 라스 V12 scrib 1 애벌레에서 해부, 침입 한 뇌 로브 (1 점수), 클론 조직이 모두 뇌 로브을 포함하고 VNC를 입력과 강한 종양 침공 침공 모두 뇌 로브 (2 점수) (3 점수). 이미지는 점수 2 다중 공 초점 섹션과 예제 전망이며, 3은 2 × 2 공 초점 이미지에서 스티치있다. 스케일 바 = 100 μm의. (B) 편견에 사용되는 고정 두뇌와 익명 현미경 슬라이드의 예형광 실체 현미경 득점. 득점 뇌는 중복 등록을 방지하기 위해 펜으로 표시됩니다. 매우 침습적 라스 V12의 scrib 1 종양, JNK가 신호 전달의 억제 (RAS의 V12의 scrib 1 JNK DN) 클론 세포의 제거 침공에 비해 스케일 바 = 500 μm의 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : scrib '1 클론 종양 악성 라스'V12 '의 전사 TRE-을 DsRed 기자의 활성화는 JNK에 의존 (A. TRE-을 DsRed 기자의 눈 부분 (화살촉)에 더듬이에서 실행중인 세포의 좁은 스트라이프로 표시. (B)를 TRE-을 DsRed 기자의 활동이 현저하게 1 GFP 양성 클론 주변의 비 클론 EAD 상피 세포에 비해 라스 V12의 scrib에서 향상되었습니다. JNK 활동의 (C) 억제는 RAS의 V12 scrib 1 JNK DN 클론에서을 DsRed 신호 강도의 명확한 감소 결과. (라)을 DsRed 신호의 추가 향상은 라스 V12 scrib 1 JNK DN 클론을 둘러싼 세포에서 신호 JNK의 비 자치 활성화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 하루 8 AEL, 라스의 V12의 scrib에서 (E)는 1 세포는 전체 EAD와 VNC (화살표)에 뇌 로브에 걸쳐 overgrew. (F) 영역 m의 VNC (근접 침입 클론 세포E의 화살표 arked)은을 DsRed 신호를 농축 하였다. 여러 공 촛점 섹션 (AC) 표시 예측, (E)는 3 × 3 공 초점 이미지에서 꿰매 및 (D, F)는 하나의 섹션을 나타냅니다. 스케일 바는 50 μm의 =. EAD, 눈 / 더듬이 디스크; BL, 뇌 로브; VNC는 복부 신경 코드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 리니지 특정 HML의 Δ -DsRed 유전자 변형 기자가 라스의 V12의 scrib의 농축 한 종양 관련 혈구 세포를 보여준다 (A) 제어 EAD에서 hmlΔ-을 DsRed 기자 표지 혈구의 CLU sters는 눈과 더듬이 상피의 들여 쓰기에 갇혀있다. (B)의 RAS V12의 scrib 이루어지는 EAD 뇌 조직을 한 GFP 마크 종양 모든 클론 조직 흩어져 혈구 세포 수의 증가를 보였다. (C)는 연관된 혈구 세포의 수는 급격히 라스 V12의 scrib 1 JNK DN 모자이크 조직에서 JNK 신호의 억제에 따라 감소 하였다. (DE) HmlΔ-을 DsRed 양의 혈구 세포는 범 혈구 마커 Hemese를 검출하는 H2 항체로 표지 하였다. (AC) 2 × 2 (BC)에서 꿰매 여러 공 촛점 섹션 (A)의 표시 예측은 3 × 3 공 초점 이미지에서 스티치있다. (DE)는 하나의 섹션을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm의 (AC)와 10 μm의 (DE). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :.. 수량 및 해부 EAD에서 분리 된 총 RNA의 품질 평가 (A) 각 유전자형 MMP1의 성적 수준에 대한 네 생물 복제를 사용하여 QRT-PCR 결과의 대표적인 예는 rp49로 표준화했다. 유전자 발현의 변화 접어서 상대 표준 곡선 법 (32)을 사용하여 계산 하였다. 데이터는 SEM ± 평균 값이다; *** 불평등 변화와 학생의 짝이 꼬리 t-test를 이용하여 P <0.001. 자동화 된 전기 영동 시스템을 사용하여 총 RNA의 질과 양의 (B, C) 평가. 가상 겔 화상 (B)은 electropherograms에 잘 정의 된 피크 (C)에 대응 18S 및 28S rRNAs의 두 개의 눈에 띄는 대역을 나타낸다. DNA의 오염 및 RNA 분해는 다음과 같이하여 반영mear (화살촉) 및 extranumerary 밴드와 피크 (화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라이 균주 | 소스 / 댓글 |
