Summary
Detta protokoll visar hur man skapar fluorescerande märkt, genetiskt definierade klonala tumörer i Drosophila ögat / antenn imaginal skivor (EAD). Den beskriver hur man dissekera EAD och hjärnan från tredje stadiet larver och hur man behandlar dem att visualisera och kvantifiera genuttryck förändringar och tumörinvasion.
Introduction
Cancer är en av de mest genetiskt heterogen grupp av sjukdomar, vars förekomst och dödligheten ökar dramatiskt, särskilt bland de äldre över hela världen. Cancer härstammar klonalt från en tumör initiera cell som flyr inneboende tumörsuppressor mekanismer och delar utom kontroll. Den gradvisa ackumuleringen av genetiska skador som kooperativt främjar tillväxt, spridning och rörlighet samtidigt hämma död och differentiering omvandlar den initiala godartad överväxt till en mycket malign, metastatisk och dödlig tumör. Det har blivit uppenbart att förutom genetiska förändringar kräver tumörprogression förändringar i den omgivande stroma och överhörning mellan tumörtyper och flera cell (t.ex. fibroblaster, immun och endotelceller) i sin mikromiljö. Att förstå de molekylära principerna malign transformation inklusive tumör stroma interaktioner är av stor betydelse för att utveckla förebyg-tions och tidig screening strategier, samt nya och effektiva behandlingar för att bekämpa cancer metastaser och läkemedelsresistens.
Bananflugan Drosophila melanogaster har blivit ett attraktivt system för cancerforskning 1-4 på grund av dess snabba generationstid, anmärkningsvärt bevarande av signalnoder mellan flugor och människor, begränsad genetisk redundans och rikedom av avancerade genetiska verktyg som underlättar manipulation av nästan varje gen i tillfälligt och spatialt begränsat sätt. Genetiskt definierade tumörer med varierande malignitet kan reproducerbart konstruerad i Drosophila genom att införa GAIN- och förlust av funktionsmutationer i en delmängd av stamceller i en annars vildtyp vävnad med hjälp av MARCM teknik 5. Den MARCM verktyget kombinerar FLP / FRT (FLP rekombinas / FLP Recognition Target) -medierad mitotisk rekombination sex med FLP-out 7 och Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 målgenenexpressionssystem 9. Med denna metod uttryck för någon UAS-baserade transgen, inklusive onkogen eller fluorescerande protein cDNA eller inverterade DNA upprepningar för dsRNA-inducerad geners uttryck, kommer att begränsas till en klon av celler som har förlorat en specifik genetisk lokus och en Gal4 repressor på grund av rekombination (Figur 1A). Klonala fläckar märkta med grönt fluorescerande (GFP) eller röd fluorescerande proteiner (t.ex., RFP, DsRed, mCherry) kan lätt spåras genom hela utvecklingen, isoleras och analyseras. Viktigt, kan deras beteende direkt jämföras med den intilliggande vild vävnadstyp. Således, frågor som är relevanta för cellen autonoma och icke-självständiga effekter av genetiska skador kan enkelt studeras. I likhet med däggdjur, endast kloner där flera onkogena lesioner kombineras bli elakartade i Drosophila och rekapitulera viktiga kännetecken för däggdjur cancer. De overproliferate, undvika apoptos, framkalla inflammation, blir odödlig och invafattande slutligen dödar värden 10-17.
Här beskriver vi ett protokoll för att generera genetiskt definierade klonala tumörer i ögat / antenn och hjärnvävnad av Drosophila larver med hjälp av MARCM teknik. Metoden förlitar sig på en MARCM testare lager som uttrycker jäst FLP rekombinas under kontroll av den eyeless förstärkare (eyFLP) 18,19. På detta sätt, är GFP-märkta kloner genereras i både peripodial och kolumnär epitel av EAD och neuroepitelet av hjärnan under hela embryo- och larvstadier (fig 1A, B och referens 20). Kloner kan lätt följas förrän i vuxen ålder som EAD utvecklas till vuxna öga, antenn och huvudet kapsel medan neuroepithelium ger upphov till neuroblaster som producerar differentierade optiska lob nervceller.
För att underlätta omfattande molekylära, funktionella och fenotypiska karaktärisering av mosaik vävnad, vi deskrivare ett protokoll för dissektion av EAD och hjärnan från tredje stadiet larver och beskriva hur man behandlar dem för tre olika applikationer: (i) detektering av transgena fluorescerande reportrar och immunfärgning, (ii) kvantifiering av tumörinvasion och (iii) analys av genuttryck ändras med hjälp av en kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) eller en hög genomströmning mRNA sekvensering (mRNA-punkter) (Figur 1C).
Immunfärgning protokoll kan användas för att visualisera vilket som helst protein av intresse med en specifik antikropp. Transgena fluorescerande transkriptions reportrar ger bekväm och exakt Spatiotemporal information om aktiviteten hos en viss signalväg. Cell-härstamning specifika reportrar, å andra sidan, speglar kvalitativa och kvantitativa förändringar i cellpopulationer inom mosaik vävnad och bland tumörer i olika genotyper. Kvantifiering av invasiv beteende underlättar jämförelse av tumör malignitet mellan genotyps. Slutligen är det protokoll som beskriver insamling och behandling av mosaik EAD för RNA-isolering lämpar sig för både små och storskaliga tillämpningar nedströms såsom omvänd transkription följt av QRT-PCR och genomet hela mRNA-punkter, respektive. De kvalitativa och kvantitativa data från dessa analyser ger nya insikter i sociala beteende klonala tumörer. Dessutom, de producerar en solid grund för funktionella studier om vilken roll enskilda gener, genetiska nätverk och tumörmikro i olika stadier och aspekter av tumörbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta arbete utnyttjar eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, tub-GAL80 MARCM 82B Grön testare linje 11. Passerar MARCM 82B gröna tester jungfrur till hannar av stammar såsom vikt; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotyp kommer att ge avkomma där mitotiska rekombination sker mellan rätt armar 3 rd homologa kromosomer. På detta sätt, kommer kloner homozygot mutant för gen c beläget distalt om FRT82B site genereras inom EAD och hjärna neuroepitel. Dessa kloner kommer att uttrycka GFP, transgen en och dsRNA för gen B (Figur 1A). Olika eyFLP-marcm tester linjer för rekombination på X, 2L, 2R, 3L och 3R har etablerats och finns inom flugan gemenskap.
