Summary
Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.
Introduction
Krebs stellt eine der genetisch heterogene Gruppe von Krankheiten, deren Häufigkeit und Sterblichkeit dramatisch zunimmt, insbesondere bei älteren Menschen weltweit. Krebs stammt klonal aus einem Tumor-initiierende Zelle, die inhärente Tumorsuppressor Mechanismen entweicht und teilt außer Kontrolle. Die allmähliche Ansammlung von genetischen Läsionen, die kooperativ Wachstum, die Vermehrung und Beweglichkeit fördern, während der Tod und die Differenzierung Hemmung verwandelt die anfängliche gutartige Wucherung in eine hochmaligne, metastasiertem und tödlichen Tumor. Es hat sich gezeigt, dass zusätzlich zu genetischen Veränderungen, die Tumorprogression Veränderungen im umgebenden Stroma und Übersprechen zwischen den Tumor und mehrere Zelltypen (beispielsweise Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) in seiner Mikroumgebung erfordert. die molekularen Prinzipien zugrunde liegenden malignen Transformation einschließlich Tumor-Stroma-Interaktionen zu verstehen, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung von prevention und frühen Screening-Strategien, sowie neue und wirksame Behandlungen von Krebsmetastasen und Medikamentenresistenz zu bekämpfen.
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein attraktives System für die Krebsforschung geworden 1-4 seiner schnellen Generationszeit wegen bemerkenswerte Erhaltung der Knoten zwischen Fliegen und Menschen, begrenzte genetische Redundanz und Fülle von fortgeschrittenen genetischen Werkzeugen , Signalisierung , die Manipulation von fast jedem Gen erleichtern ein temporär und räumlich beschränkten Weise. Genetisch definierte Tumoren unterschiedlicher Malignität reproduzierbar in Drosophila konstruiert werden durch Verstärkungs- und loss-of-function Mutationen in einer Untergruppe von Vorläufern in einem ansonsten Wildtyp - Gewebe unter Verwendung der MARCM Technik 5 einzuführen. Das MARCM Werkzeug kombiniert FLP / FRT (FLP - Rekombinase / FLP Recognition Target) -vermittelten mitotische Rekombination 6 mit FLP-out 7 und Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 ZielgenExpressionssysteme 9. Mit dieser Methode Expression jedes UAS-basierten Transgen, einschließlich Onkogen oder fluoreszierendes Protein cDNAs oder invertierte DNA-Wiederholungen für dsRNA-induced gene silencing, wird auf einen Klon von Zellen beschränkt werden, die einen bestimmten genetischen Locus und einen Gal4 Repressor aufgrund Rekombination verloren (1A). Geklonte Patches mit grün fluoreszierenden markiert (GFP) oder rot fluoreszierende Proteine (zB RFP, DsRed, mCherry) leicht während der gesamten Entwicklung, isoliert und analysiert verfolgt werden. Wichtig ist, dass ihr Verhalten direkt zum benachbarten Wildtyp-Gewebe verglichen werden. So relevante Fragen an die Zelle autonomen und nicht autonomen Auswirkungen der genetischen Läsionen können bequem untersucht werden. Ähnlich wie bei Säugetieren, nur Klone , bei denen mehrere onkogene Läsionen in Drosophila maligne kombiniert werden und die wichtigsten Merkmale von Säugetierkrebs rekapitulieren. Sie overproliferate, entziehen Apoptose induzieren Entzündung, unsterblich geworden und invasive und tötete schließlich den Host - 10-17.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung genetisch definierten klonale Tumoren im Auge / antennal und Hirngewebe von Drosophila - Larven der MARCM Technik. Das Verfahren beruht auf einem MARCM Tester Lager, das die Hefe FLP - Rekombinase unter der Kontrolle des eyeless Enhancer (eyFLP) 18,19 zum Ausdruck bringt. Auf diese Weise GFP-markierten Klone werden erzeugt sowohl in peripodial und Epithel des EAD und dem Neuroepithel des Gehirns gesamten embryonalen und Larvenstadien (1A, B und Referenz 20). Die Klone können leicht bis zum Erwachsenenalter verfolgt werden, wie der EAD entwickelt sich zum erwachsenen Auge, Antenne und Kopfkapsel während der neuroepithelium Aufstieg zu Neuroblasten gibt, die differenzierte Optik lobe Neuronen erzeugen.
Zur Erleichterung der umfangreiche molekulare, funktionelle und phänotypische Charakterisierung des Mosaiks Gewebe, wir deSchreiber ein Protokoll für die Präparation des EAD und Gehirn von der dritten Larvenstadium und beschreiben, wie sie für drei verschiedene Anwendungen zu verarbeiten: (i) Nachweis von transgenen fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung, (ii) die Quantifizierung der Tumor Invasivität und (iii) Analyse Veränderungen der Genexpression eine quantitative Echtzeit - PCR (qRT-PCR) oder ein Hochdurchsatz - Sequenzierung mRNA (mRNA-seq) (1C) verwendet wird .
Die Immunofärbung Protokoll kann jedes Protein von Interesse mit einem spezifischen Antikörper zu visualisieren verwendet werden. Transgene fluoreszierende Transkriptions Reporter ermöglicht eine bequeme und präzise räumlich-zeitliche Informationen über die Aktivität eines bestimmten Signalwegs. Zell-Abstammungslinie spezifischen Reportern, andererseits widerspiegeln qualitative und quantitative Veränderungen in Zellpopulationen im mosaic Gewebe und unter Tumoren von unterschiedlichen Genotypen. Die Quantifizierung von invasiven Verhalten erleichtert den Vergleich von Tumor Malignität zwischen Genotyps. Schließlich ist das Protokoll beschreibt, Erfassung und Verarbeitung von Mosaik EAD für die RNA-Isolierung eignet sich sowohl für kleine und große Downstream-Anwendungen wie Reverse Transkription, gefolgt von qRT-PCR und genomweite mRNA-seq sind. Die qualitativen und quantitativen Daten aus diesen Tests gewonnenen Ergebnisse liefern neue Einblicke in das soziale Verhalten von klonalen Tumoren. Außerdem produzieren sie eine solide Grundlage für funktionelle Untersuchungen über die Rolle einzelner Gene, genetische Netzwerke und Tumor-Mikroumgebung in verschiedenen Phasen und Aspekte der Tumorentstehung.
