Summary
Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.
Introduction
Le cancer représente l'un des groupes les plus génétiquement hétérogène de maladies, dont l'incidence et la mortalité est considérablement augmenter, en particulier chez les personnes âgées dans le monde entier. Le cancer provient clonale d'une cellule tumorale initiatrice qui échappe des mécanismes suppresseurs de tumeur inhérente et se divise hors de contrôle. L'accumulation progressive de lésions génétiques qui favorisent la collaboration la croissance, la prolifération et la motilité tout en inhibant la mort et la différenciation transforme la surcroissance bénigne initiale dans une tumeur très maligne, métastatique et mortelle. Il est devenu évident qu'en plus des altérations génétiques, la progression de la tumeur nécessite des changements dans le stroma environnant et la diaphonie entre les types de cellules tumorales et de multiples (par exemple, des fibroblastes et des cellules immunitaires endothéliales) dans son micro - environnement. Comprendre les principes moléculaires sous-jacents, y compris la transformation maligne interactions tumeur-stroma est d'une grande importance pour le développement de prévention et le dépistage précoce des stratégies, ainsi que des traitements nouveaux et efficaces pour lutter contre les métastases du cancer et de la résistance aux médicaments.
La mouche des fruits Drosophila melanogaster est devenu un système attrayant pour la recherche sur le cancer 1-4 en raison de son temps de génération rapide, remarquable conservation des noeuds entre les mouches et les humains, la redondance génétique limitée et la richesse des outils génétiques avancées qui facilitent la manipulation de presque tout gène dans la signalisation d'une manière temporaire et dans l'espace restreint. Les tumeurs génétiquement définies de malignité variable peuvent être conçus de façon reproductible chez la drosophile en introduisant des mutations perte et intensité forte de fonction dans un sous - ensemble de progéniteurs dans un tissu de type sauvage par ailleurs en utilisant la technique de 5 marcm. L'outil de marcm combine FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Reconnaissance cible) médiée recombinaison mitotique 6 avec FLP-out 7 et Gal4 / UAS (Upstream Activation Séquence) gène 8 cibleLes systèmes d'expression 9. Avec cette méthode, l'expression d'un transgène à base UAS, y compris oncogène ou des ADNc de protéines fluorescentes ou répétitions d'ADN inversées pour le silençage génique ARNdb-induite, sera limitée à un clone de cellules qui ont perdu un locus génétique spécifique et un répresseur Gal4 due à la recombinaison (figure 1A). Patches clonales marqués avec fluorescente verte (GFP) ou des protéines fluorescentes rouges (par exemple, RFP, DsRed, mCherry) peut facilement être suivis tout au long du développement, isolé et analysé. Surtout, leur comportement peut être comparé directement au tissu adjacent sauvage de type. Ainsi, des questions pertinentes à la cellule des effets autonomes et non autonomes de lésions génétiques peuvent être facilement étudiées. Comme pour les mammifères, seuls clones dans lesquels de multiples lésions oncogéniques sont combinés deviennent malignes chez la drosophile et récapitulent caractéristiques clés du cancer chez les mammifères. Ils overproliferate, échapper à l'apoptose, provoquer l'inflammation, devenir immortel et Invasive, finalement tuer l'hôte 10-17.
Ici, nous décrivons un protocole pour générer des tumeurs clonales génétiquement définies dans le tissu oculaire / antennaire et le cerveau des larves de drosophile en utilisant la technique de marcm. La méthode repose sur un testeur de stock marcm qui exprime la levure FLP recombinase sous le contrôle de l'amplificateur eyeless (eyFLP) 18,19. De cette manière, les clones GFP marquées sont générées à la fois dans l' épithélium cylindrique peripodial et de l'EAD et le neuroépithélium du cerveau à travers les stades embryonnaire et larvaire (figure 1A, B et référence 20). Les clones peuvent être facilement suivis jusqu'à l'âge adulte que l'EAD se développe dans l'œil adulte, l'antenne et la tête tandis que la capsule neuroepithelium donne lieu à des neuroblastes qui produisent des neurones du lobe optique différenciés.
Pour faciliter une caractérisation moléculaire, fonctionnelle et phénotypique du tissu mosaïque, nous describe un protocole pour la dissection de l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et décrire la façon de les traiter pour les trois applications différentes: (i) la détection des reporters fluorescents transgéniques et immunomarquage, (ii) la quantification de l'invasivité de la tumeur et (iii) l'analyse des modifie l' expression du gène en utilisant une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) ou d' un ARNm de séquençage à haut débit (ARNm-seq) (figure 1C).
Le protocole d'immunocoloration peut être utilisé pour visualiser toute protéine d'intérêt avec un anticorps spécifique. Transgenic reporters de transcription fluorescentes fournissent des informations spatiotemporelle pratique et précise sur l'activité d'une voie de signalisation particulière. journalistes spécifiques Cell-lignage, d'autre part, tenir compte des changements qualitatifs et quantitatifs dans les populations de cellules dans le tissu mosaïque et parmi les tumeurs de génotypes distincts. Quantification de comportement invasif facilite la comparaison de malignité de la tumeur entre le génotypes. Enfin, le protocole décrivant la collecte et le traitement de l'EAD mosaïque pour l'isolement de l'ARN est adapté pour les applications en aval petite et à grande échelle tels que la transcription inverse suivie par qRT-PCR et pangénomique ARNm-seq, respectivement. Les données qualitatives et quantitatives obtenues à partir de ces essais fournissent de nouveaux aperçus sur le comportement social des tumeurs clonales. De plus, ils produisent une base solide pour des études fonctionnelles sur le rôle des gènes individuels, des réseaux génétiques et microenvironnement de la tumeur dans les différentes étapes et les aspects de la tumorigenèse.
