Summary
Denne protokollen demonstrerer hvordan å generere fluorescerende merket, genetisk definerte klonale svulster i Drosophila øye / antennal imaginal plater (EAD). Den beskriver hvordan du kan dissekere EAD og hjernen fra den tredje instar larver og hvordan å behandle dem til å visualisere og kvantifisere genuttrykk endringer og tumor invasivitet.
Introduction
Kreft representerer en av de mest genetisk heterogen gruppe av sykdommer hvis forekomst og dødelighet er dramatisk økende, spesielt blant eldre over hele verden. Cancer stammer klonalt fra en tumor-initiering celle som unnslipper iboende tumor-suppressor-mekanismer og deler ut av kontroll. Den gradvise akkumulering av genetiske lesjoner som i fellesskap fremmer vekst, spredning og bevegelighet mens hemme død og differensiering forvandler den første godartet overvekst i en svært ondartet, metastatisk og dødelig svulst. Det er blitt klart at i tillegg til genetiske endringer, tumorprogresjon krever endringer i den omgivende stroma og krysstale mellom tumor og multiple celletyper (for eksempel fibroblaster, immun og endotelceller) i dets mikromiljøet. Forstå de molekylære prinsippene malign transformasjon inkludert tumor-stroma interaksjoner er av stor betydning for utvikling av foresjon og tidlig screening strategier, samt nye og effektive behandlinger for å bekjempe kreft metastasering og resistens.
Frukten fly Drosophila melanogaster har blitt et attraktivt system for kreftforskning 1-4 på grunn av sin raske generasjonstid, bemerkelsesverdig bevaring av signale noder mellom fluer og mennesker, begrenset genetisk redundans og vell av avanserte genetiske verktøy som letter manipulering av nesten alle genet i en midlertidig og romlig begrenset måte. Genetisk definerte tumorer av forskjellig malignitet kan reproduserbart konstruert i Drosophila ved å innføre gevinst-og tap-av-funksjon mutasjoner i en undergruppe av progenitorceller i en ellers vill-type vev ved å bruke den teknikk MARCM 5. Den MARCM verktøy kombinerer FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Recognition Target) -mediert mitotisk rekombinasjon 6 med FLP-out 7 og Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 mål genetekspresjonssystemer 9. Med denne metoden ekspresjon i alle UAS-baserte transgenet, inkludert onkogen eller fluorescerende protein cDNA eller innovervendte DNA gjentar for dsRNA-induserte genet Slå, vil være begrenset til en klon av celler som har mistet en bestemt genetisk locus og en Gal4 repressor på grunn av rekombinasjon (figur 1A). Klonale patcher merket med grønt fluorescerende (GFP) eller rød fluorescerende proteiner (f.eks RFP, DsRed, mCherry) lett kan spores gjennom hele utviklingen, isolert og analysert. Viktigere, kan deres atferd sammenlignes direkte til tilstøtende villtype vev. Således spørsmål relevant til celleautonome og ikke-autonome virkninger av genetiske lesjoner kan hensiktsmessig studeres. I likhet med pattedyr, bare kloner der flere onkogene lesjoner kombineres bli ondartet i Drosophila og rekapitulere sentrale kjennetegnene ved pattedyr kreft. De overproliferate, unngå apoptose, indusere betennelse, bli udødelig og invasive, slutt å drepe verten 10-17.
Her beskriver vi en protokoll for å generere genetisk definerte klonale svulster i øyet / antennal og hjernevev av Drosophila larver bruker MARCM teknikk. Fremgangsmåten baserer seg på en MARCM tester lager som uttrykker gjær FLP rekombinase under kontroll av den eyeless forsterker (eyFLP) 18,19. På denne måte blir GFP-merket kloner generert på både peripodial og søyle epitelet i EAD og neuroepithelium av hjernen gjennom embryonale og larvestadiet (figur 1A, B og referanse 20). Kloner lett kan følges helt til voksen alder som EAD utvikler seg til den voksne øyet, antenne og hodet kapsel mens neuroepithelium gir opphav til neuroblasts som produserer differensierte optiske lobe nerveceller.
