Summary
Этот протокол показывает , как генерировать флуоресцентно помечены, генетически определенные клоновых опухоли в Drosophila глаз / усиков имагинальных дисков (EAD). Он описывает, как препарировать EAD и мозг от личинок третьей возрастной стадии и как обрабатывать их для визуализации и количественной оценки изменений экспрессии генов и опухоли инвазивность.
Introduction
Рак является одной из наиболее генетически гетерогенная группа заболеваний, чья заболеваемость и смертность резко возрастает, особенно среди пожилых людей во всем мире. Рак берет свое начало от клонированных опухолевой клетки, инициирующие, что ускользает от механизмов супрессии опухолей и присущая разделяющей из-под контроля. Постепенное накопление генетических повреждений, которые совместно способствуют росту, пролиферации и моторику, предотвращая смерть и дифференцировку преобразует исходную доброкачественное разрастание в высоко злокачественную, метастатической и смертельной опухоли. Стало очевидным , что в дополнение к генетических изменений, прогрессирование опухоли требует изменений в окружающей стромы и перекрестных помех между типами опухолей и множественной клеток (например, фибробласты, иммунных и эндотелиальных клеток) в своей микросреде. Понимание молекулярных принципов, лежащих в основе злокачественной трансформации, включая опухоли стромы взаимодействий имеет большое значение для развития предупреждеТион и раннего скрининга стратегии, а также новые и эффективные методы лечения для борьбы с метастазирования рака и лекарственной устойчивости.
Плодовой мушки дрозофилы стала привлекательной системой для исследования рака 1-4 в связи с его быстрым временем поколения, замечательное сохранение сигнальных узлов между мух и людей, ограниченной генетической избыточности и богатства передовых генетических инструментов , которые облегчают манипуляции практически любого гена в временно и пространственно ограниченным способом. Генетически определенные опухоли различной злокачественной опухоли могут быть воспроизводимо инженерии в дрозофилы путем введения амплитудно и с потерей функции мутации в субпопуляции клеток - предшественников в противном случае дикого типа ткани с использованием метода MARCM 5. Инструмент MARCM сочетает в себе ФЛП / FRT (ФЛП рекомбиназа / ФЛП распознавание цели) -опосредованной митотической рекомбинации 6 с FLP-аута 7 и Gal4 / UAS (Upstream активации последовательности) 8 гена - мишенисистемы экспрессии 9. С помощью этого метода экспрессии любого UAS на основе трансгенов, включая онкогена или флуоресцентный белок кДНК или инвертированные повторы ДНК для дцРНК-индуцированной молчанием генов, будет ограничено клон клеток, которые потеряли определенный генетический локус и репрессор Gal4 в результате рекомбинации (Рисунок 1А). Клональный пятна , отмеченные зеленым флуоресцентным (GFP) или красный флуоресцентные белки (например, RFP, DsRed, mCherry) может быть легко отслеживаться на протяжении развития, выделяли и анализировали. Важно отметить, что их поведение может быть непосредственно по сравнению с прилегающей типа ткани дикого. Таким образом, вопросы, имеющие отношение к клетке автономных и неавтономных эффекты генетических поражений могут быть легко изучены. Подобно млекопитающих, только клоны , в которых несколько онкогенных поражений комбинируются становятся злокачественными у дрозофилы и резюмировать основные признаки рака у млекопитающих. Они overproliferate, уйти от апоптоза, вызывают воспаление, становятся бессмертными и InvaSIVE, в конечном счете убивает хозяина 10-17.
Здесь мы опишем протокол для создания генетически определенные клоновых опухоли в глаз / усиков и мозговой ткани личинок дрозофилы с использованием метода MARCM. Метод основан на MARCM тестера запаса, выражающего дрожжи ФЛП рекомбиназу под контролем ушка энхансер (eyFLP) 18,19. Таким образом, GFP-меченные клоны генерируются в обоих peripodial и столбчатым эпителием EAD и нейроэпителии головного мозга на протяжении эмбриональной и личиночной стадии (Фигура 1А, В и ссылочных 20). Клоны можно легко проследить до взрослой жизни, как EAD развивается в взрослых глаз, антенны и головной капсулы в то время как нейроэпителия приводит к нейробластов, которые производят дифференцированные оптические нейроны лепестка.
Для облегчения обширной молекулярной, функциональной и фенотипическую характеристику мозаики ткани, мы деписец протокол для рассечения EAD и головного мозга от личинок третьей возрастной стадии и кратко описано, как обрабатывать их для трех различных применений: (I) обнаружения трансгенных флуоресцентных репортеры и иммунное окрашивание, (II) Количественное инвазивности опухолей и (III), анализ экспрессия гена изменяется с помощью количественного в реальном времени ПЦР (QRT-PCR) или высокой пропускной способностью мРНК последовательности (мРНК-Seq) (рис 1C).