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Protocol
HINWEIS: Diese Arbeit nutzt die eyFLP1; act> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, wannen Gal80 MARCM 82B Grüne Tester Linie 11. Quer durch die MARCM 82B Grüne Tester Jungfrauen zu Männern von Stämmen wie w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut Genotyp nachgeben Nachkommen , in der mitotischen Rekombination zwischen den rechten Arm der 3. homologen Chromosomen auftreten. Auf diese Weise homozygoten mutanten Klone zur Gen - c zur FRT82B Stelle distal angeordnet wird innerhalb des EAD und Gehirn Neuroepithel erzeugt werden. Diese Klone werden exprimieren GFP - Transgen ein und dsRNA für die Gen - b (Abbildung 1A). Verschiedene eyFLP-MARCM Tester Linien für die Rekombination auf dem X, 2L, 2R, 3L und 3R wurden eingerichtet und sind in der Fliege-Community zur Verfügung.
1. Fly Handling, Kreuze und Staging
- Erweitern Sie den entsprechenden MARCM Tester Lager bei Raumtemperatur durch mehrere bo bevölttles zugleich. Drehen Sie die Erwachsenen in frische Flaschen alle 2-3 Tage, so dass genügend Jungfrauen für nachfolgende Kreuze gesammelt werden.
HINWEIS: Bei der Jungfrauen sammeln, vermeiden eine längere Exposition zu CO 2 als das weibliche Fruchtbarkeit beeinträchtigt. - Je nach Umfang des Experiments eingerichtet fly Kreuze in Fläschchen mit mindestens 10 MARCM Tester Jungfrauen und 4 Rüden (zB für die Abbildung von fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung) oder in Flaschen mit mindestens 30 Jungfrauen und 10 Männer (zB für RNA-Isolierung und Quantifizierung der Invasivität).
- Raise Nachkommen bei 25 ° C unter einem langen Tag 16 Stunden / 8 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus. Flip Eltern in neue Fläschchen / Flaschen alle 24 Stunden, um reproduzierbare Durchführung von Larven erleichtern und Übervölkerung zu verhindern.
HINWEIS: Beim Start am Tag 6 nach der Eiablage (AEL), der späten dritten Larvenstadium Kontrollarven Stop Fütterung, beginnen wandern und Puparium-Bildung ein. Im Gegensatz dazu kann der Beginn des Larven-pupal Übergang dEverlegt oder nicht existent in Larven mit EAD hyperplastische oder maligne klonale Tumoren tragen.
2. Sammeln Dritte Larvenstadium
- Für die Immunfärbung, sammeln etwa 20 späten dritten Larvenstadium (Wanderung an der Wand und die eines vergleichbaren Körpergröße aus der Nahrung). Verwenden einer Pinzette vorsichtig Larven zu holen aus dem Fläschchen oder Flasche und übertragen diese in einen Embryo Glasschale gefüllt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Für die RNA-Isolierung und Quantifizierung der Invasivität, sammeln mindestens 80 späten dritten Larvenstadium (Wanderung an der Wand und die eines vergleichbaren Körpergröße aus der Nahrung). Verwenden Sie eine Spritzflasche PBS in eine Fliege Flasche mit Larven zu spritzen, bis die Oberfläche bedeckt ist.
- Erweichen Sie die oberen Schichten der Nahrung mit einem Spatel und gießen Sie die Lebensmittel Maische Larven in eine Petrischale enthält. Mit einer Pinzette, Pick sanft Larven und übertragen diese in einen Embryo Glasschale mit PBS gefüllt.
- Waschen Sie Larven mit PBS until alle Speisereste entfernt. Überprüfen Sie die Larven unter dem Fluoreszenzstereomikroskop mit 8 bis 16 - facher Vergrößerung , alle "Leopard - Larven" zu verwerfen, die während des Larvenkörper (2A, 2B und siehe Diskussion Sektion) random GFP-positive Flecken führen.
HINWEIS: Für die RNA-Isolierung umfassen einen vorletzten Waschschritt in 70% EtOH für 1 min. - Die Schale enthält ausgewählte Larven in PBS auf Eis, bis Dissektion. Prozess Larven innerhalb von 30 min negativen Auswirkungen von Kälte und Hunger zu vermeiden.
3. Dissection von Larvae
- Um den EAD unter einem Stereomikroskop sezieren, ein Paar Zangen verwenden, um sanft den mittleren Teil der Larve gegen die Glasschale unten drücken. Mit der zweiten Zange, greifen die Larven Mundhaken und ziehen Sie sie vom Körper weg (Abbildung 2C).
HINWEIS: Die Zugkraft ist oft ausreichend, um die Optik Stiele Anschluss des EAD pai zu brechenr den Hirnlappen. Wenn das Gehirn oder seine Teile zu EAD und ihre Anwesenheit verbleiben, ist nicht für weitere Anwendungen gewünscht, schneiden Sie die Optik Stiel mit Hilfe der beiden Paare von Zangen. Für invasive Tumoren (zB ras V12 scrib 1) die Verbindung zwischen EAD und den Hirnlappen zunehmend mit der Zeit durch überwuchert und die Migration klonalen Zellen verdeckt wird.- Um den EAD / Gehirn - Komplex mit einem intakten Bauchmark (VNC) (2D) herzustellen, verwenden Pinzette eine Larve in der Mitte des Körpers zu schneiden. Entsorgen Sie die hintere Hälfte.
- Halten Sie die vordere Hälfte des Larvenkörpers zwischen den Spitzen einer Zange, drehen Sie die Larve von innen nach außen, indem sie mit der Spitze der zweiten Zange in den Mund Haken schieben und durch die Kutikula über sie mit dem ersten Zangenpaar rollen.
- Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie alle Fremdgewebe (zB Speicheldrüsen, Fettkörper und Darm) , während das EAD Paar verlassen oderder EAD / Gehirn-Komplex mit den Mundhaken verbunden. Entwirren die Mundhaken von der darüber liegenden Kutikula. Free the VNC durch die axonalen Projektionen Trennen erstrecken Körpermuskulatur und Epidermis (1B, 2C, 2D).
HINWEIS: Die Mundhaken zur sicheren Handhabung von Gewebe mit einer Pinzette ermöglichen und effizienter Versenkung und einfache Erkennung von Gewebe während des Waschens zu erleichtern. Dissected EAD Änderung Morphologie relativ schnell, wenn in PBS nicht fixierten gehalten. Begrenzen Sie die Dissektion Zeit auf 20-30 min. - Um das Gewebe zu übertragen, Mantel ein P20 Mikropipettenspitze durch die restliche Körper Pipettieren Gerippen mehrmals auf und ab. Um die größeren EAD / Hirn-Komplexe übertragen, schneiden Sie die P20 Mikropipette Spitze mit einer Schere.