For å lette omfattende molekylær, funksjonell og fenotypisk karakterisering av mosaikk vev, vi deskriver en protokoll for disseksjon av EAD og hjernen fra den tredje instar larver og skissere hvordan å behandle dem i tre forskjellige programmer: (i) påvisning av transgene fluorescerende reportere og farging, (ii) kvantifisering av tumor invasivitet og (iii) analyse av genuttrykk endres ved hjelp av en kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) eller en high-throughput mRNA sekvensering (mRNA-seq) (figur 1C).
Den immunofarging protokollen kan brukes til å visualisere en hvilken som helst protein av interesse sammen med et spesifikt antistoff. Transgene fluorescerende transkripsjons reportere gi enkel og presis spatiotemporal informasjon om aktiviteten til en bestemt signalveien. Cell-avstamning spesifikke journalister, på den annen side, reflektere kvalitative og kvantitative endringer i celle populasjoner innenfor mosaikk vev og blant svulster i forskjellige genotyper. Kvantifisering av invasiv atferd letter sammenligningen av tumor malignitet mellom genotypes. Endelig protokollen beskriver innsamling og behandling av mosaikk EAD for RNA isolering er egnet for både små og store nedstrøms applikasjoner som revers transkripsjon fulgt av henholdsvis QRT-PCR og genom-wide mRNA-seq,. De kvalitative og kvantitative data fra disse analysene gir ny innsikt i den sosiale atferden til klonale svulster. Dessuten produserer de et solid grunnlag for funksjonelle studier på rollen til enkelte gener, genetiske nettverk og svulstens mikromiljø i ulike stadier og aspekter av tumorigenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dette arbeidet utnytter eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, badekar-Gal80 MARCM 82B Grønn tester linje 11. Kryssing av MARCM 82B Grønne tester jomfruer til hanner av stammer som w; UAS-en; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotype vil gi avkom som mitotisk rekombinasjon vil oppstå mellom de rette armer av 3. homologe kromosomer. På denne måten vil kloner homozygote mutante genet for c plassert distalt til den FRT82B området bli generert innenfor den EAD og hjernen neuroepithelium. Disse kloner vil uttrykke GFP, transgen en og dsRNA for genet b (figur 1A). Ulike eyFLP-MARCM tester linjer for rekombinasjon på X, 2L, 2R, 3L og 3R er etablert og er tilgjengelig i fly samfunnet.
1. Fly Handling, Kors, og Staging
- Vis den aktuelle MARCM testeren lager ved romtemperatur ved å fylle flere bottles samtidig. Vend de voksne i nye flasker hver 2-3 dager så at nok jomfruer kan samles for etterfølgende innlegg.
MERK: Ved innsamling av jomfruer, unngå langvarig eksponering for CO 2, da dette kompromitterer kvinnelig fruktbarhet. - Avhengig av omfanget av forsøket, satt opp fly kors i ampuller som bruker minst 10 MARCM tester jomfruer og 4 hanner (f.eks for avbildning av fluorescerende reportere og farging) eller i flasker med minst 30 jomfruer og 10 menn (for eksempel for RNA-isolering og kvantifisering av invasivitet).
- Heve avkom ved 25 ° C under en lang dag 16 t / 8 timers lys-mørke-syklus. Flip foreldre til nye hetteglass / flasker hver 24 time for å lette reproduserbar iscenesettelse av larver og for å hindre overbefolkning.
MERK: Starter på dag 6 etter egglegging (AEL), slutten av tredje stadium kontroll larver stopp fôring, begynner vandrende og skriv pupariation. I motsetning til dette, kan utbruddet av larve-pupal overgang være utenlagt eller ikke-eksisterende i larver med EAD peiling hyperplastiske eller ondartede klonale svulster.