Протокол иммунное может быть использован для визуализации любой белок, представляющий интерес со специфическим антителом. Трансгенные флуоресцентные репортеры транскрипции обеспечивают удобную и точную пространственно-временную информацию о деятельности конкретного сигнального пути. Клеточная линиеспецифический репортеры, с другой стороны, отражают количественные и качественные изменения в клеточных популяций в пределах мозаичного ткани и среди опухолей различных генотипов. Количественное инвазивного поведения облегчает сравнение опухоли злокачественного между генотипомs. И, наконец, протокол, описывающий процесс сбора и обработки мозаики EAD для выделения РНК подходит как для малых и больших масштабах вниз по течению приложений, таких как обратной транскрипции с последующей QRT-PCR и общегеномного мРНК-SEQ соответственно. Качественные и количественные данные, полученные из этих анализов являются новые проникновения в суть социального поведения клоновых опухолей. Кроме того, они создают прочную основу для функциональных исследований о роли отдельных генов, генетических сетей и микросреды опухоли на разных стадиях и аспекты онкогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Эта работа использует eyFLP1; Акт> у +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, ванна-Gal80 MARCM 82B Зеленый тестер линии 11. Пересечение тестер дев MARCM 82B зеленого до самцов штаммов , таких как вес; UAS-а; UAS-б RNAi, FRT82B с Мут генотип даст потомство , в котором будет происходить митотической рекомбинации между правыми руками 3 - го гомологичных хромосом. Таким образом, клоны , гомозиготные мутантные по гена с расположенной дистально по отношению к площадке FRT82B будет генерироваться внутри EAD и нейроэпителии мозга. Эти клоны будут выражать GFP, трансгенный а и дсРНК для гена Ь (рис 1А). Различные eyFLP-MARCM тестер линии для рекомбинации на X, 2L, 2R, 3L и 3R были созданы и доступны в лету сообщества.
1. Fly Обработка, Крестики и Балетмейстер
- Разверните соответствующую MARCM тестер запаса при комнатной температуре путем заполнения нескольких боttles в то же время. Флип взрослых в свежие бутылки каждые 2-3 дня, так что достаточно дев могут быть собраны для последующих скрещиваний.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе дев, во избежание длительного воздействия CO 2 , так как это ставит под угрозу женскую фертильность. - В зависимости от масштаба эксперимента, установить мух кресты во флаконах с использованием по меньшей мере 10 MARCM тестера дев и 4 мужчин (например, для визуализации флюоресцентных репортеров и иммуноокрашивания) или в бутылках с , по меньшей мере 30 дев и 10 мужчин (например, для Выделение РНК и количественное определение инвазивности).
- Повысить потомству при 25 ° С в течение долгого дня 16 ч / 8 ч свет-темнота цикла. Флип родителей в новые флаконы / бутылки каждые 24 ч для облегчения воспроизводимый постановки личинок и предотвращения перенаселенности.
Примечание: Начиная с 6-й день после откладки яиц (AEL), поздний контроль возрастной стадии личинки перестают питаться в-третьих, начать блуждающих и введите pupariation. В противоположность этому, начало перехода личиночной-куколки может быть деили уложены несуществующими у личинок с EAD несущих гиперпластических или злокачественные опухоли клоновых.
2. Сбор третьей возрастной стадии личинок
- Для иммуноокрашиванием, собрать около 20 конце личинок третьей возрастной стадии (побродив по стене, и те, сопоставимого размера тела от пищи). Используйте пинцет, чтобы аккуратно подобрать личинки из флакона или бутылки и передавать их в эмбрион стеклянную посуду, заполненную фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
- Для выделения РНК и количественного определения инвазивности, собирают по меньшей мере 80 позднюю личинок третьей возрастной стадии (побродив по стене и те, сопоставимого размера тела от пищи). Используйте бутылку Брызги впрыснуть PBS в муху флакон, содержащий личинки, пока поверхность не покрыта.
- Смягчение верхние слои пищи с помощью шпателя и вылить пищевую затора, содержащую личинки в чашку Петри. Использование щипцов, осторожно выбрать личинок и передать их в эмбрион стеклянную посуду, наполненную PBS.
- Промыть личинок с PBS ЕНТиль все остаточные продукты питания удаляется. Осмотрите личинки под флуоресцентным стереомикроскопа с 8 до 16х увеличением , чтобы отбросить все "личинки барсов" , которые несут случайные GFP-позитивные пятна по всему телу личиночной (рис 2А, 2В и обсуждение см раздел).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения РНК включают предпоследнюю стадию промывания в 70% этанола в течение 1 мин. - Поместите блюдо, не содержащий выбранные личинок в PBS на льду до вскрытия. Процесс личинки в течение 30 мин, чтобы избежать негативных последствий голода и холода.
3. Вскрытие Личинка
- Для того, чтобы рассекать EAD под стереомикроскопа, использовать одну пару щипцов, чтобы мягко нажать среднюю часть личинки против стеклянной посуды внизу. Со вторыми щипцов, возьмите личиночной крючки рот и вытащить их от тела (рис 2C).
Примечание: Тяговое усилие часто бывает достаточно, чтобы сломать оптические стебли, соединяющие EAD Пайг до долей мозга. Если мозг или его части оставаться прикреплены к EAD и их присутствие не требуется для дальнейшего применения, перерезал оптические стебельков с помощью двух пар щипцов. Для инвазивных опухолей (например, ПБУ V12 Scrib 1) связь между EAD и долей мозга становится все более и более затененных со временем путем зарастания и миграции клоновых клетки.- Для получения комплекса EAD / головного мозга с интактной вентральной нервной цепочки (VNC) (рис 2D), использование щипцов , чтобы вырезать личинку в середине тела. Откажитесь заднюю половину.
- Держите переднюю половину тела личинки между концами одного щипцов, переворачивать личинку наизнанку, нажав на крючки во рту с кончиком второго пинцетом и прокаткой кутикулу над ним с первой парой щипцов.
- Использование щипцов тщательно удалить все посторонние ткани (например, слюнные железы, жир тела, и кишечнике), оставляя пару EAD иликомплекс ЕАД / мозг подключен к крюкам рта. Распутать крючки рта от вышележащих кутикулы. Освободите VNC путем разделения аксонов выступы , простирающиеся на мышцы тела и эпидермиса (рис 1B, 2C, 2D).
Примечание: Крюки рот для безопасного манипулирования ткани с щипцами и способствовать более эффективному тонуть и легкое распознавание ткани во время стирки. Рассеченные EAD морфологию изменения относительно быстро при хранении нефиксированной в PBS. Ограничить время рассечение до 20-30 мин. - Для переноса ткани, покройте P20 кончик микропипетки пипеткой оставшегося тела каркасов несколько раз вверх и вниз. Для передачи больших комплексов EAD / мозга, разрезал P20 микропипетки кончик с помощью ножниц.