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Protocol
NOTE: Ce travail utilise le eyFLP1; acte> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, baignoire-GAL80 marcm 82B ligne verte testeur 11. Traversant les marcm 82B verts testeur vierges aux mâles de souches telles que w; UAS-a; UAS-b ARNi, FRT82B c mut génotype donnera une descendance dans laquelle la recombinaison mitotique se produira entre le bras droit de la 3 ème chromosomes homologues. De cette manière, les clones mutants homozygotes pour le gène c situé distal par rapport au site de FRT82B sera généré au sein de la EAD et le cerveau neuroepithelium. Ces clones expriment la GFP, transgène a et ARNdb pour le gène b (figure 1A). Plusieurs lignes de testeur eyFLP-marcm pour la recombinaison sur le X, 2L, 2R, 3L et 3R ont été établis et sont disponibles au sein de la communauté à la mouche.
1. Fly Manipulation, Croix, et Staging
- Développez le testeur de marcm mère appropriée à la température ambiante en peuplant bo multiplesttles en même temps. Retournez les adultes dans des bouteilles fraîches tous les 2-3 jours afin que suffisamment vierges peuvent être collectées pour des croisements ultérieurs.
NOTE: Lors de la collecte des vierges, éviter une exposition prolongée au CO 2 comme cela compromet la fécondité féminine. - Selon l'échelle de l'expérience, mettre en place des croix de mouche dans des flacons en utilisant au moins 10 marcm vierges testeur et 4 mâles (par exemple, pour l' imagerie des reporters fluorescents et immunocoloration) ou dans des bouteilles avec au moins 30 vierges et 10 mâles (par exemple, pour l'isolement de l'ARN et la quantification de l'invasivité).
- Soulever une descendance à 25 ° C sous une longue journée de cycle de lumière-obscurité / 8 h 16 h. Retournez les parents dans de nouveaux flacons / bouteilles toutes les 24 heures afin de faciliter la mise en scène reproductible des larves et pour éviter le surpeuplement.
NOTE: À partir du jour 6 après la ponte (AEL), la fin du troisième contrôle de l'alimentation larvaire d'arrêt de larves, commencer à errer et entrez nymphose. En revanche, le début de la transition des larves-pupe peut être délayed ou inexistante dans les larves avec EAD portant des tumeurs clonales hyperplasiques ou malignes.
2. Collecte troisième stade larvaire
- Pour immunocoloration, recueillir environ 20 la fin du troisième stade larvaire (errant sur le mur et ceux d'une taille corporelle comparable de la nourriture). Utilisez une pince pour ramasser doucement les larves du flacon ou une bouteille et de les transférer dans un plat en verre d'embryon rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Pour l'isolement de l'ARN et la quantification de l'invasivité, recueillir au moins 80 la fin du troisième stade larvaire (errant sur le mur et ceux d'une taille corporelle comparable de la nourriture). Utilisez un vaporisateur pour faire gicler du PBS dans une bouteille de mouche contenant des larves jusqu'à ce que la surface est couverte.
- Ramollir les couches supérieures de la nourriture avec une spatule et versez la purée de nourriture contenant des larves dans une boîte de Pétri. En utilisant des pinces, ramasser délicatement les larves et les transférer dans un plat en verre de l'embryon rempli de PBS.
- Laver les larves avec du PBS until tous les aliments résiduel est éliminé. Inspecter les larves sous le stéréomicroscope fluorescent avec 8 à grossissement 16X pour éliminer tous les "larves de léopard" qui portent des taches de GFP-positives au hasard dans tout le corps larvaire (Figure 2A, 2B et voir Discussion Section).
Remarque: Pour l'isolement de l'ARN comprennent une étape de lavage avant-dernier dans EtOH à 70% pendant 1 min. - Placer le plat contenant des larves sélectionnées dans du PBS sur la glace jusqu'à la dissection. Les larves de processus dans les 30 min pour éviter les effets néfastes du froid et de la famine.
3. Dissection de Larves
- Pour disséquer l'EAD sous un stéréomicroscope, utilisez une paire de pinces pour appuyer légèrement sur la partie médiane de la larve contre le fond du plat en verre. Avec la deuxième pince, saisir les crochets buccaux larvaires et les tirer loin du corps (figure 2C).
NOTE: La force de traction est souvent suffisante pour briser les tiges optiques reliant l'EAD pair aux lobes du cerveau. Si le cerveau ou ses parties restent attachées à l'EAD et leur présence ne sont pas souhaitables pour d'autres applications, couper les tiges optiques avec une aide des deux paires de pinces. Pour les tumeurs invasives (par exemple, V12 Scrib ras 1) la connexion entre EAD et les lobes du cerveau devient de plus en plus avec le temps obscurcies par mytiliculture et la migration des cellules clonales.- Pour préparer le complexe EAD / cerveau avec un intact nerf ventral cordon (VNC) (figure 2D), utiliser une pince pour couper une larve dans le milieu du corps. Jeter la moitié postérieure.
- Maintenez la moitié antérieure du corps larvaire entre les pointes une pince, retournez la larve à l'intérieur-out en poussant dans la bouche des crochets avec la pointe de la deuxième pince et en roulant la cuticule dessus avec la première paire de pinces.
- En utilisant des pinces enlever soigneusement tous les tissus étrangers (par exemple, les glandes salivaires, la graisse corporelle, et l' intestin) , tout en laissant la paire d'EAD oule complexe EAD / cerveau reliée à la bouche des crochets. Démêler la bouche des crochets de la cuticule sus-jacente. Libérer le VNC en sectionnant les projections axonales étendant aux muscles du corps et de l' épiderme (figures 1B, 2C, 2D).
REMARQUE: Les crochets buccaux permettent une manipulation sûre des tissus avec une pince et faciliter naufrage plus efficace et faciliter la reconnaissance des tissus pendant le lavage. Dissected EAD changement morphologie relativement rapide, lorsqu'il est conservé dans du PBS non fixée. Limiter le temps de dissection à 20-30 min. - Pour transférer le tissu, manteau une pointe de micropipette P20 par pipetage le corps restant carcasses à plusieurs reprises de haut en bas. Pour transférer les grands complexes EAD / cerveau, couper la pointe de micropipette P20 avec des ciseaux.