2. Samle Tredje Instar Larver
- For farging, samle 20 slutten av tredje stadium larver (vandrende på veggen og de av en tilsvarende kroppsstørrelse fra mat). Bruk pinsett for å forsiktig velge larver fra ampullen eller flasken, og overføre dem til et embryo glassform fylt med fosfatbufret saltløsning (PBS).
- For RNA-isolering og kvantifisering av invasivitet, samle minst 80 sen tredje instar larver (vandrer på veggen og de av en tilsvarende kroppsstørrelse fra mat). Bruk en skvett flaske til å sprute PBS til en flue flaske som inneholder larver til overflaten er dekket.
- Bløt de øverste lagene av mat med en slikkepott og hell maten mash inneholder larver i en petriskål. Bruk pinsett, forsiktig plukke larver og overføre dem til et embryo glassfat fylt med PBS.
- Vask larver med PBS until alle gjenværende mat er fjernet. Inspiser larver under fluorescerende stereomikroskop med 8 til 16X forstørrelse å forkaste alle "leopard larver" som utfører tilfeldige GFP-positive stedene i hele larvekroppen (figur 2A, 2B og se Diskusjon Avdeling).
MERK: For RNA isolering inkluderer nest siste vasketrinn i 70% EtOH i 1 min. - Sett fatet inneholder valgte larver i PBS på is inntil disseksjon. Fremgangsmåte larver i løpet av 30 min for å unngå uheldige virkninger av kulde og sult.
3. Disseksjon av larver
- For å dissekere EAD under en stereomikroskop, bruke en pinsett til å trykke forsiktig den midtre delen av larven mot glassfat bunnen. Med andre pinsett, ta tak larve munn kroker og dra dem bort fra kroppen (figur 2C).
MERK: Trekkraften er ofte tilstrekkelig til å bryte de optiske stilker forbinder EAD pair til hjernen fliker. Hvis hjernen eller dens deler bo festet til EAD og deres tilstedeværelse er ikke ønskelig for videre søknader, kuttet de optiske stilker med hjelp av de to parene med tang. For invasive svulster (f.eks ras V12 SCRIB 1) blir sammenhengen mellom EAD og hjernelappene stadig skjult med tiden av gjengroing og migrere klonale celler.- For å fremstille EAD / hjerne-komplekset med en intakt det ventrale nervesystemet (VNC) (figur 2D), bruk tang for å kutte en larve i midten av kroppen. Kast den bakre halvdelen.
- Hold fremre halvdel av larvekroppen mellom tuppen av en pinsett, snu larven innsiden ut ved å skyve i munnen kroker med tuppen av den andre pinsett og ved å rulle skjellaget over den med det første tang par.
- Bruk pinsett forsiktig fjerne alle unødvendige vev (f.eks, spyttkjertler, fett kroppen, og gut) og samtidig la EAD par ellerEAD / hjerne kompleks tilhørende munnen kroker. Greie munnen kroker fra overliggende skjellaget. Frigjør VNC ved å skille aksonal anslag som strekker seg til kroppens muskler og epidermis (Tall 1B, 2C, 2D).
MERK: munn kroker gjør det trygt manipulering av vev med pinsett og legge til rette for mer effektiv synker og enkel gjenkjenning av vev under vask. Dissekert EAD endring morfologi relativt fort når holdt unfixed i PBS. Begrens disseksjon tid til 20-30 min. - For å overføre vev, belegge en P20 mikropipette spissen ved pipettering det gjenværende legemet rammer flere ganger opp og ned. For å overføre større EAD / hjerne komplekser, kutt P20 mikropipette spissen med saks.