Примечание: Процедура покрытия имеет решающее значение для предотвращения прилипания и потерю рассеченной ткани во время передачи данных. Использование P20 микропипетки минимизирует перенос PBS в Фиксирующий раствор, ограничивая нежелательное разбавление.- Для иммуноокрашиванием, трансферрассеченные EAD в 0,5 мл пробирку, заполненную 400 мкл 4% параформальдегида (PFA) фиксаторе. Используйте 1,5 мл пробирку с 1 мл PFA для увеличения EAD / мозговые комплексы, предназначенные для озвучивания инвазивности.
ВНИМАНИЕ: PFA является высокотоксичным. Надевайте защитные перчатки и одежду. Избегать контакта с кожей, глазами или слизистых оболочек. - Для выделения РНК передать расчлененный EAD в новую стеклянную посуду, наполненную холодной PBS. Используйте пинцет, чтобы очистить EAD от кольца и лимфатических желез, чтобы свести к минимуму примеры загрязнения.
- Отсоединение EAD из крюков рта путем разъединять соединение между антенным дисками и крючками рот с помощью щипцов (рис 2E). Для того, чтобы избежать деградации РНК и экспрессии генов артефактов, ограничить время, рассечение до 30 мин. Перейдите к шагу 7.
Примечание: опытный исследователь может рассекать около 60 личинок в течение 30 мин времени за исключением необходимого для сбора личинок и промывки. Всего урожайность РНК зависит от размера EAD, которые различаются между генотипами и девелопментал этапы. Вскрытие 80-100 управления EAD пар с конца личинок третьей возрастной стадии должны давать 5-8 мкг тотальной РНК.
- Для иммуноокрашиванием, трансферрассеченные EAD в 0,5 мл пробирку, заполненную 400 мкл 4% параформальдегида (PFA) фиксаторе. Используйте 1,5 мл пробирку с 1 мл PFA для увеличения EAD / мозговые комплексы, предназначенные для озвучивания инвазивности.
4. Закрепление, Иммунологическое и монтирование
- Закрепить образцы в PFA фиксаторе в течение 25 мин при нутационное при комнатной температуре. Время фиксации может быть продлен до 60 мин без изменения морфологии тканей и антигенность белков.
- Удалить закрепляющего и мыть образцы с PBST (PBS с 0,1% Тритон Х-100) три раза в течение 10 мин с использованием nutator. Используйте достаточный объем PBST для каждой стадии промывки (400 мкл / 0,5 мл трубки).
Примечание: Фиксированный EAD / мозговые комплексы, предназначенные для озвучивания инвазивности не требуют иммуноокрашивания. Сигнал GFP остается хорошо виден после фиксации. Перейдите к шагу 4.4 для окончательного рассечение.- Для иммунологического окрашивания, блок ткани в 200 мкл блокирующего раствора (PBST с 0,3% бычьего сывороточного альбумина) в течение 20 мин при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
- Выдержите с чопорнымиичные антитела разводили в 100 мкл блокирующего раствора в течение ночи при температуре 4 ° С при осторожном встряхивании. Обратитесь к первичному технического описания антител или опубликованной литературе для разведения антител рекомендуемым.
Примечание: Разбавление первичное антитело, возможно, должны быть оптимизированы. - После пяти 10 мин промывок в PBST, Пятно ткани с флуоресцентными вторичными антителами, разводили в блокирующем растворе при осторожном встряхивании в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С в темноте.
- Вымойте образцы три раза 10 мин в PBST.
- Выдержите с чопорнымиичные антитела разводили в 100 мкл блокирующего раствора в течение ночи при температуре 4 ° С при осторожном встряхивании. Обратитесь к первичному технического описания антител или опубликованной литературе для разведения антител рекомендуемым.
- Для иммунологического окрашивания, блок ткани в 200 мкл блокирующего раствора (PBST с 0,3% бычьего сывороточного альбумина) в течение 20 мин при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
- Заменить PBST с 500 мкл DAPI-окрашивания раствора. Для обозначения F-актин, добавьте фаллоидина конъюгированный с флуоресцентной красителя DAPI-окрашивание раствора. После 15-минутного нутации в темноте, мыть ткани один раз в течение 10 мин с PBST.
Примечание: F-актина маркировка может быть выполнена независимо от DAPI окрашивания. - Для заключительного этапа рассечение, передать ткань обратно в PBS заполненный стеклянной посуде с использованием 1 мл пиPette. Используя две пары щипцов обрезать рот крючки.
- Отделить мозги, которые будут использоваться для количественной оценки инвазивности из EAD путем разрезания оптического стебелек как заросший EAD может затруднить анализ.
- Поместите каплю монтажной среды (15 мкл для х 22 мм покровным 22 мм) на объективный слайд. С помощью щипцов советов, распространять среду в тонкий слой. Передача EAD, мозги или комплексы EAD / мозга в монтажную среду с P20 микропипетки.
- Используйте пинцет советы или вольфрамовый стержень для распределения ткани и выпрямить VNC на слайде.
- Для того, чтобы избежать образования пузырей при монтаже, первое прикосновение один край покровным к монтажной среде, а затем медленно опустите на монтажную среду с помощью щипцов. Используйте небольшие кусочки фильтровальной бумаги или ткани протрите, чтобы поглотить избыток гистологическая среда вокруг покровное края.
Примечание: ДАБЦО / поли (виниловый спирт), 4-88 гистологическая среда затвердеваетпри 4 ° С в течение часа. Слайды могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре 4 ° С.