HINWEIS: Das Beschichtungsverfahren ist entscheidend Klebe- und den Verlust von sezierten Gewebe während der Übertragung zu verhindern. Die Verwendung einer P20 Mikropipette minimiert die Übertragung von PBS in Fixierungslösung, unerwünschte Verdünnung zu begrenzen.- Für die Immunfärbung, übertragendie seziert EAD in ein 0,5-ml-Röhrchen mit 400 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel gefüllt. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PFA für größere EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität.
ACHTUNG: PFA ist hochgiftig. Schutzhandschuhe tragen und Kleidung. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäute. - Für die RNA-Isolierung übertragen die seziert EAD in eine neue Glasschale mit kaltem PBS gefüllt. Verwenden einer Pinzette zu reinigen EAD aus den Ring und Lymphdrüsen, Probe Verunreinigungen zu minimieren.
- Nehmen Sie den EAD aus den Mundhaken durch die Verbindung zwischen den Antennenscheiben Trennen und Mundhaken mit einer Pinzette (Abbildung 2E). Um RNA-Abbau und die Genexpression Artefakte zu vermeiden, begrenzen die Dissektion Zeit auf 30 min. Fahren Sie mit Schritt 7 fort.
HINWEIS: Ein erfahrener Forscher kann etwa 60 Larven in 30 min ohne Zeit für die Larven Sammlung und Waschen benötigt sezieren. Die Gesamt-RNA-Ausbeuten hängen von der EAD Größe, die unter Genotypen und developmenta variierenl Stufen. Dissection von 80-100 Steuer EAD Paare von späten dritten Larvenstadium sollte 5-8 & mgr; g Gesamt-RNA erhalten.
- Für die Immunfärbung, übertragendie seziert EAD in ein 0,5-ml-Röhrchen mit 400 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel gefüllt. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PFA für größere EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität.
4. Befestigung, Immunostaining und Montage
- Fix Proben in PFA Fixativ für 25 min, während bei Raumtemperatur Taumel. Die Fixierungszeit ohne Veränderung Gewebemorphologie und die Antigenität von Proteinen bis zu 60 min verlängert werden.
- Entfernen Sie die Fixierlösung und Waschproben mit PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) dreimal für 10 min ein Nutator verwenden. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen von PBST für jeden Waschschritt (400 & mgr; l / 0,5 ml Röhrchen).
HINWEIS: Fest EAD / Gehirn Komplexe bedeutete für das Scoring der Invasivität nicht Immunofärbung erfordern. GFP-Signal bleibt gut sichtbar nach der Fixierung. Gehen 4.4 für die endgültige Präparation zu treten.- Für die Immunfärbung, Block Gewebe in 200 ul einer Blockierungslösung (PBST mit 0,3% BSA) für 20 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
- Inkubieren mit primary Antikörper bei 4 ° C über Nacht in 100 ul einer Blockierungslösung verdünnt unter leichtem Schütteln. Wenden Sie sich an primären Antikörper Datenblatt oder der veröffentlichten Literatur für empfohlene Antikörperverdünnung.
HINWEIS: Die primäre Antikörperverdünnung kann optimiert werden müssen. - Nach fünf 10 min Waschen in PBST, Fleckengewebe mit den fluoreszierenden sekundären Antikörpern verdünnte Lösung bei der Blockierung während sanft für 2 Stunden bei Raumtemperatur schütteln oder über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln.
- Wash Proben dreimal 10 min in PBST.
- Inkubieren mit primary Antikörper bei 4 ° C über Nacht in 100 ul einer Blockierungslösung verdünnt unter leichtem Schütteln. Wenden Sie sich an primären Antikörper Datenblatt oder der veröffentlichten Literatur für empfohlene Antikörperverdünnung.
- Für die Immunfärbung, Block Gewebe in 200 ul einer Blockierungslösung (PBST mit 0,3% BSA) für 20 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
- Ersetzen PBST mit 500 ul DAPI-Färbelösung. F-Actin beschriften, fügen phalloidin an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert mit DAPI-Färbelösung. Nach 15 min im Dunkeln Nutation, wasche Gewebe einmal für 10 min mit PBST.
HINWEIS: F-Aktin Kennzeichnung unabhängig durchgeführt von DAPI-Färbung werden kann. - Für die endgültige Präparation Schritt übertragen Gewebe zurück in eine PBS-gefüllten Glasschale mit einem 1 ml pi mitPette. Mit den beiden Zangen die Mundhaken abschneiden.
- Trennen Sie die Gehirne, die zur Quantifizierung der Invasivität von der EAD verwendet wird, durch die Optik Stiel als bewachsen EAD schneiden könnte die Analyse erschweren.
- Geben Sie einen Tropfen des Montagemedium (15 & mgr; l für eine 22 mm x 22 mm Deckglas) auf einer objektiven Folie. Mit Hilfe der Zangenspitzen, zu verteilen, das Medium in eine dünne Schicht. Übertragen EAD, Gehirn oder die EAD / Gehirn-Komplexe in die Montagemedium mit einer P20 Mikropipette.
- Verwenden Sie die Zangenspitzen oder ein Wolframstab Gewebe zu verteilen und die VNC auf der Folie zu begradigen.
- Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, während, erste Berührung einer Kante einer Deck zur Montagemedium und dann langsam tiefer auf die Montagemedium mit Hilfe einer Pinzette Montage. Verwenden Sie kleine Stücke von Filterpapier oder Gewebe wischen Überschüssiges Montagemedium rund um die Deck Kanten zu absorbieren.
HINWEIS: DABCO / Poly (Vinylalkohol) 4-88 Eindeckmediums verhärtetbei 4 ° C innerhalb einer Stunde. Folien können für Monate bei 4 ° C gelagert werden.
5. Die konfokale Imaging
- Erwerben Sie einzelne konfokale Schnitte und Stapeln ein konfokales Mikroskop mit 20X, 40X und 60X Öl Ziele ausgestattet werden.
- Verhindern Pixelsättigung. Verwenden Sie gleiche Bildaufnahmeparameter einschließlich Bildauflösung, Lasereingangsleistung, Gain, Offset, Bildmittelung, einer Schrittweite in einer z-Serie und halten Sie diese Einstellungen für alle Genotypen für den Vergleich von Pixelintensitäten zwischen verschiedenen Genotypen 21,22 zu ermöglichen.