1. Fly Handling, Kors, och Staging
- Expandera lämplig MARCM testare lager vid rumstemperatur genom att fylla flera bottles samtidigt. Vänd de vuxna i nya flaskor var 2-3 dagar så att tillräckligt oskulder kan samlas för efterföljande korsningar.
OBS: När samla jungfrur, undvika långvarig exponering för CO2 eftersom det äventyrar kvinnlig fruktsamhet. - Beroende på omfattningen av experimentet, inrätta flyga kors i flaskor med hjälp av åtminstone 10 marcm testare jungfrur och 4 hanar (t.ex. för avbildning av fluorescerande reportrar och immunfärgning) eller i flaskor med åtminstone 30 jungfrur och 10 män (t.ex. för RNA-isolering och kvantifiering invasivt).
- Höj avkomma vid 25 ° C under en lång dag 16 tim / 8 timmar ljus-mörker-cykel. Flip föräldrar i nya flaskor / flaskor varje 24 timmar för att underlätta reproducerbar iscensättning av larver och för att förhindra överbeläggning.
OBS: Från och med dag 6 efter äggläggning (AEL), den sena tredje instar kontroll larver stop utfodring, börjar vandra och ange pupariation. Däremot kan uppkomsten av larver-PUPP övergång vara dela eller obefintlig i larver med EAD bär hyperplastiska eller maligna klonala tumörer.
2. Samla tredje stadiets larver
- För immunfärgning, samla ca 20 sen tredje instar larver (vandra på väggen och de för en jämförbar kroppsstorlek från maten). Använd pincett för att försiktigt plocka larver från flaskan eller flaska och överföra dem till ett embryo glasskål fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- För RNA-isolering och kvantifiering av invasivitet samla åtminstone 80 sen tredje instar larver (vandra på väggen och de för en jämförbar kroppsstorlek från maten). Använd en sprutflaska för att spruta PBS i en fluga flaska innehållande larver tills ytan är täckt.
- Mjuka upp de översta skikten av mat med en spatel och häll maten mäsk innehållande larver i en petriskål. Använd pincett, försiktigt plocka larver och överföra dem till ett embryo glasskål fylld med PBS.
- Tvätta larver med PBS until all resterande mat avlägsnas. Inspektera larver under fluorescerande stereomikroskop med 8 till 16X förstoring för att göra sig av med alla "leopard larver" som bär slump GFP-positiva fläckar i hela larvkroppen (Figur 2A, 2B och se diskussion avsnitt).
OBS: För RNA-isolering innefatta ett näst sista tvättsteg i 70% EtOH under 1 min. - Ställ skålen som innehåller valda larver i PBS på is tills dissekering. Process larver inom 30 minuter för att undvika negativa effekter av kyla och svält.
3. Dissektion av larver
- Att dissekera EAD under ett stereomikroskop, använd en pincett för att försiktigt trycka den mellersta delen av larven mot glasskål botten. Med andra pincett, greppa larver munnen krokar och dra bort från kroppen (figur 2C) dem.
OBS: Dragkraften är ofta tillräckligt för att bryta de optiska stjälkar som förbinder EAD pair till hjärnan lober. Om hjärnan eller dess delar vara kopplad till EAD och deras närvaro inte är önskvärd för ytterligare applikationer, skär de optiska stjälkarna med en hjälp av de två paren av pincett. För invasiva tumörer (t.ex. ras V12 Scrib 1) blir sambandet mellan EAD och hjärnlober allt fördunklas med tiden genom igenväxning och migrera klonala celler.- För att förbereda EAD / hjärnan komplex med en intakt ventrala nerv sladd (VNC) (Figur 2D), använder pincett för att skära en larv i mitten av kroppen. Kassera den bakre halvan.
- Håll den främre halvan av larvkroppen mellan tips av en pincett, vända larven inifrån och ut genom att trycka i munnen krokar med spetsen på den andra pincett och genom att rulla nagelbanden över den med den första pincett paret.
- Använd pincett försiktigt bort alla yttre vävnader (t.ex. spottkörtlar, feta kropp, och tarm) medan EAD paret ellerEAD / hjärna komplex ansluten till munnen krokar. Skilja munnen krokar från den överliggande nagelbanden. Frigör VNC genom att bryta de axonal prognoser som sträcker sig till kroppens muskler och epidermis (Figur 1B, 2C, 2D).
OBS! Munnen krokar möjliggöra säker hantering av vävnad med pincett och underlätta effektivare sjunkande och lätt erkännande av vävnad under tvättning. Dissekeras EAD förändring morfologi relativt snabbt när de hålls upptaget i PBS. Begränsa dissekering tid till 20-30 min. - För att överföra vävnaden, belägga en P20 mikropipett spets genom att pipettera den återstående kroppen för kropp flera gånger upp och ner. För att överföra större EAD / hjärn komplex, skär P20 mikropipett spets med en sax.