5. конфокальной микроскопии
- Приобретать одиночные секции конфокальной и стеки с помощью конфокальной микроскопии, оснащенный 20x, целями нефти 40X и 60X.
- Предотвратить насыщенность пикселей. Используйте те же параметры получения изображений , включая разрешение изображения, входной мощности лазера, коэффициент усиления, смещение, кадров усреднения, размер шага в серии Z и сохранить эти настройки для всех генотипов , чтобы для сравнения интенсивностей пикселей между различными генотипами 21,22.
Примечание: Для визуализации комплекса / мозга EAD, создавать максимальные проекции и сшить соответствующие, соседние изображения. Для окончательной подготовки изображения используйте программное обеспечение для обработки изображений пост для сборки панели и для регулировки яркости и контрастности.
6. Количественное опухолевой инвазии
- Определить систему подсчета очков, которая будет характеризовать различные уровни опухолевых invasivenesS с учетом пространственной структуры вторжения и количество GFP-позитивных клеток, распространяющихся в мозг и VNC. Подготовить оценочные листы для документации (Рисунок 3А).
- Гора, по крайней мере 80 фиксированных неповрежденные мозги для каждого генотипа на одном слайде с использованием 40 мкл монтажной среды на 24 мм х 50 мм покровное.
- Чтобы разрешить объективную скоринг, задать нейтральную сторону для анонимизации слайды, так что процедура подсчета очков является несмещенной. Оценка анонимными слайды двух лабораторных членов независимо друг от друга. Раскрывать генотипы только после того, как подсчет закончен.
- Оценить степень злокачественности слепой озвучивания смонтированных мозги под флуоресцентным стереомикроскопа, снабженного набором фильтров GFP. Используйте маркер для обозначения мозги , которые уже были просмотрены , чтобы избежать двойного учета (рис 3B).
- Рассчитывают процент мозга, попадающих в каждую из определенных категорий инвазивных на генотип. Определить статистические Significance с помощью теста хи-квадрат (рис 3C).
7. Выделение РНК, ДНКазы лечение и качество проверки
Примечание: Все реагенты (растворы, из пластмассы), используемые в следующих шагах должны быть свободны от активности РНКазы. Всегда носите перчатки и использовать химический капюшон для работы с органическими растворителями.
- Перенесите чистую EAD с покрытием наконечника P20 микропипетки в 1,5 мл трубки.
- Пусть слив ткани в нижней части трубки, осторожно удалите PBS и заменить его на 100 мкл РНК лизирующего реагента (достаточное количество до 140 EAD).
- Lyse ткани встряхиванием. На этом этапе образцы могут быть глубоко замораживают в жидком азоте и хранили при -80 ° С или непосредственно обработаны с помощью стандартного протокола для выделения РНК.
Примечание: Образцы подобных генотипов из нескольких раундов рассечение могут быть объединены в один раз лизирующего реагента РНК. - Наполните объем образца до 0,9 мл с помощью реагента РНК для лизиса. Добавить 0,2 мл хлороформа и смешивают образцы vigorously в течение 15-20 сек.
- После 2 до 3 мин инкубации при комнатной температуре, Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Передача бесцветную верхнюю водную фазу, содержащую РНК в новую пробирку, не нарушая интерфазу. Держитесь подальше от интерфазы, поскольку она содержит белки и геномную ДНК.
Примечание: Восстановленные объем должен составлять около 60% от объема реагента РНК лизиса используют для гомогенизации. - Осадить РНК путем добавления 0,5 мл изопропилового спирта. Vortex и инкубировать образцов при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Удалите супернатант и промыть осадок РНК один раз с 600 мкл 75% этанола. После короткого вихря и центрифугирования (10000 х г в течение 7 мин при 4 ° С) отбрасывать весь этанол и пусть осадок РНК сушат на воздухе в течение 5-10 мин размещения открытую трубу на чистую ткань салфеткой.
Примечание: осадок РНК может быть видна как крошечное непрозрачной / белый стсозревший в нижней части трубки или невидимым. Оставшиеся капли этанола могут быть тщательно удалены с P10 микропипетки наконечник. - Растворите РНК в 50 мкл DEPC-обработанной воды, путем встряхивания или проходя раствор несколько раз через кончика пипетки.
- Для того, чтобы свести к минимуму загрязнение с геномной ДНК, лечить тотальной РНК с ДНКазы путем добавления 50 мкл смеси, содержащей 1 мкл ДНКазы (2 ед / мкл) и 10 мкл 10-кратного буфера ДНКазы в ДЭФЦ-обработанной воде. Vortex и спином вниз.
- Инкубируйте образцы при 37 ° С в водяной бане или нагревательный блок 30 до 40 мин. После инкубации добавляют 100 мкл DEPC обработанной воды в каждом образце.
- Для того, чтобы инактивировать ферментативную активность и очистить РНК из ДНКазы, добавляют 200 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1) раствор, вортексе в течение 1 мин и Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 7 мин при 4 ° С.
- Аккуратно перенести верхнюю водную фазу, содержащую РНК в свежую пробирку. Добавить равный объем (200 мкл)хлороформа, перемешивают и повторяют центрифугирование сверху.
- Осторожно собрать верхнюю фазу и осадить РНК путем добавления 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2 готовили в DEPC H 2 O и 2,5 объемов 100% этанола. Тщательно перемешать встряхиванием.
Примечание: при добавлении 0,5 мкл гликогена (20 мкг / мкл) в осадительной смеси позволяет визуализировать осадок РНК. Для того, чтобы свести к минимуму потери РНК, использовать силиконизированные, низкие связывания 1,5 мл микроцентрифужных трубки. - Осаждени РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч.
Примечание: инкубация может проводиться в течение ночи. Образцы могут быть помещены при -80 ° С, а также. - Осадок РНК центрифугированием при 10000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Мытье и сухой осадок после описания в 7.9.