REMARQUE: La procédure de revêtement est essentiel pour empêcher le collage et la perte de tissu disséqué pendant le transfert. Utilisation d'un micropipette P20 minimise le transfert de PBS en solution fixateur, limitant la dilution indésirable.- Pour immunocoloration, transférerla disséqué EAD dans un tube de 0,5 ml rempli avec 400 ul de paraformaldehyde à 4% (PFA) fixatif. Utiliser 1,5 ml tube avec 1 ml de PFA pour agrandir l'EAD / complexes du cerveau destinés à marquer d'invasivité.
ATTENTION: PFA est très toxique. Porter des gants et des vêtements. Éviter tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses. - Pour l'isolement d'ARN transférer l'EAD disséquée dans un nouveau plat de verre rempli de PBS froid. Utilisez une pince pour nettoyer EAD de l'anneau et les ganglions lymphatiques, afin de minimiser les contaminations de l'échantillon.
- Détachez l'EAD à partir de la bouche des crochets en coupant la connexion entre les disques d'antenne et la bouche des crochets à l' aide de pinces (Figure 2E). Afin d'éviter la dégradation de l'ARN et des artefacts d'expression génique, limiter le temps de dissection à 30 min. Passez à l'étape 7.
NOTE: Un chercheur expérimenté peut disséquer environ 60 larves en 30 minutes sans compter le temps nécessaire pour la collecte et le lavage des larves. Les rendements totaux d'ARN dépendent de la taille de l'EAD qui varient entre les génotypes et developmentÃl étage. Dissection de 80-100 contrôle EAD paires de la fin du troisième stade larvaire devrait donner 5-8 pg d'ARN total.
- Pour immunocoloration, transférerla disséqué EAD dans un tube de 0,5 ml rempli avec 400 ul de paraformaldehyde à 4% (PFA) fixatif. Utiliser 1,5 ml tube avec 1 ml de PFA pour agrandir l'EAD / complexes du cerveau destinés à marquer d'invasivité.
4. Fixation, immunocoloration et montage
- Fixer des échantillons en PFA fixateur pendant 25 min tout en nutation à la température ambiante. Le temps de fixation peut être prolongée jusqu'à 60 min sans altérer la morphologie des tissus et l'antigénicité de protéines.
- Enlever le fixateur et de lavage des échantillons avec du PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100) à trois reprises pendant 10 min à l'aide d'un nutator. En utilisant un volume suffisant de PBST pour chaque étape de lavage (400 ul / tube 0,5 ml).
NOTE: fixe EAD complexes / cerveau destinés à marquer d'invasivité ne nécessitent pas immunocoloration. signal GFP reste bien visible après fixation. Passez à l'étape 4.4 pour la dissection finale.- Pour une immunocoloration, des tissus de bloc dans 200 ul d'une solution de blocage (PBST avec 0,3% de SAB) pendant 20 minutes avec agitation douce à température ambiante.
- Incuber avec primary anticorps dilués dans 100 ul d'une solution de blocage pendant une nuit à 4 ° C tout en agitant doucement. Se reporter à la première fiche d'anticorps ou de la littérature publiée pour recommandé dilution d'anticorps.
NOTE: La dilution d'anticorps primaire pourrait avoir besoin d'être optimisé. - Après cinq lavages de 10 min dans PBST, tissu tache avec les anticorps secondaires fluorescents dilué dans une solution de blocage en agitant doucement pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C dans l'obscurité.
- échantillons Laver trois fois 10 min dans du PBST.
- Incuber avec primary anticorps dilués dans 100 ul d'une solution de blocage pendant une nuit à 4 ° C tout en agitant doucement. Se reporter à la première fiche d'anticorps ou de la littérature publiée pour recommandé dilution d'anticorps.
- Pour une immunocoloration, des tissus de bloc dans 200 ul d'une solution de blocage (PBST avec 0,3% de SAB) pendant 20 minutes avec agitation douce à température ambiante.
- Remplacer PBST avec 500 pi de solution DAPI-coloration. Pour étiqueter F-actine, ajouter phalloïdine conjuguée à un colorant fluorescent à la solution DAPI-coloration. Après 15 min nutation dans l'obscurité, se laver les tissus une fois pendant 10 minutes avec du PBST.
REMARQUE: l'étiquetage actine F peut être réalisée indépendamment de la coloration DAPI. - Pour l'étape de dissection finale, transférer le tissu de nouveau dans un plat en verre PBS rempli en utilisant un 1 ml pipette. En utilisant les deux paires de pinces clipser hors de la bouche des crochets.
- Séparer les cerveaux qui seront utilisés pour la quantification de l'invasivité de l'EAD en coupant la tige optique comme EAD envahi pourrait entraver l'analyse.
- Placer une goutte de milieu de montage (15 ul d'une 22 mm x 22 mm lamelle couvre-objet) sur un coulisseau objectif. Avec l'aide de forceps conseils, distribuer le milieu dans une couche mince. Transfert EAD, le cerveau ou les complexes EAD / cerveau dans le milieu de montage avec une micropipette P20.
- Utilisez les conseils de forceps ou d'une tige de tungstène pour distribuer des tissus et de redresser la VNC sur la diapositive.
- Pour éviter la formation de bulles lors du montage, d'abord toucher un bord d'une lamelle au milieu de montage, puis abaissez lentement sur le support de montage à l'aide d'une pince. Utilisez de petits morceaux de papier ou de tissu filtrant essuyez pour absorber moyen de montage en excès sur les bords de lamelle.
REMARQUE: DABCO / poly (alcool vinylique) de montage de 4-88 durcisse moyenneà 4 ° C en l'espace d'une heure. Les diapositives peuvent être stockées pendant des mois à 4 ° C.
5. imagerie confocale
- Acquérir des sections et des piles confocales uniques à l'aide d'un microscope confocal équipé de 20X, 40X et 60X objectifs pétroliers.