OBS: Beläggningsproceduren är avgörande för att förhindra stickning och förlust av dissekerade vävnad under överföringen. Användning av en P20 mikropipett minimerar överföringen av PBS i fixeringslösning, vilket begränsar oönskad utspädning.- För immunfärgning, överföradissekerade EAD in i ett 0,5 ml rör fyllt med 400 | il 4% paraformaldehyd (PFA) fixativ. Använd 1,5 ml rör med en ml PFA för större EAD / hjärnkomplex avsett för poängsättning invasivt.
VARNING: PFA är mycket giftigt. Skyddshandskar och kläder. Undvik kontakt med hud, ögon och slemhinnor. - För RNA-isolering överföra dissekeras EAD i en ny glasskål fylld med kall PBS. Använd pincett för att rengöra EAD från ringen och lymfkörtlar, för att minimera prov föroreningar.
- Lossa EAD från munnen krokar genom att bryta sambandet mellan antenn skivor och munnen krokar med hjälp av pincett (Figur 2E). För att undvika RNA nedbrytning och genuttryck artefakter, begränsa dissekering tid till 30 minuter. Gå vidare till steg 7.
OBS: En erfaren forskare kan dissekera cirka 60 larver i 30 minuter exklusive tid som behövs för larver insamling och tvätt. Totalt RNA avkastningen beror på EAD storlek som varierar mellan genotyper och developmental steg. Dissekering av 80-100 kontroll EAD par från slutet av tredje stadiet larver bör ge 5-8 mikrogram totalt RNA.
- För immunfärgning, överföradissekerade EAD in i ett 0,5 ml rör fyllt med 400 | il 4% paraformaldehyd (PFA) fixativ. Använd 1,5 ml rör med en ml PFA för större EAD / hjärnkomplex avsett för poängsättning invasivt.
4. Fastställande, immunfärgning, och Montering
- Fix prover i PFA fixativ i 25 min medan nuterande vid rumstemperatur. Fixeringen kan förlängas upp till 60 minuter utan att ändra vävnad morfologi och antigeniciteten hos proteiner.
- Avlägsna fixativet och tvätta prover med PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) tre gånger i 10 min med användning av en nutator. Använd tillräcklig volym av PBST för varje tvättsteg (400 ul / 0,5 ml rör).
OBS: Fast EAD / hjärnkomplex avsett för poängsättning invasivt kräver inte immunfärgning. GFP signalen förblir väl synlig efter fixering. Gå vidare till steg 4,4 för slut dissekering.- För immunfärgning, blockera vävnad i 200 pl av en blockeringslösning (PBST med 0,3% BSA) under 20 min med försiktig omrörning vid rumstemperatur.
- Inkubera med primary antikroppar späddes i 100 pl av en blockeringslösning över natten vid 4 ° C under försiktig skakning. Se primär antikropp datablad eller publicerad litteratur för rekommenderad antikroppsutspädning.
OBS: Den primära antikroppen spädning kan behöva optimeras. - Efter fem 10 minuterstvättar i PBST, fläck vävnad med de fluorescerande sekundära antikroppar utspädda i blockeringslösning under försiktig skakning under 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta prover tre gånger 10 min i PBST.
- Inkubera med primary antikroppar späddes i 100 pl av en blockeringslösning över natten vid 4 ° C under försiktig skakning. Se primär antikropp datablad eller publicerad litteratur för rekommenderad antikroppsutspädning.
- För immunfärgning, blockera vävnad i 200 pl av en blockeringslösning (PBST med 0,3% BSA) under 20 min med försiktig omrörning vid rumstemperatur.
- Ersätt PBST med 500 pl DAPI-färglösningen. Att märka F-aktin, lägga phalloidin konjugerat till ett fluorescerande färgämne DAPI-färglösningen. Efter 15 min nutation i mörker, tvätta vävnad en gång i 10 min med PBST.
OBS: F-aktin märkning kan utföras oberoende av DAPI-färgning. - För slut dissektion steg överföra vävnad tillbaka till en PBS-fylld glasskål med hjälp av en 1 ml piPette. Med hjälp av två par pincett klipp av munnen krokar.
- Separera hjärnan som kommer att användas för kvantifiering invasivt från EAD genom att skära den optiska stjälk som vuxen EAD kan hämma analysen.
- Placera en droppe monteringsmedium (15 | il för en 22 mm x 22 mm täckglas) på en objektiv bild. Med hjälp av tång tips, distribuera mediet i ett tunt skikt. Överför EAD, hjärna eller EAD / hjärnan komplex i monteringsmedium med en P20 mikropipett.
- Använd pincett tips eller en volframstav att fördela vävnad och räta VNC på bilden.
- För att undvika bildning av bubblor medan montering, första berörings en kant av en täck till monteringsmedium och sedan långsamt lägre på monteringsmedium med hjälp av pincett. Använd små bitar av filterpapper eller vävnad torka för att absorbera Överflödigt monteringsmedium runt täck kanterna.
OBS: DABCO / Poly (vinylalkohol) 4-88 monteringsmedium hårdnarvid 4 ° C inom en timme. Diabilder kan lagras i månader vid 4 ° C.
5. Confocal avbildning
- Förvärva enskilda konfokala sektioner och staplar med hjälp av en konfokalmikroskop utrustad med 20X, 40X och 60X olje mål.