| eyFLP1; 행동> Y +> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, 욕조 - Gal80 | eyFLP-MARCM 82B 그린 테스터 (11) |
| w; UAS-RAS의 V12; FRT82B의 scrib 1 / TM6B | (12) |
| w; UAS-RAS의 V12; UAS-JNK DN FRT82B의 scrib 1 / TM6B | (12) |
| w; hmlΔ-을 DsRed; FRT82B | 이 연구, w; 카차 브루크너 28 hmlΔ-을 DsRed |
| w; UAS 라스 V12의 hmlΔ-을 DsRed; FRT82B의 scrib 1 / TM6B | 이 연구 |
| w; UAS 라스 V12의 hmlΔ-을 DsRed; UAS-JNK DN FRT82B의 scrib 1 / TM6B | 이 연구 |
| w; TRE-을 DsRed; FRT82B | 이 연구, w; 더크 Bohmann 26 TRE-을 DsRed |
| w; UAS-RAS V12 TRE-을 DsRed; FRT82B의 scrib 1 / TM6B | 이 연구 |
| w; UAS-RAS V12 TRE-을 DsRed; UAS-JNK DN FRT82B의 scrib 1 / TM6B | 이 연구 |
표 1 : 본 연구에 사용 된 초파리 라인들의 요약.
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Discussion
기술은 초파리의 유전 모자이크 분석 및 유전자 기능 (33)를 조작하기위한 가장 정교한 도구들이다 생성합니다. 그것은 눈이없는 증강 활성 9,18 인 조직에서, 즉, 공간적으로 제한된 방식으로 시각적으로 표시, 유 전적으로 정의 된 클론의 유도를 할 수 있습니다대로 eyFLP - MARCM 시스템은 강력하고 강력한 입증되었습니다. 여러 유전 적 병변이 동일한 셀에 결합 될 때 특히 중요하다. EAD 뇌 neuroepithelia로 제한 할 때이 매우 비정상적인 패치가 애벌레 개발을 허용하는 동안 열 충격 제어 FLP (hsFLP) 클론의 경우에서와 같이 애벌레 몸 전체에 흩어져 때, 그들은 치사의 원인이 될 수 있습니다. 중요한 것은, 플라이 EAD 상피 세포에서 클론의 유도 된 종양 유전자는 종양 억제의 손실과 결합 일부 인간 암의 출현과 고체 상피 종양의 진행을 되풀이되었습니다 활성화. 호Wever에게, 시스템은 간단하게 설명한다 한계를 갖는다. 곤충 개방 순환 시스템을 감안할 때, 같은 인간 암에서 관찰 된 사실 전이가 발생하지 않습니다. 따라서 전이성 보급의 복잡한 과정을 충실히 초파리에서 모델링 할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 같은 RAS의 V12의 scrib 1 클론으로 EAD 종양들은 EAD를 둘러싼 기저막을 분해 및 인접 두뇌 11,12,31를 침공으로 악성 속성을 표시 할. 종양 적극성의 정도를 정량화하고이 연구에 기술 된 바와 같이 다른 유전자형과 비교 될 수있다. 모자이크 EAD의 특정 유전 적 병변의 존재가 발달시기와 애벌레 성장의 지속 시간에 영향을 미칠 수있는 점에 유의하는 것도 중요합니다. 애벌레의 준비는 모자이크 조직의 분석은 같은 연대 또는 발달 단계의 동물을 사용하여 수행할지 여부를 결정합니다. 파일럿 실험을 수행하는 단계 (A)의 영향을 평가발달시기에 새로운 EAD 클론 유전자형이 바람직하다.