- Empêcher la saturation du pixel. Utiliser les mêmes paramètres d'acquisition d'image , y compris la résolution de l' image, la puissance d'entrée de laser, gain, offset, trame moyenne, une taille de pas dans un z-series et de maintenir ces paramètres pour tous les génotypes pour permettre des comparaisons d'intensités de pixels entre les différents génotypes 21,22.
NOTE: Pour la visualisation du complexe / du cerveau EAD, générer des projections maximales et coudre, des images voisines respectives. Pour la préparation de l'image finale, utiliser un logiciel de traitement d'image de poste pour l'assemblage du panneau et pour régler la luminosité et le contraste.
6. Quantification des tumeurs invasives
- Définir un système de notation qui va caractériser les différents niveaux de invasivenes tumoraless compte tenu de la répartition spatiale de l'invasion et de la quantité de cellules GFP-positives d'étalement dans le cerveau et VNC. Préparer des fiches d'évaluation pour la documentation (figure 3A).
- Mont au moins 80 fixe les cerveaux intacts pour chaque génotype sur une lame en utilisant 40 ul du milieu de montage par 24 mm x 50 mm lamelle.
- Pour permettre la notation impartiale, poser une partie neutre pour anonymiser les diapositives, de sorte que la procédure de notation est impartiale. Évaluer diapositives anonymisés par deux membres laboratoire indépendamment. Divulguer génotypes seulement après que le comptage est terminé.
- Évaluer le degré de malignité par une notation aveugle des cerveaux montés sous un stéréomicroscope fluorescent équipé d'un jeu de filtres de GFP. Utilisez un marqueur pour marquer les cerveaux qui ont déjà été vus pour éviter le double comptage (figure 3B).
- Calculer le pourcentage de cerveaux qui tombent dans chacune des catégories invasives définies par génotype. Déterminer les s statistiquesignificance en utilisant un test de chi-carré (figure 3C).
7. Isolement de l'ARN, traitement DNase et Contrôle de la qualité
REMARQUE: Tous les réactifs (solutions, plasticware) utilisé dans les étapes suivantes devraient être libres de l'activité RNase. Toujours porter des gants et utiliser une hotte chimique pour le travail avec des solvants organiques.
- Transfert de l'EAD propre avec une pointe P20 micropipette revêtu dans 1,5 ml tube.
- Laissez un évier de tissu au fond du tube, retirez soigneusement PBS et le remplacer par 100 ul de réactif ARN de lyse (suffisant pour un maximum de 140 EAD).
- Lyse tissu par tourbillonnement. A ce stade, les échantillons peuvent être congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C ou directement traitées par un protocole d'isolement d'ARN standard.
NOTE: Des échantillons de génotypes similaires provenant de plusieurs tours de dissection peuvent être regroupés une fois dans l'ARN réactif de lyse. - Remplir le volume d'échantillon à 0,9 ml avec de l'ARN réactif de lyse. Ajouter 0,2 ml de chloroforme et mélanger des échantillons Vigoroisa nt pendant 15 à 20 secondes.
- À la suite de 2 à 3 min d'incubation à température ambiante, centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transfert contenant de l'ARN supérieure incolore en phase aqueuse dans un nouveau tube sans déranger l'interphase. Restez à l'écart de l'interphase, car il contient des protéines et de l'ADN génomique.
REMARQUE: Le volume récupéré doit être d'environ 60% du volume de réactif de lyse de l'ARN utilisé pour l'homogénéisation. - Précipiter l'ARN par addition de 0,5 ml d'alcool isopropylique. Vortexer et incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
- Centrifuger les échantillons à 10000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et laver le culot d'ARN une fois avec 600 ul d'éthanol à 75%. Après un court vortex et centrifugation (10 000 xg pendant 7 min à 4 ° C) jeter tout l'éthanol et laisser le culot d'ARN sécher à l'air pendant 5-10 min placer le tube ouvert sur un tissu propre essuyer.
NOTE: Le culot d'ARN peut être visible comme un petit blanc opaque st /mûr au fond du tube ou invisible. Les gouttes d'éthanol restantes peuvent être soigneusement enlevés avec embout P10 micropipette. - Dissoudre l'ARN dans 50 pi d'eau traitée au DEPC par tourbillonnement ou d'une solution passant quelques fois à travers une pointe de pipette.
- Pour réduire au minimum la contamination par l'ADN génomique, l'ARN total de traiter avec de la DNase en ajoutant 50 ul d'un mélange contenant 1 ul de désoxyribonucléase (2 U / ul) et 10 ul de 10 x tampon de DNase dans l'eau traitée au DEPC. Vortex et centrifuger.
- Incuber les échantillons à 37 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant pendant 30 à 40 min. Après incubation, on ajoute 100 ul d'eau traitée au DEPC dans chaque échantillon.
- Pour inactiver l'activité enzymatique et de l'ARN propre à partir de la DNase, ajouter 200 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) solution, vortex pendant 1 minute et centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 7 minutes à 4 ° C.
- transférer avec précaution la phase aqueuse supérieure contenant de l'ARN dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal (200 pi)de chloroforme, mélanger et répéter l'étape de centrifugation d'en haut.
- Recueillir soigneusement la phase supérieure et à précipiter l' ARN par addition de 1/10 de volume de 3 M d' acétate de sodium, pH 5,2 préparée dans DEPC H 2 O et de 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Mélanger soigneusement par tourbillonnement.
REMARQUE: l'ajout de 0,5 ul de glycogène (20 ug / ul) à un mélange de précipitation permet de visualiser le culot d'ARN. Pour minimiser les pertes d'ARN, utiliser, tubes à faible liaison 1,5 ml microtubes siliconés. - Précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h.
NOTE: L'incubation peut être réalisée pendant une nuit. Les échantillons peuvent être placés à -80 ° C également. - Pellet ARN par centrifugation à 10.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Laver et culot sec suivant la description 7.9.