HINWEIS: Für die Visualisierung von EAD / Gehirn-Komplex, maximale Projektionen erzeugen und Stich jeweiligen Nachbar Bilder. Für die endgültige Bildvorbereitung, verwenden Post Bildverarbeitungssoftware für Tafelaufbau und Helligkeit und Kontrast einzustellen.
6. Quantifizierung der Tumorinvasivität
- Definieren Sie ein Punktesystem, das die verschiedenen Ebenen der Tumor invasivenes charakterisierens das räumliche Muster der Invasion und die Menge an GFP-positiven Zellen unter Berücksichtigung in das Gehirn und VNC verbreiten. Bereiten Bewertungsbögen zur Dokumentation (3A).
- Berg mindestens 80 intakten Gehirn für jeden Genotyp auf einer Folie unter Verwendung von 40 & mgr; l des Eindeckmediums pro 24 mm x 50 mm Deckglas befestigt.
- Damit unvoreingenommene Scoring, fragen Sie eine neutrale Partei, die die Folien zu anonymisieren, so dass die Scoring-Verfahren unvoreingenommen ist. Bewerten anonymisierten Dias durch zwei voneinander unabhängige Labor Mitglieder. Disc Genotypen erst nach dem Zählen fertig ist.
- Werten Sie den Grad der Bösartigkeit von einem blinden Scoring-berittener Gehirne unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einem GFP-Filtersatz ausgestattet. Verwenden Sie eine Markierung Gehirne zu kennzeichnen , die bereits angezeigt wurden Doppelzählungen (3B) zu vermeiden.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der Gehirne in jede der definierten invasive Kategorien pro Genotyp fallen. Bestimmen Sie die statistischen significance mit einem Chi-Quadrat - Test (3C).
7. RNA-Isolierung, DNase Behandlung und Qualitätsprüfung
HINWEIS: Alle Reagenzien (Lösungen Kunststoff, Kunststoff) in den folgenden Schritten verwendet werden, sollten frei von RNase-Aktivität sein. Immer Handschuhe tragen und eine chemische Haube für die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln verwendet werden.
- Übertragen Sie die saubere EAD mit einer beschichteten P20 Mikropipettenspitze in 1,5-ml-Röhrchen.
- Lassen Sie Gewebe sinken auf den Boden des Röhrchens vorsichtig entfernen PBS und ersetzen Sie es mit 100 & mgr; l RNA Lysereagenz (ausreichend für bis zu 140 EAD).
- Lyse Gewebe durch Verwirbelung. An dieser Stelle können die Proben tiefgefroren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C gelagert oder direkt mit einem Standard-RNA-Isolierung Protokoll verarbeitet.
HINWEIS: Die Proben von ähnlichen Genotypen aus mehreren Dissektion Runden kann einmal in RNA Lysereagenzes gepoolt werden. - Füllen Sie das Probenvolumen auf 0,9 ml mit RNA Lysereagenzes. In 0,2 ml Chloroform und mischen Proben vigoronuierlich für 15-20 Sek.
- Nach 2 bis 3 min Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugiert werden die Proben bei 10.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
- Übertragen farblos obere wässrige Phase, die RNA in ein frisches Röhrchen, ohne die Interphase zu stören. Halten Sie sich von der Inter weg, wie es Proteine und genomische DNA enthält.
HINWEIS: Die rückgewonnene Volumen sollte zur Homogenisierung verwendet etwa 60% des Volumens der RNA Lysereagenz sein. - Auszufällen die RNA durch Zugabe von 0,5 ml Isopropylalkohol. Vortex und Inkubation Proben bei Raumtemperatur für 10 min.
- Zentrifugiere die Proben bei 10.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet einmal mit 600 & mgr; l 75% Ethanol. Nach einer kurzen Wirbel und Zentrifugation (10.000 × g für 7 min bei 4 ° C) alle Ethanol verwerfen und lassen Sie wischen das RNA-Pellet lufttrocken für 5-10 min das offene Rohr mit einem sauberen Tuch platzieren.
HINWEIS: Das RNA-Pellet könnte als winziger opak / weiß st sichtbar seinam Boden des Röhrchens oder unsichtbar reif. Die restlichen Ethanol Tropfen können vorsichtig mit P10 Mikropipettenspitze entfernt werden. - Löse RNA in 50 ul DEPC-behandeltem Wasser durch Vortexen oder vorbei Lösung einige Male durch eine Pipettenspitze.
- Um eine Kontamination mit genomischer DNA minimieren, Behandlung Gesamt-RNA mit DNase durch Zugabe von 50 ul einer Mischung, enthaltend 1 ul DNase (2 U / ul) und 10 ul 10x-Puffer DNase in DEPC-behandeltem Wasser. Vortex und Spin-down.
- Inkubieren Proben bei 37 ° C in einem Wasserbad oder einem Heizblock für 30 bis 40 min. Nach der Inkubation wurden 100 ul DEPC-behandeltem Wasser in jeder Probe hinzu.
- Um die enzymatische Aktivität und saubere RNA von DNase zu inaktivieren, 200 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) -Lösung, vortex für 1 min und zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 xg für 7 min bei 4 ° C.
- Sorgfältig Transfer-RNA in ein frisches Röhrchen die obere wässrige Phase enthält. In gleichen Volumen (200 ul)Chloroform, mischen und den Zentrifugationsschritt von oben wiederholen.
- Sammeln sorgfältig die obere Phase und auszufällen RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 , hergestellt in DEPC H 2 O und 2,5 Volumen 100% Ethanol. Gut mischen durch Vortexen.
HINWEIS: Durch Hinzufügen 0,5 ul Glykogen (20 ug / ul) zu einer Fällung Mischung hilft, die RNA-Pellet zu visualisieren. RNA-Verlust, verwenden silikonisierte, Low-Bindung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu minimieren. - Auszufällen RNA bei -20 ° C für mindestens 1 Std.
HINWEIS: Die Inkubation kann über Nacht durchgeführt werden. Proben können auch bei -80 ° C platziert. - Pellet RNA durch Zentrifugation bei 10.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Waschen und Trocknen des Pellets nach der Beschreibung in 7.9.
- Man löst RNA in 10-15 ul DEPC-behandeltem Wasser. Store RNA bei -80 ° C.
- Bestimmen Menge und Reinheit der RNA wurde durch OD bei 230 nm gemessen wird, 260 nm und 280 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen RNA concentration durch die Konvention, dass 1 OD bei 260 nm Anwendung 40 ug / ml RNA entspricht.