기술적 한계도있다. 우선, eyFLP-MARCM 도구를 구축 할 수있는 다른 클론 유전자형의 수는 있지만 큰 무한이 아니다. 예를 들어, 서로 다른 염색체에있는 조합이 돌연변이 대립 유전자가 동시에 염색체에 재조합의 낮은 효율에 의해 방해하고 작은 네 번째 염색체에있는 유전자는 일반적으로 액세스 할 수 없습니다 있습니다. 유전자의 RNAi를 사용하여 넉다운 유전자는 대체 솔루션입니다. Gal80 리프레이 저하되어 있지 때까지 - 그러나, 도입 유전자가 바로 유사 분열 재조합에 표시되지 않는 것을 깨닫게하는 것이 중요하다. GAL4 / UAS 발현 시스템의 활성은 29 ℃에서 성장 유충에 의해 향상 될 수있다. 높은 온도가 성장 속도, 발달시기, metaboli 등 다양한 발달 생리 학적 및 분자 매개 변수에 영향을 미친다는 것을 염두에 두어야하지만, 중요하다SM 유전자 발현 34-37. 따라서, 이러한 유충의 준비 또는 사체 프로파일에 대한 해부 EAD의 수와 제공하는 프로토콜에 대한 적응이 필요하다.
eyFLP-MARCM 테스터는 건강한 균주들 수 없습니다. 하나의 게놈 손상의 여러 유전자는 체력과 생산력을 비행. 이 주식은 유지 처녀 여성의 큰 컬렉션을 위해 확장 할 특별한주의가 필요합니다. 가능한 비록 본 연구의 MARCM 82B 그린 테스터 라인 11에 설명 된대로, 유 전적으로 불안정 할 때 동형 접합. 이 소장, tracheae, 뚱뚱한 몸, 그리고 애벌레 표피 등 다양한 배수체 조직 내에서 자궁외, GFP 표지 클론을 표시 "표범 애벌레"의 자연스러운 모습에서 분명하다. 모두가 아버지의 유전자형의 독립적 인 십자가에서 이러한 현상이 발생합니다. 우리는 자궁외 GFP 패치는 두 FR 사이의 제어되지 않은, 확률 적 재조합 발생할 것으로 추정노란색 + 마커 및 "STOP 카세트"의 제거를 일으키는 FLP 아웃 카세트에 T 사이트. 배수체 조직에서, 튜 불린 프로모터 구동 Gal80 리프레은 GAL4 활동을 차단하기 위해 충분하지 않을 수 있습니다. EAD 뇌 이외의 조직에서의 유전자 변형 세포의 존재는 실험 클론의 동작에 영향을 미칠 수있는 전신 신호를 유도 할 수있다. 이러한 "표범 유충은"따라서 분석에서 제외되어야한다. 또한, 우리는 정기적으로 다시 설정 한 남녀 십자가에서 MARCM 82B 녹색 시험기.
상술 한 함정 불구하고 유전자 기능을 연구하는 eyFLP-MARCM 시스템의 응용 및 클론 종양과 그 환경 사이의 상호 작용은 다양하다. 이러한 LEXA로 GAL4 / UAS 독립적 인 바이너리 표현 시스템의 도입 / LexOp 38 또는 약물 제어 QF는 / Quas입니다 / QS 39, 40은 형질 전환 유전자의 특급 통해 미세 제어를 제공 할 것이다ression 및 / 또는 동시 표시와 클론, 비 클론 상피 세포 및 혈구 세포 등 다양한 세포 집단의 조작. 이러한 모자이크 조직은 다시 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 처리 할 수있다.
제 령 유충 (프로토콜 (3))에서 EAD 모자이크 EAD / 뇌 착체의 박리 방법은 또한 초기 발달 단계에 적용될 수있다. 중요한 것은, EAD / 뇌 단지에 대한 프로토콜은 날개, haltere 다리 가상적인 디스크의 복구를 허용합니다. 이러한 RNA 분리 (프로토콜 섹션 3.3.2 7), 관심의 디스크가없는 조직에서 청소와 EAD와 유사하게 처리되어야 사용되어야한다. 그들의 작은 크기로 주어 수거 haltere 다리 디스크의 수가 RNA의 충분한 양을 확보하기 위해 증가되어야한다.