- Dissoudre l'ARN dans 10-15 pi d'eau traitée au DEPC. ARN de magasin à -80 ° C.
- Déterminer la quantité et la pureté de l'ARN en mesurant la DO à 230 nm, 260 nm et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre. Calculer ARN concentration en appliquant la convention que 1 DO à 260 nm est égale à 40 pg / ml d'ARN.
NOTE: Le rapport A 260/280 de l' ARN «pur» est égal à 2,0 tandis qu'un rapport A 260/230 devrait être dans la gamme de 2,0-2,2. Des échantillons d'ARN avec un rapport A 260/280 compris entre 1,7 et 2,0 conviennent pour des applications en aval telles que la synthèse d'ADNc. Pour la préparation de bibliothèques d'ARNm-seq la qualité et la quantité d'ARN doivent être vérifiées en utilisant un système d'électrophorèse automatisé. Le rapport 28S / 18S doit être supérieure à 1,8.
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Representative Results
Pour démontrer le potentiel de la technique eyFLP-marcm pour générer des correctifs de GFP marquée de génotypes définis dans la drosophile EAD, trois types de clones ont été induits: (1) le contrôle GFP exprimant seulement, (2) les tumeurs malignes exprimant une forme oncogénique de la petite G-protéine Ras (Ras V12) dans un contexte de perte homozygote d'un gribouillis de gène suppresseur de tumeur (Scrib 1), et (3) surcroissance mais non-invasive ras V12 Scrib 1 JNK clones DN, où kinase le jun-N-terminal (JNK) a été inactivé par l' expression de sa forme dominante-négative (figure 4, tableau 1 pour les génotypes). Il a été démontré que le caractère invasif de ras V12 SCRIB 1 tumeurs clonales nécessite une activation aberrante de la signalisation de JNK et de facteurs de sa transcription en aval 10,12,23,24. En outre, V12 Scrib 1 ras drosophile, résultant de l'infiltration de cellules immunitaires (appelées hémocytes) dans l'EAD 14,25.
Pour surveiller les niveaux et la répartition spatiale de l' activité de JNK dans le tissu mosaïque et parmi les tumeurs de génotypes distincts, le transgénique créé, JNK sensible TRE-DsRed journaliste a été utilisé 26. La microscopie confocale de l'EAD disséqué, EAD fixe et / complexes de cerveau a révélé une régulation positive marquée de l'activité du rapporteur TRE-DsRed dans les tissus malins portant Scrib ras V12 1 tumeurs (figure 4B). Le signal de DsRed marqué ras V12 1 Scrib clones EAD (figure 4B) ainsi que des cellules tumorales d' étalement sur les lobes du cerveau et envahissent la VNC (figure 4E, 4F). En revanche, le journaliste activi TRE-DsRedty est restée limitée à une chaîne de cellules étendant à partir du antennaire à la partie de chas des disques de commande (figure 4A). Blocage signalisation JNK a entraîné une diminution spectaculaire du signal de TRE-DsRed dans clonale V12 ras Scrib 1 tumeurs JNK DN (Figure 4C, 4D). Ces données fournissent donc des éléments fonctionnels pour une exigence de JNK signalisation pour activer la réponse transcriptionnelle TRE-dépendante ras maligne V12 SCRIB 1 tumeurs. Un hmlΔ-DsRed journaliste lignée spécifique, conçu pour tracer la drosophile hémocytes 27,28 a montré une accumulation de cellules immunitaires dans les tissus portant maligne V12 ras Scrib 1 tumeurs (figure 5B). En revanche, seuls les hémocytes individuels ou quelques taches hémocytaires localisées ont été détectées dans le contrôle et la V12 Scrib ras 1 JNK DN mosaïque EAD et les tissus du cerveau(Figure 5A, 5C). Immunocoloration avec un anticorps anti-Hemese pan-hémocytes (H2) 29 a confirmé l'identité des cellules immunitaires de cellules positives hmlΔ-DsRed (Figure 5D, 5E). Conformément aux rapports publiés 12,23,24, quantification objective d'invasivité tumorale a corroboré un rôle central de JNK signalisation dans la promotion de l' invasion tumorale dans les lobes du cerveau adjacentes et VNC (figure 3C). Enfin, l'ARN total a été isolé à partir de la mosaïque EAD. Les échantillons ont été soumis soit à qRT-PCR ou analysés sur un système d'électrophorèse automatisé pour la qualité et la quantité. La figure 6A montre significative surexpression de JNK-dépendante de la matrice métalloprotéinase 1 (MMP1) transcription EAD portant ras V12 SCRIB 1 tumeurs clonales malignes, confirmant précédemment 12,24,30,31 résultats publiés. L'évaluation de l'ARN total en utilisant un système d'électrophorèse automatisé a montré tchapeau trois échantillons EAD indépendants avaient un rapport 28S / 18S ci - dessus 1,8 (figure 6B). Cependant, EAD 2 ARN était partiellement dégradé, réfléchi par un frottis sur le gel (Figure 6C). En revanche, EAD 3 échantillon avait une faible concentration. Plusieurs bandes de poids moléculaire plus élevé sur l' image de gel (figure 6B) et de petits pics sur l'électrophorégramme (figure 6C), ont également suggéré la contamination de l' ADN. Ainsi, seulement EAD 1 échantillon serait approprié pour une préparation de la bibliothèque de l'ARNm-seq.