- Растворите РНК в 10-15 мкл DEPC-обработанной воды. Магазин РНК при -80 ° С.
- Определить количество и чистоту РНК путем измерения оптической плотности при 230 нм, 260 нм и 280 нм с использованием спектрофотометра. Рассчитать РНК сотрудничествоncentration путем применения конвенции, что 1 OD при 260 нм составляет 40 мкг / мл РНК.
Примечание: отношение А 260/280 "чистой" РНК составляет 2,0 в то время как отношение А 260/230 должно находиться в диапазоне 2,0-2,2. Образцы РНК с 260/280 отношением А между 1,7 и 2,0 подходят для последующих применений , таких как синтез кДНК. Для получения мРНК-ПОСЛ библиотек, качество и количество РНК должна быть проверена с помощью автоматизированной системы электрофореза. Отношение 28S / 18S должно быть выше 1,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы продемонстрировать потенциал метода eyFLP-MARCM для генерации GFP-отмеченные участки определенных генотипов в Drosophila EAD, были вызваны три типа клонов: (1) контроль экспрессии GFP только, (2) злокачественные опухоли , экспрессирующие онкогенного форму небольшой G-белок Ras (Ras V12) на фоне гомозиготной потери генов супрессоров опухолей мазня (Scrib 1) и (3) зарастание но неинвазивным РАН V12 Scrib 1 Jnk DN клонов, где Jun-N-концевой киназы (JNK) инактивировали выражением ее доминантно-негативной формы (рисунок 4, таблица 1 для генотипов). Было показано , что инвазивность РАН V12 Scrib 1 клоновых опухолей требует аномальным активации сигнализации JNK и ее вниз по течению транскрипционные факторы 10,12,23,24. Кроме того, ПБУ V12 Scrib 1 дрозофилы, что приводит к инфильтрации иммунных клеток (называемых форменных элементов ) в EAD 14,25.
Для того, чтобы контролировать уровни и пространственное распределение JNK активности в пределах мозаичного ткани и среди опухолей различных генотипов, установленный трансгенными, JNK реагирующих TRE-DsRed репортер работал 26. Конфокальной микроскопии рассеченные, фиксированной EAD и EAD / мозговые комплексы показали заметное повышающую регуляцию активности репортера TRE-DsRed в тканях , имеющих злокачественные Ras Scrib 1 V12 опухоли (рис 4б). DsRed сигналов маркированы Scrib RAS V12 1 клонов EAD (Рисунок 4В), а также опухолевые клетки , распространяющийся по долек мозга и вторгшиеся в VNC (Рисунок 4E, 4F). В отличие от этого , репортер деятельно ТРЕ-DsRedти оставался ограниченным в строку ячеек , простирающихся от усиков на глаз части управления дисками (рис 4A '). Блокирование сигналов JNK привело к резкому снижению сигнала TRE-DsRed в клоновая Ras V12 Scrib 1 JNK DN опухоли (рис 4C, 4D). Таким образом , эти данные обеспечивают функциональную доказательств для требования JNK сигнализации для активации TRE-зависимой транскрипционной реакции при злокачественных Ras V12 Scrib 1 опухолей. Линии преемственности конкретных hmlΔ-DsRed репортер, разработанный для отслеживания дрозофилы гемоцитах 27,28 показали накопление иммунных клеток в тканях злокачественных несущих Ras v12 Scrib 1 опухоли (рис 5б). В противоположность этому , только отдельные гемоцитов или несколько локализованных гемоцитов пятна были обнаружены в контрольной и RAS V12 Scrib 1 JNK Д.Н. мозаики EAD и ткани мозга(Рисунок 5А, 5С). Иммуноокрашивание с пан-гемоцитов анти-Hemese антитела (Н2) 29 подтвердили идентичность иммунных клеток из hmlΔ-DsRed положительных клеток (рис 5D, 5E). В соответствии с опубликованным отчетам 12,23,24, объективной количественной оценки опухоли инвазивности подтвердили центральную роль JNK сигнализации в содействии опухолевой инвазии в соседние лопасти мозга и VNC (Рисунок 3C). И, наконец, общая РНК выделяли из EAD мозаики. Образцы были подвергнуты либо QRT-PCR или анализировали на автоматизированную систему электрофореза для качества и количества. 6А показывает значительное JNK-зависимой повышающую регуляцию матрицы металлопротеиназы 1 (MMP1) транскрипт в EAD подшипник злокачественными РАН V12 Scrib 1 клоновых опухоли, подтверждая ранее опубликованные данные 12,24,30,31. Оценка общей РНК с использованием автоматизированной системы электрофореза показал, тшляпа три независимых EAD образцы имели соотношение 28S / 18S выше 1.8 (фиг.6В). Тем не менее, EAD 2 РНК частично расщепленный, отражается мазок на геле (рис 6в). В отличие от этого, ОПВ 3 образца имели низкую концентрацию. Несколько групп с более высокой молекулярной массой на изображение геля (рис 6б) и небольших пиков на electropherogram (фиг.6С), также предложил контаминации ДНК. Таким образом, только EAD 1 образец будет пригоден для получения мРНК-библиотеки сл.