HINWEIS: Die A 260/280 Verhältnis von "reinen" RNA ist gleich 2,0 , während ein A 260/230 - Verhältnis im Bereich von 2,0 bis 2,2 liegen. RNA - Proben mit einem A 260/280 - Verhältnis zwischen 1,7 und 2,0 sind geeignet für Downstream - Anwendungen wie cDNA - Synthese. Für die Herstellung von mRNA-seq Bibliotheken die Qualität und Quantität von RNA sollte unter Verwendung eines automatisierten Elektrophorese-System überprüft werden. Das 28S / 18S-Verhältnis sollte über 1,8 sein.
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Representative Results
GFP-markierten Flecken von definierten Genotypen in Drosophila EAD, drei Arten von Klonen , um das Potential der eyFLP-MARCM Technik zeigen , wurden zu erzeugen induziert: (1) Kontrolle, die GFP allein, (2) maligne Tumore eine onkogene Form des kleinen exprimierenden G-Protein Ras (Ras V12) in einem Hintergrund von homozygoten Verlust eines Gens scribble Tumorsuppressor (Scrib 1) und (3) Bewachsen aber nicht-invasive Scrib 1 JNK DN Klone ras V12, wo der Jun-N-terminale Kinase (JNK) wurde durch Expression seiner dominant-negative Form (Abbildung 4, Tabelle 1 für Genotypen) inaktiviert. Es hat sich gezeigt , dass die Invasivität von ras V12 Scrib 1 klonale Tumoren aberrante Aktivierung von JNK - Signalisierung erfordert und seiner stromabwärtigen Transkriptionsfaktoren 10,12,23,24. Außerdem ras V12 scrib 1 Drosophila Larve, was zu einer Infiltration von Immunzellen (genannt hemocytes) in den EAD 14,25.
Zu überwachen , wurde die Ebenen und räumliche Verteilung der JNK - Aktivität innerhalb der Mosaik Gewebe und unter Tumoren von unterschiedlichen Genotypen, die etablierte transgenen, JNK-responsive TRE-Reportergen DsRed 26 eingesetzt. Konfokalmikroskopie des eingeschnittenen, fixiert EAD und EAD / Hirn - Komplexe ergab deutliche Aufregulation der TRE-DsRed - Reporteraktivität in den Geweben Lager maligne ras V12 Scrib 1 - Tumoren (4B). Das DsRed Signal mit der Bezeichnung ras V12 scrib 1 - Klone in EAD (4B) sowie Tumorzellen in den Hirnlappen Ausbreitung und Invasion der VNC (4E, 4F). Im Gegensatz dazu activi der TRE-DsRed Reporterty blieb auf einer Reihe von Zellen beschränkt vom antennal der Steuerscheiben (4A ') zum Auge verlaufenden Teil. JNK Blockierungssignalisierungs resultierte in einer dramatischen Abnahme der TRE-DsRed - Signal in klonalen ras V12 Scrib 1 JNK DN Tumoren (4C, 4D). Diese Daten liefern somit funktionelle Beweise für eine Anforderung von JNK Signalisierung an das TRE-abhängige Transkriptionsantwort bei malignen ras V12 scrib 1 - Tumoren aktivieren. Eine linienspezifische hmlΔ-DsRed - Reporter, entwickelt für Drosophila Tracing hemocytes 27,28 eine Ansammlung von Immunzellen im Gewebe tragen maligne ras V12 scrib 1 - Tumoren (5B) zeigte. Im Gegensatz dazu wurden nur einzelne hemocytes oder wenige lokalisierten hemocyte Patches in Kontroll- und ras V12 Scrib 1 JNK DN mosaic EAD und Gehirngeweben nachgewiesen(5A, 5C). Immunostaining mit einem pan-hemocyte anti-Hemese Antikörper (H2) 29 bestätigt die Immunzellidentität von hmlΔ-DsRed - positiven Zellen (5D, 5E). In Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten 12,23,24, bestätigt unvoreingenommene Quantifizierung von Tumorinvasions eine zentrale Rolle von JNK Signalisierung bei der Tumorinvasion in die angrenzenden Hirnlappen und VNC (3C) zu fördern. Schließlich wurde die Gesamt-RNA aus dem Mosaik EAD isoliert. Die Proben wurden auf einem automatisierten Elektrophorese System für die Qualität und Quantität unterworfen entweder zu qRT-PCR oder analysiert. 6A zeigt signifikante JNK-abhängige Hochregulation von Matrix - Metalloproteinase 1 (MMP1) Transkript in EAD maligne ras V12 scrib 1 klonalen Tumore tragen, was bestätigt , die zuvor veröffentlichten Ergebnisse 12,24,30,31. Beurteilung der Gesamt-RNA eines automatisierten Elektrophorese-System zeigte tHut drei unabhängigen EAD Proben hatten einen 28S / 18S - Verhältnis über 1,8 (6B). Allerdings war EAD 2 RNA teilweise abgebaut, durch einen Abstrich auf dem Gel reflektiert (6C). Im Gegensatz dazu hatte EAD 3 Probe mit einer niedrigen Konzentration. Mehrere Banden mit höherem Molekulargewicht auf Gelbild (6B) und kleine Peaks auf der Elektropherogramm (6C), auch vorgeschlagen , DNA - Kontamination. Somit würde nur EAD 1 Probe für eine Präparation von mRNA-seq Bibliothek geeignet sein.