Figure 1: Schéma du système marcm pour la production de mosaïques génétiques dans la drosophile EAD et des applications en aval (A) Le système de marcm permet la génération de patchs clonales avec des lésions génétiques définies dans un type autrement sauvage (hétérozygote).le contexte. L'expression de la FLP sous le contrôle d'un promoteur spécifique du tissu (par exemple, eyeless) catalyse la recombinaison entre les deux éléments FRT flanquant la cassette d'arrêt marqué par un groupe (y) le gène yellow (act> y +> Gal4). Lors du retrait de la cassette STOP, l'ubiquitaire exprimé activateur transcriptionnel Gal4 (act-Gal4) peut entraîner l' expression d'un transgène à base UAS tels que UAS-GFP (également UAS-ras V12). Dans une cellule parentale, cependant, l'activité de Gal4 est bloqué par un répresseur GAL80 dont l' expression est contrôlée par un promoteur de la tubuline (bain-GAL80). Dans la phase G2 du cycle cellulaire, FLP médie l'échange de chromatides soeurs non entre les chromosomes homologues distales des sites FRT. La ségrégation des chromosomes pendant la mitose recombinants donnera naissance à deux cellules filles, l' une étant mutant homozygote pour un locus génomique particulier (par exemple, Scrib
Figure 2: Le tri des larves au troisième stade larvaire et des exemples représentatifs de l' EAD et EAD / complexes du cerveau utilisé pour différentes applications en aval (AB) des micrographies fluorescentes des clones GFP marquée de contrôle portant des larves au troisième stade larvaire induites avec le testeur eyFLP-marcm 82B vert.. (A) représentant une larve de contrôle avec des clones limités aux EAD et du cerveau lobes. (B) Un exemple d'une "larve de léopard" portant des clones GFP-positives dans divers tissus dans tout le corps. Images (C) de fond clair disséqués EAD et complexes (D) EAD / cerveau attachés à la bouche des crochets, et (E) EAD nettoyés de tout tissu étranger , y compris la bouche des crochets. Barres d'échelle = 2 mm (AB) et 500 um (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Quantification de l' invasivité des tumeurs (A) images confocales fluorescentes de cerveaux disséqués à partir ras V12 Scrib 1 larves (7 jours AEL) représentent les exemples réels des quatre qualités différentes de l' invasivité des tumeurs allant de non-invasive (score 0), un lobe du cerveau envahi (Note 1), les deux lobes du cerveau envahi (Note 2) à une invasion tumorale forte avec le tissu clonal couvrant les deux lobes du cerveau et en entrant le VNC (Note 3). Les images sont des projections des sections et des exemples de confocale multiples pour Score 2 et 3 sont cousus à partir de 2 x 2 images confocale. Les barres d'échelle = 100 um. (B) Un exemple d'une lame de microscope anonymisées avec des cerveaux fixes utilisés pour impartialemarquant un stéréomicroscope fluorescent. cerveaux marqués sont marqués avec un stylo pour empêcher l'enregistrement en double. Barre d'échelle = 500 um (C) Par rapport à très envahissante V12 SCRIB ras 1 tumeurs, l' inhibition de la signalisation JNK (V12 SCRIB ras 1 JNK DN) invasion éliminé des cellules clonales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Activation du rapporteur de transcription de TRE-DsRed dans de V12 '1 tumeurs malignes ras clonales SCRIB' est la JNK-dépendante (A. TRE-DsRed journaliste JNK sensible marqué d' une bande étroite de cellules allant de antennaire à une partie de l' oeil (têtes de flèches). (B) L'activité du journaliste TRE-DsRed a été nettement améliorée dans V12 Scrib ras 1 clones GFP-positives par rapport à l'EAD épithélium non clonale environnant. (C) Inhibition de l' activité de JNK a entraîné une nette diminution de la DsRed intensité du signal dans V12 Scrib ras 1 JNK clones DN. (D) Une amélioration supplémentaire du signal DsRed révélé activation non-autonome de JNK signalisation dans les cellules entourant les V12 Scrib ras 1 JNK clones DN. (E) Le jour 8 AEL, V12 Scrib ras 1 cellules overgrew l'ensemble de l' EAD et répartis sur les lobes du cerveau à la VNC (flèche). (F) Les cellules clonales envahissent le VNC (close-up de la région marked par la flèche E) ont été enrichis pour le signal DsRed. (AC) Afficher les projections des sections confocales multiples, (E) est cousue de 3x3 images confocales et (D, F) représentent la section unique. Barres d'échelle = 50 pm. EAD, yeux / disque antennaire; BL, le lobe cérébral; VNC, ventrale cordon nerveux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Spécifiques Lineage HML de Δ -DsRed journaliste transgénique révèle l' enrichissement de ras V12 Scrib 1 hémocytes associé à une tumeur (A) Dans le contrôle EAD, hmlΔ-DsRed marqué par un rapporteur hémocytaire clu stres sont piégés dans les indentations de l'œil et de l'épithélium antennaire. (B) des tissus EAD et le cerveau composé de V12 Scrib ras 1 tumeurs GFP marquée a montré une augmentation du nombre de hémocytes dispersés sur tout le tissu clonal. (C) Le nombre de hémocytes associé considérablement diminué lors de l' inhibition de la signalisation JNK dans V12 Scrib ras 1 JNK DN de tissu de la mosaïque. Hémocytes positifs (DE) HmlΔ-DsRed ont également été marquées avec un H2-anticorps qui détecte le pan-hémocytaire marqueur Hemese. (AC) Afficher les projections des sections confocales multiples, (A) est cousu de 2 x 2 et (BC) sont cousus à partir de 3 x 3 images confocale. (DE) représentent des sections simples. Les barres d'échelle = 100 um (AC) et 10 pm (DE). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:.. Évaluation de la quantité et de la qualité de l' ARN total isolé à partir EAD disséqués (A) Un exemple représentatif des résultats qRT-PCR en utilisant quatre répétitions biologiques pour chaque génotype niveaux de transcription de MMP1 ont été normalisées à rp49. Plier les changements dans l' expression des gènes ont été calculées en utilisant la méthode de la courbe standard par rapport 32. Les données sont des valeurs moyennes ± sem; *** P <0,001 en utilisant apparié à deux queues test t de Student avec une variance inégale. (B, C) Évaluation de la qualité de l' ARN total et la quantité en utilisant un système d'électrophorèse automatisé. L'image de gel virtuel (B) montre les deux grandes bandes de 18S et 28S ARNr qui correspondent aux pics bien définis sur électrophérogrammes (C). la contamination de l'ADN et la dégradation de l'ARN comme se traduisent parMear (pointes de flèches) et des bandes extranumerary et pics (flèches). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Fly souches | Source / Commentaires |
| eyFLP1; acte> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, baignoire-GAL80 | eyFLP-marcm 82B Vert Tester 11 |
| w; V12 UAS-ras; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; V12 UAS-ras; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | cette étude, w; hmlΔ-DsRed de Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | cette étude |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | cette étude |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | cette étude, w; TRE-DsRed de Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | cette étude |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | cette étude |
Tableau 1: Résumé des lignes de Drosophila utilisées dans cette étude.