MERK: Belegget prosedyren er avgjørende for å hindre stikker og tap av dissekert vev under overføring. Anvendelse av en mikropipette P20 minimerer overføringen av PBS inn i fikseringsløsningen, noe som begrenser uønsket fortynning.- For farging, overføredissekert EAD inn i en 0,5 ml rør fylt med 400 ul 4% paraformaldehyde (PFA) fiksativ. Bruk 1,5 ml rør med 1 ml PFA for større EAD / hjerne komplekser ment for scoring av invasivitet.
FORSIKTIG: PFA er svært giftig. Bruk vernehansker og klær. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. - For RNA-isolering overføre dissekert EAD inn i en ny glassform fylt med kald PBS. Bruk pinsett til å rense EAD fra ringen og lymfekjertler, for å minimalisere prøve forurensninger.
- Løsne EAD fra munnen kroker av kuttet forbindelsen mellom antenne plater og munn kroker ved hjelp av tang (figur 2E). For å unngå RNA degradering og genekspresjon gjenstander, begrense disseksjon tid til 30 min. Gå videre til trinn 7.
MERK: En erfaren forsker kan dissekere ca 60 larver i 30 min med unntak av tiden som er nødvendig for larver innsamling og vasking. Total RNA utbytter avhenge av EAD størrelse som varierer mellom genotyper og developmentâl etapper. Disseksjon av 80-100 kontroll EAD pairer fra slutten av tredje stadium larver bør gi 5-8 mikrogram total RNA.
- For farging, overføredissekert EAD inn i en 0,5 ml rør fylt med 400 ul 4% paraformaldehyde (PFA) fiksativ. Bruk 1,5 ml rør med 1 ml PFA for større EAD / hjerne komplekser ment for scoring av invasivitet.
4. Reparasjon, Farging, og Montering
- Feste prøver i PFA-fikseringsmiddel i 25 minutter mens vipp ved romtemperatur. Fikseringstiden kan forlenges opp til 60 minutter uten å endre vev morfologi og antigenisiteten av proteiner.
- Fjern de festing og vaskeprøver med PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) tre ganger i 10 minutter ved hjelp av en nutator. Bruk tilstrekkelig volum av PBST for hvert vasketrinn (400 pl / 0,5 ml rør).
MERK: Fast EAD / hjerne komplekser ment for scoring av invasivitet ikke krever farging. GFP signal er fortsatt godt synlig etter fiksering. Fortsett til trinn 4.4 for den endelige disseksjon.- For farging, blokk vev i 200 ul blokkeringsoppløsning (PBST med 0,3% BSA) i 20 minutter med forsiktig omrøring ved romtemperatur.
- Inkuber med primAry antistoff fortynnet i 100 ul blokkeringsoppløsning over natten ved 4 ° C under forsiktig risting. Se i primært antistoff dataarket eller publisert litteratur viser anbefalt antistoff fortynning.
MERK: Den primære antistoff fortynning må kanskje være optimalisert. - Etter fem 10 min vaskinger i PBST, flekk vev med de fluorescerende sekundære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning under forsiktig rysting i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C i mørket.
- Vask prøver tre ganger 10 min i PBST.
- Inkuber med primAry antistoff fortynnet i 100 ul blokkeringsoppløsning over natten ved 4 ° C under forsiktig risting. Se i primært antistoff dataarket eller publisert litteratur viser anbefalt antistoff fortynning.
- For farging, blokk vev i 200 ul blokkeringsoppløsning (PBST med 0,3% BSA) i 20 minutter med forsiktig omrøring ved romtemperatur.
- Erstatt PBST med 500 mL av DAPI flekker løsning. For å markere F-aktin, legge phalloidin konjugert til et fluorescerende fargestoff til DAPI flekker løsning. Etter 15 min nutasjon i mørket, vaske vevet en gang i 10 minutter med PBST.
MERK: F-aktin merking kan utføres uavhengig av DAPI farging. - For den endelige disseksjon trinnet, overføres vevet tilbake inn i en PBS-fylte glassform ved anvendelse av en 1 ml pipette. Ved hjelp av de to parene av tang klippe av munnen kroker.