- Förhindra pixel mättnad. Använd samma bildupptagningsparametrar, inklusive bildupplösning, laser ineffekt, förstärkning, offset, ram medelvärdes, en stegstorlek i en z-serie och behålla dessa inställningar för alla genotyper för att möjliggöra jämförelser av pixel intensiteter mellan olika genotyper 21,22.
OBS: För visualisering av EAD / hjärnkomplexet, generera maximal projektioner och sy respektive, grann bilder. För slutliga bilden beredning, använd post bildbehandlingsprogram för panelanordningen och för att justera ljusstyrka och kontrast.
6. Kvantifiering av Tumör invasivitet
- Definiera ett poängsystem som kommer att prägla de olika nivåerna i tumör invasiveness väger den rumsliga mönstret av invasion och mängden GFP-positiva celler sprids in i hjärnan och VNC. Förbered utvärderingsblanketter för dokumentation (figur 3A).
- Montera minst 80 fast intakta hjärnor för varje genotyp på en bild med hjälp av 40 pl av monteringsmedium per 24 mm x 50 mm täckglas.
- För att möjliggöra opartisk poäng, be en neutral part anonymisera bilderna, så att poängberäkningen är opartisk. Utvärdera anonym glider genom att oberoende två lab medlemmar. Avslöja genotyper förrän räkningen är klar.
- Utvärdera graden av malignitet av en blind poängsättning av monterade hjärnor under ett fluorescerande stereomikroskop utrustad med en GFP filter set. Använd en markör för att märka hjärnor som redan har tittade för att undvika dubbelräkning (Figur 3B).
- Beräkna procentandelen av hjärnor faller in var och en av de definierade invasiva kategorier per genotyp. Bestäm statistiska significance användning av en chi-kvadrat-test (figur 3C).
7. RNA-isolering, DNas behandling och kvalitetskontroll
OBS: Alla reagens (lösningar, plastartiklar) används i följande steg bör vara fria från RNas aktivitet. Alltid bära handskar och använda en kemisk huva för arbete med organiska lösningsmedel.
- Överför ren EAD med en belagd P20 mikropipett spets i 1,5 ml rör.
- Låt vävnad sjunker till botten av röret, försiktigt bort PBS och ersätta det med 100 pl RNA lysisreagens (tillräckligt för upp till 140 EAD).
- Lyse vävnad genom virvling. Vid denna punkt, kan proven vara djupfrysta i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C eller bearbetas direkt med en standard RNA isolering protokoll.
OBS: Prover av liknande genotyper från flera dissektion rundor kan slås samman en gång i RNA lysisreagens. - Fyll provvolymen till 0,9 ml med RNA-lyseringsreagens. Tillsätt 0,2 ml kloroform och blanda prover vigorously för 15-20 sek.
- Efter 2 till 3 min inkubation vid rumstemperatur, centrifugera proverna vid 10000 x g under 15 min vid 4 ° C.
- Överföra färglös övre vattenfas innehållande RNA till ett nytt rör utan att störa interfasen. Håll dig borta från inter eftersom det innehåller proteiner och genomisk DNA.
OBS: Den återvunna volymen bör vara ca 60% av volymen av RNA lysisreagens användes för homogenisering. - Fälla ut RNA genom att tillsätta 0,5 ml isopropylalkohol. Vortexa och inkubera proverna vid rumstemperatur i 10 min.
- Centrifugera proverna vid 10.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och tvätta RNA-pelleten en gång med 600 | il av 75% etanol. Efter en kort vortex och centrifugering (10.000 x g under 7 min vid 4 ° C) kassera all etanol och låt RNA-pelleten lufttorka under 5-10 min placera det öppna röret på en ren vävnad torka.
OBS: RNA-pelleten kan synas som en liten ogenomskinlig / vit stmogna vid botten av röret eller osynliga. De återstående etanol droppar kan avlägsnas försiktigt med P10 mikropipett spets. - Upplösa RNA i 50 | il DEPC-behandlat vatten genom att vortexa eller passerar lösningen några gånger genom en pipettspets.
- För att minimera kontaminering med genomiskt DNA, behandla totalt RNA med DNas genom att tillsätta 50 ul av en blandning innehållande 1 pl av DNas (2 U / pl) och 10 pl 10x DNas-buffert i DEPC-behandlat vatten. Vortex och spinn ner.
- Inkubera proverna vid 37 ° C i ett vattenbad eller ett värmeblock under 30 till 40 min. Efter inkubering tillsätt 100 | il DEPC-behandlat vatten i varje prov.
- För att inaktivera den enzymatiska aktiviteten och rena RNA från DNas, tillsätt 200 | il fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) lösning, vortex under 1 min och centrifugera proverna vid 10000 x g under 7 min vid 4 ° C.
- Försiktigt överföra den övre vattenfasen innehållande RNA till ett nytt rör. Lägg lika stor volym (200 pl)kloroform, blanda och upprepa centrifugeringssteget från ovan.
- Samla noggrant den övre fasen och utfällning av RNA genom att tillsätta 1/10 volym av 3 M natriumacetat, pH 5,2 framställd i DEPC H2O och 2,5 volymer 100% etanol. Blanda noggrant genom att vortexa.
OBS: Lägga 0,5 l glykogen (20 mikrogram / l) till en fällningsblandning hjälper till att visualisera RNA-pelleten. För att minimera RNA förlust, använda silikon, låg bindning 1,5 ml mikrocentrifugrör. - Fälla ut RNA vid -20 ° C under minst en timme.
OBS: Inkubationen kan utföras över natten. Prover kan placeras vid -80 ° C samt. - Pellet RNA genom centrifugering vid 10.000 xg under 30 min vid 4 ° C. Tvätta och torka pellets efter beskrivningen i 7.9.