Рисунок 1: Схематическое изображение системы MARCM для генерации генетических мозаик в Drosophila EAD и вниз по течению приложений (А) Система MARCM позволяет генерировать клоновых пластырей с определенными генетическими повреждениями в противном случае дикого типа (гетерозиготные).контекст. Выражение FLP под контролем специфического промотора ткани (например, ушка) катализирует рекомбинацию между двумя FRT элементами , фланкирующих СТОП кассеты , отмеченные желтым (у) гена (акт> у +> Gal4). После удаления СТОП кассеты, то Повсеместно выраженный Gal4 транскрипционный активатор (акт-Gal4) может управлять экспрессией любого UAS , основанного на трансген , таких как UAS-GFP (также UAS-RAS V12). В родительской клетке, однако активность Gal4 заблокирован Gal80 репрессора, экспрессия которого контролируется промотором тубулина (ванна-Gal80). В G2 фазе клеточного цикла, ФЛП опосредует обмен не-сестринских хроматид между гомологичными хромосомами дистальнее FRT сайтов. Разделение рекомбинантных хромосом во время митоза приведет к двум дочерним клеткам, один из которых гомозиготных мутантов для конкретного геномного локуса (например, Scrib
Рисунок 2: сортировка личинок третьей возрастной стадии и представительных примеров EAD и EAD / мозговые комплексы используются для различных приложений вниз по течению (AB) Флуоресцентные микрофотографии третьего личиночных контрольных личинок подшипника GFP-меченных клонов индуцированных с eyFLP-MARCM 82B Зеленый тестер.. (А) представитель управления личинка с клонами ограниченных к EAD и мозговых долей. (В) Пример "Барсу личинкой" несущей GFP-положительных клонов в различных тканях по всему организму. (C) Светлое поле изображения рассеченной EAD и (D) EAD / мозга комплексов , прикрепленных к крюкам во рту, и (Е) EAD Очищенные от всех посторонних тканей , включая крючки рот. Масштабные полоски = 2 мм (AB) и 500 мкм (CE).fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Количественное опухоли инвазии (А) Флуоресцентные конфокальной изображения головного мозга рассекают Рас V12 Scrib 1 личинок (7 дней AEL) представляют собой реальные примеры четырех различных сортов опухоли инвазии в пределах от неинвазивным (оценка 0), одна лопасть мозг захвачена (1 балл), оба мозга лепестки захватившие (оценка 2) сильным опухолевой инвазии с клоновая ткань, покрывающая обе доли мозга и ввод (VNC оценка 3). Изображения проекции нескольких секций конфокальной и примеров для забито 2 и 3 сшиты из 2-х 2 конфокальных изображений. Масштабные полоски = 100 мкм. (B) Пример анонимной стекло микроскопа с фиксированным мозгом используется для несмещеннойзабив под флуоресцентным стереомикроскопа. Забил мозги отмечены ручкой для предотвращения повторной регистрации. Шкала бар = 500 мкм (C) По сравнению с высоко инвазивными Scrib РАН V12 1 опухолей, подавление сигналов JNK (РАС V12 Scrib 1 JNK DN) устранен вторжения клоновых клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Активация транскрипционных репортер TRE-DsRed в 'V12' злокачественных Ras 1 клоновых опухолей Scrib 'является JNK-зависимой (A. TRE-DsRed репортер маркированы узкую полоску клеток , идущих от усиков на глаз части (стрелки). (Б) Активность репортера TRE-DsRed была заметно повышена в Ras V12 Scrib 1 GFP-положительных клонов по сравнению с окружающим без клонального EAD эпителия. (C) ингибирование JNK активности привело к ясном снижению интенсивности сигнала DsRed в Рас V12 Scrib 1 Jnk DN клонов. (D) Дальнейшее усиление сигнала DsRed выявили неавтономную активацию JNK сигнализации в клетках , окружающих РАС V12 Scrib 1 Jnk DN клонов. (E) На 8 -й день AEL, ПБУ V12 Scrib 1 клеток перерос весь EAD и распространяются на мозговые лопасти к VNC (стрелка). (F) клоновых клетки вторгаются в VNC (крупный план области мarked стрелкой Е) обогащались для сигнала DsRed. (AC) Показать проекции нескольких секций софокусных, (Е) сшит из 3х3 конфокальных изображений и (D, F) представляют один раздел. Шкала бар = 50 мкм. EAD, глаз / усиков диск; BL, мозг лепестка; VNC, вентральный нервный тяж. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Lineage конкретных HML Δ -DsRed трансгенный репортер показывает обогащение Ras V12 Scrib 1 ассоциированный с опухолью гемоцитах (А) В контрольной EAD, hmlΔ-DsRed репортер меченных гемоцитов CLU STERS оказались в ловушке в углублениях глаза и усиков эпителия. (B) EAD и мозговой ткани состоит из V12 Scrib РАН 1 GFP обозначенным опухоли показал повышенное количество форменных разбросаны по всему клонального ткани. (C) Число ассоциированного гемоцитах резко уменьшилось на ингибирование сигнализации JNK в Ras V12 Scrib 1 JNK Д.Н. мозаики ткани. (DE) HmlΔ-DsRed положительных гемоцитов также были помечены H2-антителом , которое обнаруживает пан-гемоцитов маркера Hemese. (AC) Показать проекции сечений множественного конфокальной (А) сшит из 2 х 2 и (BC) сшиты из 3 х 3 конфокальных изображений. (DE) представляют отдельные разделы. Шкала баров = 100 мкм (AC) и 10 мкм (DE). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6:.. Оценка количества и качества тотальной РНК , выделенной из рассеченной EAD (А) Характерным примером результатов QRT-ПЦР с использованием четырех биологических копировщиков для каждого генотипа уровни транскриптов MMP1 были нормализованы к rp49. Откидные изменения в экспрессии генов , были рассчитаны с использованием относительного стандартного метода 32 кривой. Данные представляют собой средние значения ± СКО; *** P <0,001, используя непарный Стьюдента-тест Стьюдента с неравной дисперсией. (В, С) Оценка общего качества и количества РНК с использованием автоматизированной системы электрофореза. Гель изображение виртуального (B) показаны два видных полчища 18S и 28S рРНК , которые соответствуют хорошо выраженных пиков на электрофореграммы (C). Загрязнение ДНК и РНК деградации отражаются вМИЭР (наконечники стрел) и extranumerary полосы и пики (стрелки). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Fly Штаммы | Источник / Комментарии |