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Discussion
Les techniques pour générer des mosaïques génétiques chez la drosophile sont parmi les outils les plus sophistiqués pour l' analyse et la manipulation de la fonction des gènes 33. Le système eyFLP-marcm a prouvé puissant et robuste , car elle permet l'induction de marqués visuellement, clones génétiquement définis d'une manière spatialement restreinte, à savoir, dans les tissus où l'activateur eyeless est actif 9,18. Ceci est particulièrement important lorsque les lésions génétiques multiples sont combinées dans les mêmes cellules. Bien que ces patchs très aberrants permettent le développement larvaire lorsque restreint à l'EAD et le cerveau neuroepithelia, ils peuvent provoquer une létalité quand dispersés à travers le corps de la larve comme dans le cas de FLP (hsFLP) clones choc thermique contrôlée. De manière significative, l'induction de clones dans l'épithélium mouche EAD dans laquelle activée oncogènes se combinent avec la perte de suppresseurs de tumeurs récapitule l'émergence et la progression des tumeurs épithéliales solides dans certains cancers humains. However, le système a aussi ses limites qui seront brièvement abordés. Étant donné que les insectes ont un système circulatoire ouvert, véritables métastases comme observé dans les cancers humains ne se produisent pas. Par conséquent , le processus complexe de la dissémination métastatique ne peut pas être fidèlement modélisée chez la drosophile. Néanmoins, les tumeurs EAD tels que les V12 Scrib ras 1 clones font afficher les propriétés malignes comme ils décomposent la membrane basale entourant l'EAD et envahissent le cerveau adjacent 11,12,31. Le degré d'agressivité de la tumeur peut être quantifiée et comparée entre les différents génotypes tels que décrits dans cette étude. Il est également important de noter que la présence de lésions génétiques spécifiques dans la mosaïque EAD pourrait affecter le calendrier de développement et la durée de la croissance larvaire. Staging des larves déterminera si l'analyse des tissus de la mosaïque sera effectuée à l'aide d'animaux de la même scène chronologique ou de développement. Exécution d'une expérience pilote pour évaluer l'impact d'unnouveau génotype clonal EAD sur le calendrier de développement est souhaitable.
Il y a des limites techniques aussi. Tout d'abord, le nombre de génotypes différents clonales qui peut être construit avec l'outil eyFLP-marcm est grande, mais pas infinie. Par exemple, en combinant deux allèles mutants qui résident sur différents chromosomes est entravée par une faible efficacité de la recombinaison sur les deux chromosomes simultanément, et des gènes situés sur le petit quatrième chromosome sont généralement inaccessibles. Gene knockdown utilisant l'ARNi transgénique est une solution de rechange. Cependant, il est important de réaliser que les transgènes ne sont pas exprimés immédiatement après la recombinaison mitotique - pas jusqu'à ce que le répresseur GAL80 est dégradée. L'activité du système d'expression / UAS Gal4 peut être améliorée par des larves de plus en plus à 29 ° C. Il est toutefois important de garder à l'esprit que la température élevée affecte divers paramètres de développement, physiologiques et moléculaires, y compris le taux de croissance, le calendrier de développement, Metabolism et expression génique 34-37. Ainsi, des adaptations aux protocoles fournis tels que la mise en scène des larves ou le nombre d'EAD disséqués pour transcriptome profilage seraient nécessaires.
Les testeurs eyFLP-marcm ne sont pas parmi les souches les plus saines. Les multiples transgènes dans un compromis de génome voler de remise en forme et de la fécondité. Ces stocks requièrent une attention particulière doit être maintenue et élargie pour les grandes collections de femelles vierges. Comme indiqué dans cette étude, la ligne de testeur marcm 82B Vert 11, bien que viable lorsque homozygote, est génétiquement instable. Cela est évident à partir de l'apparition spontanée de «larves de léopard" qui affichent ectopiques, clones GFP marquée au sein de divers tissus polyploïdes y compris l'intestin, trachées, graisse du corps, et l'épiderme larvaire. Ce phénomène se produit dans toute traverse indépendante du génotype paternel. Nous supposons que les patchs GFP ectopiques résultent de incontrôlée, recombinaison stochastique entre les deux FRLes sites T dans la cassette FLP-out, ce qui provoque le retrait du + marqueur jaune et la "cassette STOP". Dans les tissus polyploïdes, la tubuline promoteur-driven GAL80 répresseur pourrait être insuffisante pour bloquer l'activité Gal4. La présence de cellules génétiquement modifiées dans les tissus autres que l'EAD et le cerveau pourrait déclencher des signaux systémiques qui pourraient avoir une incidence sur le comportement des clones expérimentaux. Ces «larves de léopard» doivent donc être exclues des analyses. De plus, nous avons régulièrement rétablir le testeur marcm 82B vert à partir de croisements entre hommes et femmes célibataires.
Malgré les écueils mentionnés ci-dessus, les applications du système eyFLP-marcm pour étudier les fonctions des gènes et les interactions entre les tumeurs clonales et leur environnement sont multiples. Présentation des / systèmes d'expression binaire UAS-Gal4 indépendants tels que LexA / LexOp 38 ou médicament QF contrôlable / QUAS / QS 39,40 fournirait une amende de contrôle sur transgène expression et / ou le marquage simultané et la manipulation des différentes populations de cellules, notamment les cellules épithéliales, non clonales clonale et les hémocytes. Ces tissus mosaïque pourraient être à nouveau traitées selon les protocoles décrits ici.