Abbildung 1: Schema des MARCM System zur Erzeugung von genetischen Mosaiken in der Drosophila EAD und Downstream - Anwendungen (A) Das MARCM System ermöglicht die Erzeugung von klonalen Patches mit definierten genetischen Läsionen in einem ansonsten Wildtyp (heterozygot).Kontext. Die Expression von FLP unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors (zB eyeless) katalysiert Rekombination zwischen den beiden FRT - Elemente flankieren die STOP - Kassette mit einem gelben (y) Gen markiert (act> y +> Gal4). Nach dem Entfernen der STOP - Kassette äußerte die ubiquitär Gal4 Transkriptionsaktivator (act-Gal4) kann Ausdruck eines beliebigen UAS-basierten Transgen fahren wie UAS-GFP (auch UAS-ras V12). In einer parentalen Zelle, jedoch ist die Gal4 - Aktivität durch einen Gal80 blockiert Repressor , dessen Expression durch einen Promotor kontrolliert Tubulin (wannen Gal80). In der G2-Phase des Zellzyklus vermittelt FLP den Austausch der nicht-Schwesterchromatiden zwischen den homologen Chromosomen distal zu den FRT-Stellen. Die Segregation der rekombinanten Chromosomen während der Mitose wird zu zwei Tochterzellen geben, von denen eine homozygote Mutante für einen bestimmten genomischen Locus (zB scrib
Abbildung 2: Sortierung der dritten Larvenstadium und repräsentative Beispiele für EAD und EAD / Hirn - Komplexe für verschiedene Downstream - Anwendungen verwendet (AB) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der dritten Larvenstadium Lager Kontrolle GFP-markierten Klone induziert mit dem eyFLP-MARCM 82B Grün - Tester.. (A) Repräsentative Steuer Larve mit Klonen zu den EAD und Hirnlappen beschränkt. (B) Ein Beispiel eines "Leopard Larve" GFP-positive Klone in verschiedenen Geweben im ganzen Körper trägt. (C) Hell Bilder von seziert EAD und (D) EAD / Hirn - Komplexe an die Mundhaken befestigt ist , und (E) EAD gereinigt von allen Fremdgewebe einschließlich Mundhaken. Maßstabsbalken = 2 mm (AB) und 500 & mgr; m (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Die Quantifizierung von Tumorinvasions (A) Fluorescent konfokale Bilder der Gehirne von ras V12 scrib 1 Larven seziert (7 Tage AEL) stellen die reale Beispiele für die vier verschiedenen Sorten von Invasivität Tumor aus nicht-invasiven Bereich (Score 0), ein Hirnlappen eingedrungen (Ergebnis 1), beide Gehirn eingedrungen Lappen (Ergebnis 2) zu einer starken Tumorinvasion mit klonalen Gewebe beide Gehirnlappen bedeckt und die VNC Eingabe (Ergebnis 3). Bilder sind Projektionen von mehreren konfokalen Abschnitte und Beispiele für Punkte 2 und 3 sind aus 2 x 2 konfokale Bilder vernäht. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) Ein Beispiel eines anonymisierten Objektträger mit fixierten Gehirne für unvoreingenommene verwendetunter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop Scoring. Erzielte Gehirne sind mit einem Stift markiert doppelte Registrierung zu verhindern. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m (C) Im Vergleich zu hochinvasiven ras V12 scrib 1 - Tumoren, die Hemmung der JNK - Signalisierung (ras V12 scrib 1 jnk DN) eliminiert Invasion von klonalen Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Die Aktivierung des Transkriptions TRE-DsRed Reporter in malignen ras 'V12' scrib '1 klonalen Tumoren ist JNK-abhängige (A. TRE-DsRed Reporter einen schmalen Streifen von Zellen aus antennal zu Augenteil (Pfeilspitzen) ausgeführt wird . (B) Die Aktivität des TRE-DsRed Reporter wurde in ras V12 scrib 1 GFP-positive Klone im Vergleich zu den umgebenden nicht klonalen EAD Epithel deutlich verbessert. (C) Hemmung der JNK - Aktivität führte zu einer deutlichen Reduzierung von DsRed Signalintensität in ras V12 scrib 1 jnk DN - Klone. (D) Eine weitere Verbesserung des DsRed Signal ergeben , nicht autonomen Aktivierung von JNK Signalisierung in Zellen rund um die ras V12 scrib 1 jnk DN - Klone. (E) Am Tag 8 AEL, ras V12 scrib 1 - Zellen überwuchsen die gesamte EAD und die sich auf die Hirnlappen mit dem VNC (Pfeil). (F) Die klonalen Zellen , die den VNC (close-up der Region m eindringendenarked durch den Pfeil in E) wurden für das Signal DsRed angereichert. (AC) zeigen Projektionen mehrerer konfokale Schnitte, (E) wird genäht von 3x3 konfokalen Bildern und (D, F) repräsentieren einzelne Sektion. Maßstabsbalken = 50 um. EAD, Augen- / antennal Scheibe; BL, Hirnlappen; VNC, Bauchmark. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Lineage-spezifische HML Δ -DsRed transgenen Reporter zeigt die Anreicherung von ras V12 scrib 1 tumorassoziierte hemocytes (A) In der Steuer EAD, hmlΔ-DsRed Reporter markierten hemocyte clu sters sind in den Vertiefungen des Auges und antennal Epithel gefangen. (B) EAD und Hirngewebe , bestehend aus ras V12 Scrib 1 GFP-markierten Tumoren zeigten eine erhöhte Anzahl von Hämozyten ganzen klonalen Gewebe gestreut. (C) Die Zahl der assoziierten hemocytes verringert dramatisch auf die Hemmung der JNK - Signalisierung in ras V12 scrib 1 jnk DN Mosaik Gewebe. (DE) HmlΔ-DsRed positive hemocytes wurden auch mit einem H2-Antikörper markiert, die den pan-hemocyte Marker Hemese erkennt. (AC) zeigen Projektionen mehrerer konfokale Schnitte, (A) von 2 x 2 und (BC) genäht werden aus 3 x 3 konfokale Bilder genäht. (DE) Sie sind einzelne Abschnitte. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m (AC) und 10 & mgr; m (EN). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6:.. Bewertung der Quantität und Qualität der Gesamt - RNA aus seziert EAD isoliert (A) Ein repräsentatives Beispiel für qRT-PCR - Ergebnisse unter Verwendung von vier biologischen Replikaten für jeden Genotyp MMP1 Transkriptspiegel wurden normalisiert auf rp49. Fold Change der Genexpression wurden unter Verwendung der relativen Standardkurvenverfahren 32 berechnet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; *** P <0,001 Student ungepaarten two-tailed t-Test mit ungleichen Varianz. (B, C) Bewertung der Gesamt - RNA Qualität und Quantität eine automatisierte Elektrophorese - System. Das virtuelle Gel Bild (B) zeigt die beiden prominenten Bands der 18S und 28S rRNA, die den wohldefinierte Peaks auf Elektropherogramme (C) entsprechen. DNA-Kontamination und RNA-Abbau durch, wie sie sichMear (Pfeilspitzen) und extranumerary Bänder und Spitzen (Pfeile). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Fly Dehnungen | Quelle / Kommentare |
| eyFLP1; act> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, wannen Gal80 | eyFLP-MARCM 82B Grün Tester 11 |
| w; UAS-ras V12; FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; UAS-ras V12; UAS-jnk DN FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | diese Studie, w; hmlΔ-DsRed von Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B | diese Studie |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B scrib 1 / TM6B | diese Studie |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | diese Studie, w; TRE-DsRed von Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B | diese Studie |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B scrib 1 / TM6B | diese Studie |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Drosophila Linien in dieser Studie verwendet.