- Lös RNA i 10-15 pl DEPC-behandlat vatten. Store RNA vid -80 ° C.
- Bestämma mängd och renhet av RNA genom att mäta OD vid 230 nm, 260 nm och 280 nm med användning av en spektrofotometer. Beräkna RNA concentration genom att tillämpa konventionen att ett OD vid 260 nm är lika med 40 mikrogram / ml RNA.
OBS: En 260/280-förhållande av "ren" RNA är lika med 2,0, medan en A 260/230 förhållandet skall vara i intervallet 2,0 till 2,2. RNA-prover med en A 260/280 förhållandet mellan 1,7 och 2,0 är lämpliga för tillämpningar efter t.ex. cDNA-syntes. För beredning av mRNA-punkter bibliotek bör kontrolleras kvaliteten och kvantiteten av RNA med hjälp av ett automatiserat elektroforessystem. 28S / 18S förhållandet bör vara över 1,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa potentialen för eyFLP-MARCM teknik för att generera GFP-märkt fläckar av definierade genotyper i Drosophila EAD, var tre typer av kloner inducerade: (1) kontroll uttrycker GFP enbart (2) maligna tumörer som uttrycker en onkogen form av små G-protein Ras (Ras V12) i en bakgrund av homozygot förlust av en tumörsuppressorgen klotter (Scrib 1), och (3) igenväxning men icke-invasiv ras-V12 Scrib en JNK DN-kloner, där juni-N-terminal-kinas (JNK) inaktiverades genom uttryck av sin dominerande-negativa formen (Figur 4, Tabell 1 för genotyper). Det har visat sig att invasions av ras V12 Scrib 1 klonala tumörer kräver avvikande aktivering av JNK signalering och dess nedströms transkriptionsfaktorer 10,12,23,24. Dessutom ras V12 Scrib en Drosophila larv, vilket resulterar i infiltrering av immunceller (så kallade hemocyter) i EAD 14,25.
Att övervaka nivåer och geografiska fördelningen av JNK-aktivitet inom mosaik vävnad och bland tumörer i olika genotyper, den etablerade transgena, var JNK-responsiv TRE-DsRed reporter anställda 26. Konfokalmikroskopi av dissekeras, fast EAD och EAD / hjärn komplex avslöjade markant uppreglering av TRE-DsRed reporteraktivitet i vävnaderna som bär maligna ras V12 Scrib 1 tumörer (Figur 4B). Den DsRed signal märkta ras-V12 Scrib 1 kloner i EAD (Figur 4B) såväl som tumörceller sprids över hjärnan lober och invaderande VNC (Figur 4E, 4F). I motsats härtill TRE-DsRed reporter activity förblev begränsat till en sträng av celler som sträcker sig från antennal till ögat del av styrskivorna (Figur 4A). Blockering JNK signalresulterade i en dramatisk minskning av TRE-DsRed signal i klon ras V12 Scrib 1 JNK DN tumörer (Figur 4C, 4D). Dessa data ger sålunda funktionellt bevis för ett krav på JNK signal att aktivera TRE-beroende transkriptionell respons i maligna ras V12 Scrib 1 tumörer. En härstamning specifik hmlΔ-DsRed reporter, devised för spårning Drosophila hemocyter 27,28 visade en ackumulering av immunceller i vävnader som bär maligna ras-V12 Scrib 1-tumörer (figur 5B). Däremot var det bara enskilda hemocyter eller några lokala hemocyte fläckar upptäcktes i kontroll och ras V12 Scrib en JNK DN mosaik EAD och hjärnvävnad(Figur 5A, 5C). Immunfärgning med en pan-hemocyte anti-Hemese antikropp (H2) 29 bekräftade immunceller identitet hmlΔ-dsRed positiva celler (Figur 5D, 5E). I överensstämmelse med publicerade rapporter 12,23,24, opartisk kvantifiering av tumörinvasions bekräftade en central roll JNK signal främja tumörinvasion i intilliggande hjärnlober och VNC (Figur 3C). Slutligen isolerades totalt RNA från mosaik EAD. Prover utsattes antingen QRT-PCR eller analyseras på ett automatiserat elektroforessystem för kvalitet och kvantitet. Figur 6A visar betydande JNK beroende uppreglering av matrix metalloproteinas en (MMP1) transkript i EAD bärande maligna ras V12 Scrib 1 klonala tumörer, vilket bekräftar den tidigare offentliggjorda resultat 12,24,30,31. Bedömning av totalt RNA med hjälp av ett automatiserat elektroforessystem visade thatt tre oberoende EAD proven hade en 28S / 18S förhållande över 1,8 (Figur 6B). Men EAD två RNA var delvis nedbrutet, reflekteras av ett cellprov på gelén (figur 6C). I kontrast, EAD tre prov hade en låg koncentration. Multipla band med högre molekylvikt på gel bild (figur 6B) och små toppar på elektroferogram (Figur 6C), föreslog också DNA-kontaminering. Sålunda skulle endast EAD ett prov vara lämpliga för en beredning av mRNA-punkter bibliotek.