| eyFLP1; Акт> у +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, ванна-Gal80 | eyFLP-MARCM 82B Зеленый тестер 11 |
| ш; UAS-RAS V12; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| ш; UAS-RAS V12; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| ш; hmlΔ-DsRed; FRT82B | это исследование, ш; hmlΔ-DsRed от Katja Брюкнер 28 |
| вес; UAS-RAS-V12 hmlΔ DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | эта учеба |
| ш; UAS-RAS-V12 hmlΔ DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | эта учеба |
| ш; TRE-DsRed; FRT82B | это исследование, ш; TRE-DsRed от Dirk Bohmann 26 |
| ш; UAS-RAS V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | эта учеба |
| ш; UAS-RAS V12 TRE-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | эта учеба |
Таблица 1: Сводка линий Drosophila , используемых в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы для создания генетических мозаик в дрозофилы являются одними из самых сложных инструментов для анализа и манипулирования функции гена 33. Система eyFLP-MARCM доказала мощные и надежные , поскольку она позволяет индукцию визуально отмеченных, генетически определенных клонов в пространственно ограниченным способом, т.е. в тканях , где безглазое энхансер активен 9,18. Это особенно важно, когда несколько генетических повреждений объединены в одних и тех же клетках. В то время как эти высоко аномальным патчи позволяют личиночное развитие при ограничении на EAD и мозга нейроэпителия, они могут вызвать летальность при разбросаны по всему телу, как личиночной в случае теплового шока контролируемых ФЛП (hsFLP) клонов. Важно отметить, что индукция клонов в муха EAD эпителием, в котором активируется онкогенов в сочетании с потерей опухолевых супрессоров резюмирует возникновение и прогрессирование солидных эпителиальных опухолей в некоторых злокачественных опухолей человека. эйWever, система также имеет свои ограничения, которые будут кратко обсуждены. Учитывая, что насекомые имеют открытую систему кровообращения, истинные метастазы, как наблюдаемые в злокачественных опухолях человека не происходит. Поэтому сложный процесс метастатического распространения не может быть точно смоделированы в дрозофилы. Тем не менее, EAD опухоли , такие как клоны V12 Scrib RAS 1, демонстрируют злокачественные свойства , как они разрушают базальную мембрану , окружающую EAD и вторгнуться в соседний мозг 11,12,31. Степень агрессивности опухоли может быть определена количественно и по сравнению между различными генотипами, как описано в данном исследовании. Важно также отметить, что наличие специфических генетических повреждений в мозаичном EAD может повлиять на синхронизацию с развитием и продолжительность роста мальков. Балетмейстер личинок будет определять, является ли анализ мозаики ткани будет проводиться с использованием животных одного и того же хронологического или стадии развития. Выполнение пилотного эксперимента для оценки влияния отдельныхновый EAD клоновая генотип по времени развития является желательным.
Существуют технические ограничения, а также. Во-первых, число различных клоновых генотипов, которые могут быть построены с помощью инструмента eyFLP-MARCM является большим, но не бесконечно. Например, сочетающие два мутантные аллели, которые находятся на разных хромосомах препятствует низкая эффективность рекомбинации на обеих хромосомах одновременно, и гены, расположенные на небольшой четвертой хромосомы, как правило, недоступны. Нокдаун гена с использованием трансгенной RNAi является альтернативным решением. Тем не менее, важно понимать, что трансгены не выражены сразу после митотической рекомбинации - не до репрессор Gal80 ухудшается. Активность системы экспрессии / UAS Gal4 может быть повышена за счет растущего личинок при 29 ° C. Это, однако, важно иметь в виду, что повышенная температура влияет на различные области развития, физиологические и молекулярные параметры, включая скорость роста, сроки развития, MetaboliВыражение см и ген 34-37. Таким образом, адаптация к обеспеченных протоколов, таких как постановки личинок или числа расчлененным EAD для профилирования транскриптома было бы необходимо.
Испытатели eyFLP-MARCM не относятся к числу здоровых штаммов. Несколько трансгены в одном геноме компромисса летать пригодности и плодовитость. Эти запасы требуют дополнительного внимания необходимо поддерживать и расширять для больших коллекций девственных самок. Как указано в этом исследовании, MARCM 82B Зеленый тестер линии 11, хотя и жизнеспособны , когда гомозиготный, генетически нестабильна. Это очевидно из спонтанного появления личинок "барсов", которые отображают внематочной, GFP-меченные клоны в рамках различных полиплоидных тканей, включая кишечник, трахей, жирового тела и личиночной эпидермиса. Это явление имеет место во всех пересекает зависит от отцовского генотипа. Мы предполагаем, что эктопические GFP пятна являются результатом неконтролируемого, стохастического рекомбинации между двумя FRT сайтов в FLP-из кассеты, в результате чего удаление желтого + маркера и "STOP". Кассетой В полиплоидных тканях, тубулина промоутер управляемой Gal80 репрессор может быть недостаточно , чтобы блокировать активность Gal4. Наличие генетически модифицированных клеток в других тканях, чем EAD и головного мозга может вызывать системные сигналы, которые могут повлиять на поведение экспериментальных клонов. Поэтому эти "личинки барсов" должны быть исключены из анализа. Кроме того, мы регулярно повторно установить MARCM 82B Зеленый тестер от одиночных между мужчинами и женщинами крестов.