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Discussion
Die Techniken der genetischen Mosaiken in Drosophila zu erzeugen , gehören zu den anspruchsvollsten Werkzeuge für die Analyse und die Genfunktion 33 zu manipulieren. Das eyFLP-MARCM System leistungsfähig und robust erwiesen , da sie die Induktion von visuell markiert, genetisch definierte Klone in einer räumlich beschränkten Weise ermöglicht, also in Geweben , in denen die augenlose Enhancer aktiv 9,18 ist. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere genetische Läsionen in den gleichen Zellen kombiniert sind. Während diese hoch aberrant patches Larvenentwicklung erlauben, wenn auf den EAD und Gehirn Neuroepithels beschränkt, sie können Letalität verursachen, wenn sie während des gesamten Larvenkörper wie im Fall von Hitzeschockgesteuerten FLP (hsFLP) Klone verstreut. Bezeichnenderweise aktiviert, in der Induktion von Klonen in der Fliege EAD Epithel kombinieren Onkogene mit Verlust von Tumorsuppressoren rekapituliert die Entstehung und Progression von soliden epithelialen Tumoren in einigen Krebserkrankungen des Menschen. However, das System hat auch seine Grenzen, die kurz erörtert werden. Da die Insekten haben einen offenen Kreislauf-System, wahre Metastasen als in menschlichen Krebserkrankungen beobachtet treten nicht auf. Daher ist der komplexe Prozess der metastatischen Verbreitung kann nicht treu in Drosophila modelliert werden. Dennoch EAD Tumoren wie die ras V12 scrib 1 Klone tun bösartigen Eigenschaften zeigen , wie sie die Basalmembran rund um den EAD nach unten brechen und dringen in das benachbarte Gehirn 11,12,31. Der Grad der Tumoraggressivität kann in dieser Studie unter verschiedenen Genotypen wie beschrieben quantifiziert und verglichen werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein von spezifischen genetischen Läsionen in mosaic EAD könnte Entwicklungs Zeitpunkt und die Dauer der Larvenwachstum beeinflussen. Staging der Larven wird bestimmen, ob Analyse von Mosaik Gewebe wird unter Verwendung von Tieren der gleichen chronologischen oder Entwicklungsstadium erfolgen. ein Pilotversuch durchführen, die Auswirkungen einer zu beurteilenneue EAD klonalen Genotyps auf Entwicklungs Timing ist wünschenswert.
Es gibt auch technische Einschränkungen. Erstens ist die Anzahl der verschiedenen klonalen Genotypen, die mit dem Werkzeug eyFLP-MARCM gebaut werden kann, ist groß, aber nicht unendlich. Zum Beispiel die Kombination von zwei mutierten Allele, die auf unterschiedlichen Chromosomen befinden sich durch eine geringe Effizienz der Rekombination auf beiden Chromosomen gleichzeitig behindert, und Gene auf dem kleinen vierten Chromosom lokalisiert sind in der Regel nicht zugänglich. Knock-Down transgenen RNAi unter Verwendung ist eine alternative Lösung. Jedoch ist es wichtig zu erkennen, dass Transgene nicht sofort auf mitotische Rekombination exprimiert - erst in der Gal80 Repressor abgebaut wird. Die Aktivität des Gal4 / UAS-Expressionssystem kann bei 29 ° C durch Züchten Larven erhöht werden. Es ist jedoch wichtig, im Auge zu behalten, dass eine erhöhte Temperatur verschiedenen Entwicklungs, physiologischen und molekularen Parametern einschließlich der Wachstumsrate, Entwicklungs Timing, metaboli beeinflusstsm und Genexpression 34-37. Somit Anpassungen an die dafür vorgesehenen Protokolle wie Inszenierung der Larven oder die Anzahl der seziert EAD für Transkriptom Profilierung notwendig wäre.
Die eyFLP-MARCM Tester sind nicht zu den gesündesten Sorten. Die mehreren Transgenen in einem Genom Kompromiss Fitness und Fruchtbarkeit fliegen. Diese Bestände erfordern zusätzliche Aufmerksamkeit für große Sammlungen von jungfräulichen Weibchen gepflegt und erweitert werden. Wie in dieser Studie dokumentiert, Linie der MARCM 82B Grün Tester 11, obwohl lebensfähig , wenn homozygot, ist genetisch instabil. Dies ist offensichtlich aus dem spontanen Auftreten von "Leopard-Larven", die ektopische anzuzeigen, GFP-markierten Klone innerhalb verschiedener polyploid Geweben, einschließlich Darm, Tracheen, Fettkörper und Larven Epidermis. Dieses Phänomen tritt in alle unabhängig von dem väterlichen Erbgut kreuzt. Wir gehen davon aus, dass die ektopische GFP Patches ergeben sich aus unkontrollierten, stochastische Rekombination zwischen den beiden FRT Stellen in der FLP-out Kassette, wodurch die Entfernung des gelben + Marker und der "STOP - Kassette". In den polyploiden Geweben könnte der Tubulin - Promotor getriebene Gal80 Repressor unzureichend sein , um die Gal4 - Aktivität zu blockieren. Das Vorhandensein von genetisch veränderten Zellen in anderen Geweben als dem EAD und Gehirn könnte systemische Signale auslösen, das Verhalten der Versuchs Klone beeinflussen könnten. Diese "Leopard-Larven" sollten daher von Analysen ausgeschlossen werden. Darüber hinaus haben wir routinemäßig Wiederherstellung der MARCM 82B Grün Tester von einzelnen männlichen-weiblichen Kreuze.
Trotz der Gefahren oben erwähnt, sind die Anwendungen des eyFLP-MARCM System Genfunktionen und die Wechselwirkungen zwischen klonalen Tumoren und deren Umgebung zu studieren, sind vielfältig. Die Einführung der Gal4 / UAS-unabhängige binäre Expressionssysteme wie LexA / LexOp 38 oder Drogen steuerbare QF / QUAS / QS 39,40 würde eine genaue Kontrolle über Transgen exp liefernression und / oder gleichzeitige Kennzeichnung und Manipulation von verschiedenen Zellpopulationen einschließlich klonalen, nicht klonalen Epithelzellen und hemocytes. Solche mosaic Gewebe wieder gemäß Protokollen hier beschrieben verarbeitet werden.