Figur 1: Schema för MARCM system för generering av genetiska mosaiker i Drosophila EAD och tillämpningar efter (A) Den MARCM systemet möjliggör generering av klonala patchar med definierade genetiska lesioner i en annars vildtyp (heterozygot).sammanhang. Uttrycket av FLP under kontroll av en vävnadsspecifik promotor (t.ex., eyeless) katalyserar rekombination mellan de båda FRT-element som flankerar STOP kassetten markerad med en gul (Y) genen (akt> y +> Gal4). Vid avlägsnande av STOP kassetten, den ubiquitously uttryckt Gal4 transkriptionsaktivator (akt-Gal4) kan driva uttryck av någon UAS baserade transgen såsom UAS-GFP (även UAS-ras-V12). I en modercell, emellertid den Gal4-aktivitet blockeras av en GAL80 repressor vars uttryck styrs av en tubulin-promotor (tub-GAL80). I G2-fasen av cellcykeln, FLP medierar utbytet av de icke-systerkromatider mellan de homologa kromosomer distalt om FRT-ställen. Segregeringen av de rekombinanta kromosomer under mitos kommer att ge upphov till två dotterceller, varav ett är homozygot mutant för en viss genomisk locus (t.ex. Scrib
Figur 2: Sortering av tredje stadiet larver och representativa exempel på EAD och EAD / hjärnkomplex som används för olika tillämpningar nedströms (AB) Fluorescerande mikrofotografier av tredje stadiet larver lagerkontroll GFP-märkta kloner induceras med eyFLP-MARCM 82B Grön testare.. (A) representant kontroll larv med kloner begränsade till EAD och hjärnlober. (B) Ett exempel på en "leopard larv" bär GFP-positiva kloner i olika vävnader i hela kroppen. (C) Bright bilder av dissekeras EAD och (D) EAD / hjärnkomplex kopplade till munnen krokar, och (E) EAD rengöras från alla främmande vävnad inklusive munnen krokar. Skalstrecken = 2 mm (AB) och 500 m (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Kvantifiering av tumörinvasions (A) Fluorescerande konfokala bilder av hjärnor dissekerades från ras V12 Scrib en larver (7 dagar AEL) representerar de verkliga exempel på de fyra olika kvaliteter av tumörinvasions sträcker sig från icke-invasiv (score 0), en hjärna lob invaderade (Betyg 1), båda hjärnlober invaderade (poäng 2) till en stark tumörinvasion med klon vävnad som täcker båda hjärnlober och ange VNC (Betyg 3). Bilder är projektioner av flera konfokala sektioner och exempel för Score 2 och 3 sys från 2 x 2 konfokala bilder. Skalstrecken = 100 um. (B) Ett exempel på en anonyma objektglas med fasta hjärnor används för objektivscoring under ett fluorescerande stereomikroskop. Gjorda hjärnor är markerade med en penna för att förhindra dubbletter registrering. Skalstreck = 500 m (C) Jämfört med mycket invasiva ras V12 Scrib 1 tumörer, hämning av JNK signal (ras V12 Scrib en JNK DN) elimineras invasion av klonade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Aktivering av transkriptions TRE-DsRed reporter i maligna ras "V12" Scrib "1 klonala tumörer är JNK-beroende (A. TRE-DsRed reporter märkt en smal remsa av celler som löper från antenn till ögon del (pilspetsar). (B) Aktiviteten hos TRE-DsRed reporter markant förbättras i ras-V12 Scrib 1 GFP-positiva kloner jämfört med det omgivande icke-klonal EAD epitel. (C) Hämning av JNK-aktivitet resulterade i en klar minskning av DsRed signalintensiteten i ras V12 Scrib en JNK DN-kloner. (D) Ytterligare förstärkning av DsRed signalen visade icke-självständiga aktivering av JNK signalering i celler som omger ras V12 Scrib en JNK DN-kloner. (E) På dag 8 AEL, ras V12 Scrib 1 celler växte över hela EAD och sprids över hjärnan lober till VNC (pilen). (F) De klonala celler invaderar VNC (närbild av området marked av pilen i E) anrikades för DsRed signalen. (AC) Visa projektioner av flera konfokala sektioner, (E) sys från 3x3 konfokala bilder och (D, F) representerar enda avsnitt. Skalstrecken = 50 | im. EAD, ögon / antenn skiva; BL, hjärna lob; VNC, ventrala nerv sladd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Lineage specifika hml Δ -DsRed transgen reporter avslöjar anrikning av ras-V12 Scrib ett tumörassocierat hemocyter (A) I regler EAD, hmlΔ-DsRed reportermärkt hemocyte clu hyllor är fångade i inbuktningarna på ögat och antennal epitel. (B) EAD och hjärnvävnad består av ras-V12 Scrib 1 GFP-märkta tumörerna uppvisade ett ökat antal hemocyter utspridda över hela den klonala vävnaden. (C) Antalet associerade hemocyter minskat dramatiskt på hämning av JNK signalering i ras V12 Scrib en JNK DN mosaik vävnad. (DE) HmlΔ-dsRed positiva hemocyter också märkt med en H2-antikropp som detekterar den pan-hemocyte markör Hemese. (AC) Visa projektioner av flera konfokala sektioner (A) är sydda från 2 x 2 och (BC) sys från 3 x 3 konfokala bilder. (DE) Föreställ enskilda sektionerna. Skalstrecken = 100 pm (AC) och 10 mikrometer (DE). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:.. Utvärdering av kvantitet och kvalitet av totalt RNA isolerat från dissekerade EAD (A) Ett representativt exempel på QRT-PCR-resultat med fyra biologiska replikat för varje genotyp MMP1 transkriptnivåer normaliserades till rp49. Vika förändringar i genuttryck beräknades med användning av den relativa standardkurvan metod 32. Data är medelvärden ± SEM; *** P <0,001 med användning av Students oparade två-tailed t-test med olika varians. (B, C) Bedömning av totalt RNA kvalitet och kvantitet med användning av ett automatiserat elektroforessystem. Den virtuella gel bild (B) visar de två framträdande band av 18S och 28S rRNA som motsvarar väl definierade toppar på elektroferogram (C). DNA kontaminering och RNA-degradering reflekteras av såMear (pilspetsar) och extranumerary band och toppar (pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fly Stammar | Källa / Kommentarer |
| eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, tub-GAL80 | eyFLP-MARCM 82B Grön Tester 11 |
| w; UAS-ras V12; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; UAS-ras V12; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | denna studie, w; hmlΔ-DsRed från Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | den här studien |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | den här studien |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | denna studie, w; TRE-DsRed från Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | den här studien |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | den här studien |
Tabell 1: Sammanfattning av Drosophila-linjer som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikerna för att generera genetiska mosaiker i Drosophila är bland de mest sofistikerade verktyg för att analysera och manipulera geners funktion 33. Den eyFLP-MARCM systemet har visat stark och robust eftersom den tillåter induktion av visuellt markerade genetiskt definierade kloner i ett rumsligt begränsat sätt, det vill säga i vävnader där eyeless förstärkare är aktiv 9,18. Detta är särskilt viktigt när flera genetiska skador kombineras i samma celler. Även dessa mycket avvikande fläckar tillåter larvutveckling när de begränsas till EAD och hjärnan neuroepithelia, kan de orsaka dödlighet när utspridda i larvkroppen som i fallet med värmechock-kontrollerade FLP (hsFLP) kloner. Betecknande nog induktion av kloner i farten EAD epitel där aktiverade onkogener kombineras med förlust av tumörundertryckare rekapitulerar uppkomsten och utvecklingen av fasta epiteltumörer i vissa humana cancerformer. hoWever, har systemet också dess begränsningar som kommer att kortfattat diskuteras. Med tanke på att insekter har ett öppet cirkulationssystemet, gör riktiga metastaser som observerats i humana cancrar uppstår inte. Därför den komplexa processen av metastaserad spridning inte kan troget modelleras i Drosophila. Ändå EAD tumörer såsom ras V12 Scrib 1 kloner göra visa maligna egenskaper när de bryter ner den basala membran som omger EAD och invadera intilliggande hjärnan 11,12,31. Graden av tumör aggressivitet kan kvantifieras och jämförs mellan olika genotyper som beskrivits i denna studie. Det är också viktigt att notera att förekomsten av specifika genetiska skador i mosaik EAD kan påverka utvecklings tidpunkt och varaktighet för larvtillväxt. Iscensättning av larver kommer att avgöra om analys av mosaik vävnad kommer att ske med hjälp av djur av samma kronologiska eller utvecklingsstadium. Utföra en pilot experiment för att bedöma effekterna av enny EAD klon genotyp på utvecklings timing är önskvärd.
Det finns tekniska begränsningar också. För det första är antalet olika klonala genotyper som kan byggas med eyFLP-MARCM verktyg bra men inte oändlig. Till exempel, är en kombination av två muterade alleler som ligger på olika kromosomer hindras av låg effektivitet av rekombination på båda kromosomerna samtidigt och gener lokaliserade på den lilla fjärde kromosomen är generellt otillgängliga. Gene knockdown genom att använda transgena RNAi är en alternativ lösning. Det är dock viktigt att inse att transgener inte uttrycks omedelbart vid mitotisk rekombination - inte förrän GAL80 repressorn försämras. Aktiviteten av Gal4 / UAS expressionssystem kan förbättras genom att odla larver vid 29 ° C. Det är dock viktigt att komma ihåg att förhöjd temperatur påverkar olika utvecklings, fysiologiska och molekylära parametrar, bland annat tillväxt, utvecklings timing, Metabolism och genuttryck 34-37. Således skulle anpassningar till den angivna protokoll såsom iscensättning av larverna eller antalet dissekeras EAD för transkriptom profilering vara nödvändig.
De eyFLP-marcm testare är inte bland de mest hälsosamma stammar. De multipla transgener i en genomet kompromiss flyga kondition och fruktsamhet. Dessa lager kräver extra uppmärksamhet skall upprätthållas och utökas för stora samlingar av jungfru honor. Vilket framgår av denna studie MARCM 82B Grön testare linje 11, även om livskraftiga när homozygota är genetiskt instabil. Detta är uppenbart från den spontana uppkomsten av "leopard larver" som visar ektopisk, GFP-märkta kloner inom olika polyploida vävnader inkluderande tarmen, tracheae, fett kroppen, och larvhuden. Detta fenomen inträffar i alla korsar oberoende av den faderliga genotyp. Vi förutsätter att de ektopisk GFP fläckar resultatet av okontrollerad, stokastisk rekombination mellan de två FRT platser i FLP-out kassett, som orsakar avlägsnande av den gula + markör och "STOP kassett". I polyploida vävnader, kanske tubulin promotor drivna GAL80 repressor vara otillräcklig för att blockera Gal4 aktivitet. Förekomsten av genetiskt modifierade celler i andra vävnader än EAD och hjärnan kan framkalla systemiska signaler som kan påverka beteendet hos de experimentella kloner. Dessa "leopard larver" bör därför undantas från analyser. Dessutom, vi rutinmässigt återupprätta MARCM 82B Grön testare från enskilda män och kvinnor kors.
Trots de fallgropar som nämnts ovan, de tillämpningar av eyFLP-MARCM system för att studera genfunktioner och samspelet mellan klon tumörer och deras omgivning är många. Införande av GAL4 / UAS oberoende binär expressionssystem såsom LexA / LexOp 38 eller läkemedel kontrollerbar QF / Quas / QS 39,40 skulle ge en fin kontroll över transgen expression och / eller samtidig märkning och manipulation av olika cellpopulationer, inklusive klonala, icke-klon epitelceller och hemocyter. Sådana mosaik vävnader kan återigen bearbetas enligt protokoll som beskrivs här.