La méthode de dissection de complexes mosaïque EAD et EAD / cerveau du troisième stade larvaire (section protocole n ° 3) peut être appliqué aux premiers stades de développement aussi bien. Fait important, le protocole pour les complexes EAD / cerveau permet la récupération de l'aile, haltère et jambes disques imaginaux. Devraient-ils être utilisés pour l'isolement de l'ARN (sections de protocole 3.3.2 et 7), le disque d'intérêt doit être nettoyé de tissu étranger et traitées de manière similaire à l'EAD. Compte tenu de leur petite taille, le nombre de haltère et de la jambe disques collectés devrait être porté à acquérir une quantité suffisante d'ARN.
Le protocole d'extraction d'ARN total à partir EAD (section protocole n ° 7) est basée sur l'ARN réactif de lyse provenant de différentes v commercialeendors (voir la liste des matériaux / équipement). Le succès global de la procédure dépend principalement de: (i) ayant un nombre suffisant de larves, (ii) étant rapide et précis tout en disséquant, et (iii) le maintien des échantillons exempts de RNases. Garder l'espace de travail et les instruments propres, le port de gants, en utilisant ware et solutions en plastique RNase-free, et de garder des échantillons sur la glace tous réduire la dégradation de l'ARN. Pour empêcher la contamination de l'ARN avec un ADN génomique qui pourraient ne pas être complètement éliminé par le traitement à la DNase (section Protocole 7,11), il est essentiel d'éviter l'interphase lors de la collecte de la phase aqueuse pour la première fois (section 7.6 Protocole). À la fois la contamination de l' ADN et de dégradation de l' ARN peuvent être révélées par l'analyse des échantillons sur un système automatisé d'électrophorèse (figure 6B, 6C). Le protocole d'isolement de l'ARN a une application plus large. Il a été utilisé avec succès pour l'extraction d'ARN à partir de larves de l'ensemble à différents stades de développement, des adultes, et diversles organes larves. L'ARN obtenu est adapté à la fois qRT-PCR et l' échelle du génome analyse du transcriptome par l' ARNm-seq 20,24,41,42. Par rapport à qRT-PCR qui quantifie des dizaines d'ARNm sélectionnés au plus, le séquençage de l'ARNm impartiale permet les analyses d'expression du génome entier. Ainsi, on peut comparer les signatures transcriptomiques entières de tumeurs induites par des lésions génétiques spécifiques à des étapes distinctes de 24 tumorigenèse. Il est important de garder à l'esprit que l'ARN provient des disques entiers, de sorte que les résultats ne seront pas seulement refléter les changements dans les clones, mais aussi dans les environs, les tissus non-clonal. Exécution cellule fluorescente activate (FACS) sur dissociée mosaïque EAD en adaptant les protocoles disponibles 43,44 pourraient être appliquées pour déterminer la signature transcriptionnelle de populations cellulaires spécifiques, par exemple, clonale (GFP +) et non-clonal (GFP -) des cellules.
Le protocole de fixation et immunocoloration décrit ici est adapté pour simulvisualisation tané de protéines d'intérêt avec des anticorps et l'activité des journalistes transgéniques spécifiques. Tant le signal de GFP de marquage des cellules clonales et DsRed fluorescence produites par l'un des deux reporters transgéniques utilisées dans cette étude sont conservés tout au long de la fixation et l'immunocoloration et peut être directement visualisée par microscopie confocale. Cependant, les anticorps dirigés contre les protéines fluorescentes peuvent amplifier l'intensité du signal. De même, l' utilisation d'un anticorps anti-β-galactosidase , va faciliter la détection des reporters transgéniques basés sur le gène lacZ bactérien. Activités de journaliste relatives peuvent être évaluées en mesurant les intensités de pixel relatives des clones par rapport à l' aide de tissu non-clonal d' image logiciel d'analyse (par exemple, FIDJI, ImageJ). Lorsque l'on compare l' activité de journaliste entre les différents génotypes clonales, les paramètres d'acquisition d'image doivent être maintenues constantes (section Protocole 5 et références 21,22). Bien que le protocole fonctionne bien avec beaucoup d'un autrentibodies, il peut être nécessaire d'optimiser les concentrations d'anticorps recommandées. Les modifications peuvent également être nécessaires dans la fixation du temps, le type et la concentration de détergent (Triton X-100, Tween-20, saponine) et fixateur (8% PFA, 4% de formaldéhyde, EtOH).
Contrairement aux protocoles décrits ci-dessus, la quantification de l'invasivité des tumeurs est limitée au troisième stade larvaire et le complexe EAD / cerveau. Néanmoins, sa raison générale peut demander à des études quantitatives où biais cognitif doit être évité. La méthode nécessite rigueur. Comme la malignité de la tumeur augmente dans le temps, il est essentiel de comparer les larves du même âge (par exemple, 7 ou 8 jours après la ponte des œufs). Avec le temps une tumeur clonale peut envahir massivement, mais les cellules tumorales peut rester au sein de l'EAD. L'étape dans laquelle les cerveaux sont séparés de l'EAD (section 4.4.1 Protocole) est donc essentiel d'éviter nombre de faux positifs envahissant. Montage des cerveaux avec l'EAD fixé sera Flatten tissus, provoquant l'EAD envahi pour couvrir les structures du cerveau et ainsi prévenir toute quantification. Idéalement, on voudrait capturer le processus invasif directement dans la larve vivante. journalistes transgéniques pour visualiser les populations et les tissus cellulaires impliqués sont disponibles et peuvent être combinées avec le système eyFLP-marcm. Malheureusement, le processus invasif prend plusieurs heures à plusieurs jours, un laps de temps qui est incompatible avec le maintien des larves vivantes tout.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
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