Das Verfahren für die Präparation von Mosaik EAD und EAD / Hirn-Komplexe aus dem dritten Larvenstadium (Protokoll Abschnitt 3) kann auch auf früheren Entwicklungsstadien angewendet werden. Wichtig ist, erlaubt das Protokoll für EAD / brain-Komplexe Rückgewinnung der Flügel, haltere und Bein Imaginalscheiben. Sollten diese für die RNA-Isolierung verwendet werden (Protokoll Abschnitte 3.3.2 und 7), sollte die Scheibe des Interesses von Fremdgewebe und verarbeitet ähnlich EAD gereinigt werden. Aufgrund ihrer kleineren Größe, die Anzahl der haltere und Beinscheiben sollten gesammelt erhöht werden ausreichende Menge an RNA zu erwerben.
Das Protokoll für die Extraktion von Gesamt-RNA aus EAD (Protokoll Abschnitt 7) auf Basis der RNA Lysereagenzes erhältlich von verschiedenen kommerziellen vendors (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung). Der Gesamterfolg des Verfahrens in erster Linie abhängig von: (i) eine ausreichende Anzahl von Larven, (ii) ist eine schnelle und präzise , während sezieren, und (iii) Aufbewahrung von Proben frei von RNasen. Halten Sie den Arbeitsbereich und Instrumente sauber, Handschuhe tragen, RNase-freie Plastikwaren und Lösungen mit und halten die Proben auf Eis alle reduzieren RNA-Abbau. Um eine Kontamination der RNA mit einer beliebigen genomischen DNA zu verhindern, die möglicherweise nicht vollständig von der DNase-Behandlung (Protocol Abschnitt 7.11) entfernt werden, ist es entscheidend, Interphase zu vermeiden, wenn die wässrige Phase zum ersten Mal (Protocol Abschnitt 7.6) zu sammeln. Beide DNA - Kontamination und RNA - Abbau kann durch Ausführen Proben auf einem automatisierten Elektrophorese - System (6B, 6C) offenbart werden. Die RNA-Isolierung Protokoll hat eine breitere Anwendung. Es wurde für die RNA-Extraktion aus Voll Larven in verschiedenen Entwicklungsstadien, von Erwachsenen erfolgreich verwendet, und verschiedeneLarvenorgane. Die erhaltene RNA wurde für beide qRT-PCR und genomweite Transkriptom - Analyse von mRNA-seq 20,24,41,42 geeignet. Im Vergleich zu qRT-PCR, die Sequenzierung Zehn ausgewählten mRNAs höchstens unvoreingenommene mRNA quantifiziert ermöglicht genomweite Expressionsanalysen. Somit kann eine gesamte Transkriptom Signaturen von Tumoren vergleichen spezifischen genetischen Läsionen an unterschiedlichen Stadien der Tumorgenese 24 induziert. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, die RNA aus den gesamten Scheiben kommt, so dass die Ergebnisse nicht nur Änderungen in den Klonen widerspiegeln, sondern auch in der umgebenden, nicht-klonalen Gewebe. Zellen - Durchführen fluoreszierendes activate Zellsortierung (FACS) auf dissoziierten mosaic EAD durch verfügbaren Protokolle Anpassung 43,44 konnte Transkriptions Signatur von spezifischen Zellpopulationen, beispielsweise klonalen (GFP +) und nicht-klonale (GFP) zu bestimmen , angewandt werden.
Die Fixierung und Immunofärbungsprotokoll hier beschrieben wird, ist geeignet für die Simultanzeitigen Visualisierung von Proteinen von Interesse mit spezifischen Antikörpern und Aktivität von transgenen Reportern. Sowohl das GFP-Signal durch eine der beiden transgenen Reportern in dieser Studie verwendeten hergestellt klonalen Zellen und DsRed Fluoreszenzmarkierung werden während der Fixierung und Immunfärbung erhalten und kann direkt durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Antikörper gegen die fluoreszierende Proteine können jedoch verstärken die Signalintensität. In ähnlicher Weise die Verwendung eines anti-β-Galactosidase - Antikörper - Nachweis wird transgener Reporter erleichtern auf dem bakteriellen lacZ - Gens basieren. Relative Reporter Aktivitäten kann durch die Messung der relativen Pixelintensitäten von Klonen im Vergleich zu nicht-klonalen Gewebe unter Verwendung von Bildanalysesoftware (zB FiJi, ImageJ) beurteilt werden. Wenn Reporteraktivität Vergleich zwischen verschiedenen klonalen Genotypen, müssen die Bildaufnahmeeinstellungen konstant (Abschnitt 5 und Verweise Protokoll 21,22) gehalten werden. Obwohl das Protokoll funktioniert gut mit vielen verschiedenen einntibodies, kann es notwendig sein, den empfohlenen Antikörperkonzentrationen zu optimieren. Änderungen können auch in Fixierungszeit, Art und Konzentration des Detergens (Triton X-100, Tween-20, Saponin) und Fixierungsmittel (8% PFA, 4% Formaldehyd, EtOH) erforderlich.
Im Gegensatz zu den Protokollen oben diskutiert, Quantifizierung von Tumorinvasions ist mit dem dritten Larvenstadium Larvenstadium und dem EAD / Gehirn-Komplex begrenzt. Trotzdem ihre kann Oberstes Ziel auf alle quantitativen Studien gelten, in denen kognitive Verzerrung vermieden werden muss. Das Verfahren erfordert Gründlichkeit. Als Tumor Malignität mit der Zeit zunimmt, ist es wesentlich , Larven des gleichen Alters zu vergleichen (beispielsweise 7 oder 8 Tage nach der Eiablage). Mit der Zeit kann ein klonalen Tumor massiv überwuchern, aber die Tumorzellen innerhalb des EAD bleiben. Der Schritt, in dem Gehirn vom EAD (Protokoll Abschnitt 4.4.1) getrennt sind, ist daher von entscheidender Bedeutung falsch-positive Invasivität zählt zu vermeiden. Montage der Gehirne mit dem beigefügten EAD wird Flatten die Gewebe, wodurch die überwuchert EAD die Gehirnstrukturen und damit verhindern, dass die Quantifizierung zu decken. Idealerweise würde man gerne die invasive Verfahren direkt in der lebenden Larve zu erfassen. Transgene Reporter die beteiligten Zellpopulationen und Gewebe sichtbar zu machen verfügbar sind, und könnte mit dem eyFLP-MARCM System kombiniert werden. Leider dauert das invasive Verfahren mehrere Stunden bis Tage, einen Zeitrahmen, die mit dem Halten die Larven am Leben, während immer noch nicht kompatibel ist.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
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