Metoden för dissektion av mosaik EAD och EAD / hjärn komplex från tredje stadiet larver (protokoll avsnitt 3) kan tillämpas på tidigare utvecklingsstadier samt. Viktigt är protokollet för EAD / hjärn komplex medger indrivning av ving, haltere och ben imaginal skivor. Skulle dessa användas för RNA-isolering (Protokoll avsnitt 3.3.2 och 7), bör skivan av intresse renas från främmande vävnad och behandlas på samma sätt som EAD. Med tanke på deras mindre storlek, bör ökas antalet haltere och ben skivor samlas in för att förvärva tillräcklig mängd RNA.
Protokollet för extraktion av totalt RNA från EAD (protokollenheten 7) är baserad på RNA lyseringsreagenset tillgängliga från olika kommersiella vendors (se lista över material / utrustning). Den totala framgången för förfarandet beror huvudsakligen på: (i) har tillräckligt antal larver, (ii) är snabb och exakt samtidigt dissekera, och (iii) att hålla proverna hålls fria från RNaser. Att hålla arbetsutrymmet och instrument rena, handskar, med hjälp av RNas-fri plast ware och lösningar, och hålla prover på is alla minska RNA nedbrytning. För att förhindra kontaminering av RNA med någon genomiskt DNA som kanske inte helt avlägsnas genom DNas behandling (protokoll avsnitt 7.11), är det viktigt att undvika inter när du hämtar vattenfasen för första gången (protokoll avsnitt 7.6). Både DNA kontaminering och RNA-degradering kan avslöjas genom att köra prover på en automatiserad elektroforessystem (figur 6B, 6C). RNA isolering protokoll har en bredare tillämpning. Det har med framgång använts för RNA-extraktion från hela larver i olika utvecklingsstadier, från vuxna, och olikalarver organ. Den erhållna RNA var lämplig för både QRT-PCR och genomet hela transkriptom analys av mRNA-punkter 20,24,41,42. Jämfört med QRT-PCR som kvantifierar tiotals utvalda mRNA högst medger opartisk mRNA sekvense genomet omfattande uttryck analyser. Således kan man jämföra hela transkriptom signaturer av tumörer inducerade av specifika genetiska skador vid olika stadier av tumörbildning 24. Det är viktigt att komma ihåg att RNA kommer från hela skivor, så att resultaten inte bara kommer att spegla förändringar i klonerna utan även i det omgivande, icke-klonal vävnad. Utföra fluorescerande aktivera cellsortering (FACS) på dissocierade mosaik EAD genom att anpassa tillgängliga protokoll 43,44 skulle kunna tillämpas för att bestämma transkriptionstecknandet av specifika cellpopulationer, t.ex. klonal (GFP +) och icke-klonal (GFP -) celler.
Fixeringen och immunfärgning protokoll som beskrivs här lämpar sig för simultaneous visualisering av proteiner av intresse med specifika antikroppar och aktivitet hos transgena reportrar. Både GFP-signal märkning klonala celler och DsRed fluorescens som produceras av någon av de två transgena reportrar används i denna studie är bevarade i hela fixering och immunfärgning och kan visualiseras direkt genom konfokal mikroskopi. Emellertid kan antikroppar mot de fluorescerande proteinerna förstärka signalen intensitet. På liknande sätt kommer användning av en anti-β-galaktosidas-antikropp underlätta detektering av transgena reportrar baserade på den bakteriella lacZ-genen. Relativa reporteraktiviteter kan bedömas genom att mäta den relativa pixelintensiteterna kloner jämfört med icke-klonal vävnad med hjälp av bildanalysmjukvara (t.ex., Fiji, ImageJ). När man jämför reporteraktivitet mellan olika klonala genotyper, måste bildupptagnings inställningar hållas konstant (protokoll avsnitt 5 och referenser 21,22). Även om protokollet fungerar bra med många olika antibodies, kan det vara nödvändigt att optimera rekommenderade antikroppskoncentrationer. Förändringar kan också krävas i fixeringstiden, typen och koncentrationen av detergent (Triton X-100, Tween-20, saponin) och fixativ (8% PFA, 4% formaldehyd, EtOH).
Till skillnad från protokollen som diskuterats ovan, är begränsad till den tredje INSTAR larvstadiet och EAD / hjärna komplex kvantifiering av tumörinvasions. Ändå kan det övergripande syftet gälla några kvantitativa studier där kognitiv bias måste undvikas. Metoden kräver noggrannhet. Som tumör malignitet ökningar i tid, är det viktigt att jämföra larver av samma ålder (t.ex. 7 eller 8 dagar efter äggläggningen). Med tiden en klonal tumör kan växa över kraftigt, men tumörcellerna kan förbli inom EAD. Steget där hjärnor separeras från EAD (protokollet avsnitt 4.4.1) är därför avgörande för att undvika falskt positiva invasivt räknas. Montering av hjärnor med bifogade EAD kommer flattsv vävnader, vilket gör att igenvuxna EAD för att täcka hjärnstrukturer och därmed förhindra kvantifiering. Helst skulle man vilja fånga invasiva processen direkt i vardags larv. Transgena reportrar för att visualisera de inblandade cellpopulationer och vävnader finns tillgängliga och skulle kunna kombineras med den eyFLP-MARCM systemet. Tyvärr tar den invasiva processen flera timmar till dagar, en tidsram som är förenlig med att hålla larver lever samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