EAD (프로토콜 (7))에서 총 RNA의 추출을위한 프로토콜은 다른 상업 V에서 제공 RNA 용해 시약을 기반으로endors (재료 / 장비의 목록 참조). 절차의 전반적인 성공은 주로 의존는 (i) 애벌레의 충분한 수를 갖는, (ⅱ) 해부, 및 (iii) RNases에서 무료 샘플을 유지하면서 신속하고 정확한 주도했습니다. 깨끗한 작업 공간 및 악기를 유지의 RNase없는 플라스틱 제품과 솔루션을 사용하여 장갑을 착용하고 얼음에 샘플을 유지하는 모든 RNA 저하를 줄일 수 있습니다. 완전히 DNase를 처리 (프로토콜 7.11)에 의해 제거 할 수있는 게놈 DNA와 RNA의 오염을 방지하기 위해, 제 시간에 (프로토콜 섹션 7.6)에 대해 성상 수집시 계면을 방지하는 것이 중요하다. 두 DNA의 오염 및 RNA 분해는 자동 전기 시스템 (그림 6B, 6C)에 샘플을 실행하여 공개 할 수있다. RNA를 분리 프로토콜 넓은 응용을 갖는다. 이를 성공적으로 RNA를 상이한 발육 단계의 전체 유충으로부터 적출 성인에서 각종 사용되어왔다애벌레 기관. 얻어진 RNA는 QRT-PCR과의 mRNA-서열 20,24,41,42으로 게놈 전체의 전 사체 분석 모두에 적합했다. 대부분의에서 선택의 mRNA의 수만을 정량화 QRT-PCR에 비해 편견 mRNA의 염기 서열은 게놈 전체의 발현 분석을 허용합니다. 따라서, 하나의 종양 (24)의 별개의 단계에서 특정 유전자 병변에 의해 유도 종양 전 사체 서명을 비교할 수있다. 이 결과는 클론에서뿐만 아니라 주변의 비 클론 조직의 변화를 반영하지 않도록, RNA는 전체 디스크에서 오는 명심하는 것이 중요하다. 세포 - 사용 가능한 프로토콜을 적용하여 해리 모자이크 EAD에 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 수행 43,44 특정 세포 집단, 예를 들면, 클론 (GFP의 +) 및 비 - 클론 (GFP)의 전사 특성을 결정하기 위해 적용될 수있다.
여기에 설명 된 고정 및 면역 프로토콜은 SIMUL 적합특정 항체 및 유전자 변형 기자의 활동과 관심의 단백질의 taneous 시각화. 본 연구에서 사용 된 두 개의 리포터 유전자 중 하나에 의해 생성 된 세포 클론을 DsRed 형광 마킹 GFP 신호는 모두 고정 및 면역 걸쳐 보존 직접 공 초점 현미경에 의해 시각화 될 수있다. 그러나, 형광 단백질에 대한 항체는 신호 강도를 증폭 할 수있다. 유사하게, 항 - β 갈 락토시다 제 항체를 사용하는 박테리아의 lacZ 유전자에 기초하여 트랜스 제닉 리포터 검출을 용이하게한다. 상대 리포터 활동은 비 클론 조직하여 이미지 분석 소프트웨어 (예, 피지, ImageJ에) 대 클론의 상대적인 화소 강도를 측정함으로써 평가 될 수있다. 상이한 클론 유전자형 중 리포터 활성을 비교하면, 화상 취득 설정 상수 (프로토콜 부 (5)와 레퍼런스 21,22)를 유지해야한다. 프로토콜은 많은 다른 잘 작동하지만ntibodies, 권장 항체 농도를 최적화 할 필요가있다. 변경은 고정 시간, 유형 및 세제 (트리톤 X-100, 트윈 20, 사포닌)와 고정액 (8 % PFA, 4 %의 포름 알데히드의 EtOH)의 농도가 필요할 수 있습니다.
상술 한 프로토콜과는 달리, 종양 침입의 정량화 제 령 유충 및 EAD / 뇌 착체로 제한된다. 그럼에도 불구하고, 전체적인 이론적 근거인지 편향 회피해야하는 정량적 연구에 적용 할 수있다. 이 방법은 철저가 필요합니다. 시간 악성 종양이 증가함에 따라, 그것은 같은 연령의 유충과 비교하는 것이 중요하다 (예를 들어, 달걀 부설 후 7 또는 8 일). 시간에 따른 종양 클론 대규모 자라다 수 아직 종양 세포는 EAD 내에 남아있다. 뇌는 EAD (프로토콜 섹션 4.4.1)로부터 분리되는 단계 위양성 침입 카운트를 방지하는 것이 중요하다. 첨부 된 EAD와 두뇌의 설치하면 flatt합니다조직 도중에 뇌 구조물을 커버함으로써 임의의 정량을 방지 자란 EAD 원인. 이상적으로, 하나는 살아있는 유충에 직접 침습 과정을 캡처하고 싶습니다. 트랜스 제닉 리포터는 관련 세포 집단 및 조직을 사용할 수 있으며 eyFLP MARCM - 시스템과 결합 될 수있는 시각화. 불행하게도, 침략 과정은 일 몇 시간 동안 살아 유충을 유지와 호환되지 않는 시간 프레임을합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