Несмотря на недостатки, упомянутые выше, применение системы eyFLP-MARCM для изучения функций генов и взаимодействия между клоновых опухолей и их средой многообразны. Внедрение БАС-независимых двоичных системах экспрессии GAL4 / таких как LexA / LexOp 38 или наркотиков управляемым QF / Квазилинейная / QS 39,40 обеспечит точный контроль над трансгенной ехрression и / или одновременно маркировки и манипуляции различных клеточных популяций, включая клоновых, не-клоновых эпителиальных клеток и форменных. Такие мозаичные ткани могут быть снова обработаны в соответствии с протоколами, описанными здесь.
Метод рассечения мозаики EAD и EAD комплексов / мозг от личинок третьей возрастной стадии (раздел 3) Протокол может быть применен к более ранних стадиях развития, а также. Важно отметить, что протокол для EAD / мозга комплексов позволяет восстановление крыла, haltere и ног имагинальных дисков. Если эти быть использованы для выделения РНК (разделы 3.3.2 протокола и 7), диск интерес должна быть очищена от посторонней ткани и обработанной аналогично EAD. С учетом их меньший размер, количество haltere и ног дисков, собранных должна быть увеличена, чтобы получить необходимое количество РНК.
Протокол для экстракции суммарной РНК из EAD (раздел Протокола 7) основан на РНК-лизирующего реагента доступны из различных коммерческих Vendors (см Перечень материалов / оборудования). Общий успех процедуры во многом зависит от: (I) , имеющие достаточное количество личинок, (II) является быстрым и точным в то время как рассечения, и (III) хранение проб свободной от РНКазы. Сохранение рабочего пространства и инструментов в чистоте, в перчатках, с использованием РНКазы пластиковой посуды и решений, а также хранение проб на льду все это уменьшает деградацию РНК. Для предотвращения загрязнения РНК с любой геномной ДНК, которые не могут быть полностью удалены путем обработки ДНКазой (раздел 7.11) Протокол, крайне важно, чтобы избежать интерфазу при сборе водной фазы впервые (раздел 7.6) Протокол. Оба загрязнение ДНК и деградация РНК могут быть обнаружены путем запуска образцов на автоматизированной системе электрофорез (рисунок 6В, 6С). Протокол выделения РНК имеет более широкое применение. Она была успешно использована для выделения РНК из всего личинок на разных стадиях развития, от взрослых, а также различныеличиночные органы. Полученная РНК подходит как для QRT-PCR и общегеномного анализ транскриптом мРНК-20,24,41,42 сл. По сравнению с QRT-ПЦР, которая количественно десятки выбранных мРНК в лучшем случае, непредвзятый мРНК секвенирование позволяет геному выражение анализа. Таким образом, можно сравнить целые сигнатуры транскриптом опухолей , индуцированных специфическими генетическими повреждениями на различных стадиях онкогенеза 24. Важно иметь в виду, что РНК поступает из целых дисков, так что результаты будут отражать не только изменения в клонах, но и в окружающем, не-клонального ткани. Выполнение флуоресцентный реактивировать сортировки клеток (FACS) на диссоциированного EAD мозаики путем адаптации имеющихся протоколов 43,44 могут быть применены для определения транскрипционной подписи специфических клеточных популяций, например, клоновая (GFP +) и не-клонального (GFP -) клеток.
Протокол фиксации и иммунное, описанный здесь, подходит для сеанса одновременной игрыспонтанного визуализация интерес белков со специфическими антителами и активностью трансгенных репортеров. Оба сигнала GFP маркировки клоновых клетки и DsRed флуоресценции, полученные с помощью одного из двух трансгенных репортеров, используемых в данном исследовании, сохраняются на протяжении фиксации и иммунное окрашивание и может быть непосредственно визуализировать с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, антитела против флуоресцентные белки могут усиливать интенсивность сигнала. Точно так же, использование анти-β-галактозидазы антител будет облегчать обнаружение трансгенных репортеров на основе гена бактериальной LacZ. Относительные деятельность репортер может быть оценена путем измерения относительные интенсивности пикселей клонов по сравнению с не-клонального ткани с использованием программного обеспечения для анализа изображений (например, Fiji, ImageJ). При сравнении активность репортера среди различных клоновых генотипов, настройки захвата изображений необходимо поддерживать постоянный (раздел 5 Протокол и ссылки 21,22). Хотя протокол хорошо работает с различными аntibodies, это может быть необходимо для оптимизации рекомендуемым концентрации антител. Переоборудование также может потребоваться в фиксации времени, типа и концентрации моющего средства (тритон Х-100, твин-20, сапонины) и фиксирующим средством (8% PFA, 4% раствор формальдегида, этиловом спирте).
В отличие от протоколов, описанных выше, определение количества опухолей инвазивности ограничивается третьей возрастной стадии личиночной стадии и комплекс ЕАД / мозга. Тем не менее, его общее объяснение может применяться к любым количественным исследованиям, где когнитивное искажение следует избегать. Метод требует тщательности. Поскольку опухоль злокачественности увеличивается во времени, важно , чтобы сравнить личинок того же возраста (например, 7 или 8 дней после откладки яиц). Со временем клональной опухоль может перерасти в широком масштабе, но опухолевые клетки могут оставаться в пределах EAD. Шаг, в котором мозг отделены от (раздел 4.4.1) протокола EAD Поэтому крайне важно, чтобы избежать ложных положительных отсчетов инвазивности. Монтаж мозгов с присоединенным EAD будет Флэттаан ткани, в результате чего заросший EAD, чтобы покрыть мозговые структуры и тем самым предотвратить любое количественное. В идеале, хотелось бы, чтобы захватить инвазивный процесс непосредственно в живом личинку. Трансгенные репортеры визуализировать соответствующих групп населения клеток и тканей доступны и могут быть объединены с системой eyFLP-MARCM. К сожалению, инвазивный процесс занимает несколько часов до нескольких дней, временные рамки, которые несовместимы с сохранением личинок живыми в то же время.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