- Skill hjernen som vil bli brukt for kvantifisering av invasivitet fra EAD ved å kutte den optiske stilken som forvokst EAD kan hemme analysen.
- Plassere en dråpe av monteringsmedium (15 ul av en 22 mm x 22 mm dekkglass) på en objektiv lysbilde. Med hjelp av tenger tips, fordele mediet inn i et tynt lag. Overfør EAD, hjerne eller EAD / hjerne komplekser inn i monteringsmedium med en P20 mikropipette.
- Bruk tang tips eller en tungsten stang å distribuere vev og rette ut VNC på lysbildet.
- For å unngå dannelse av bobler mens monterings, første touch-ene kanten av et dekkglass til montering medium og deretter sakte lavere på monteringsmedium ved hjelp av tang. Bruke små biter av filterpapir eller vev tørk for å absorbere overskudd av monterings medium rundt dekk kantene.
MERK: DABCO / Poly (vinyl alkohol) 4-88 monteringsmellom stivnerved 4 ° C i løpet av en time. Lysbilder kan lagres i månedsvis ved 4 ° C.
5. Confocal Imaging
- Erverve enkelt confocal seksjoner og stabler ved hjelp av en konfokal mikroskop utstyrt med 20X, 40X og 60X olje mål.
- Forhindre pixel metning. Bruk samme image oppkjøpet parametere inkludert bildeoppløsning, laser inngangseffekt, gain, offset, ramme i snitt, et skritt størrelse i en z-serie og vedlikeholde disse innstillingene for alle genotyper for å tillate sammenligninger av pixel intensiteter mellom ulike genotyper 21,22.
MERK: For visualisering av EAD / hjerne kompleks, generere maksimal anslag og sy respektive, nabo bilder. For endelige bildet forberedelser, bruke etter bildebehandling for panel montering og for å justere lysstyrke og kontrast.
6. Kvantifisering av Tumor Invasivitet
- Definer en scoring system som vil prege de ulike nivåene av kreft invasiveness vurderer den romlige mønster av invasjon og mengden av GFP-positive celler som sprer seg inn i hjernen og VNC. Forbered evaluering ark for dokumentasjon (figur 3A).
- Montere minst 80 fast intakte hjerne for hver genotype på en lysbilde ved hjelp av 40 ul av det monteringsmedium per 24 mm x 50 mm dekkglass.
- Å tillate objektiv score, spør en nøytral part å anonymisere lysbildene, slik at bedømmelse er objektivt. Vurdere anonymiserte lysbilder av to lab medlemmer uavhengig. Avsløre genotyper bare etter opptellingen er ferdig.
- Vurdere graden av malignitet av en blind scoring av monterte hjernen under en fluorescerende stereomikroskop utstyrt med en GFP filter sett. Bruk en markør for å merke hjerner som er allerede så for å unngå dobbelttelling (figur 3B).
- Beregn prosentandelen av hjernen som faller inn i hver av de definerte invasive kategorier per genotype. Bestem de statistiske significance bruker en chi-kvadrat test (Figur 3C).
7. RNA Isolation, DNase behandling, og kontroll
MERK: Alle reagenser (løsninger, plasticware) som brukes i de neste trinnene skal være fri for RNase aktivitet. Bruk alltid hansker og bruke en kjemisk hette for arbeid med organiske løsemidler.
- Overfør ren EAD med en belagt P20 mikropipette spissen inn 1,5 ml tube.
- La vev synke til bunnen av røret, fjern forsiktig PBS og erstatte den med 100 ul RNA-lysis-reagens (tilstrekkelig for opp til 140 EAD).
- Lyse vev ved virvling. På dette punktet, kan prøvene være dypfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C eller direkte behandlet med en standard RNA isolering protokoll.
MERK: Prøver av lignende genotyper fra flere disseksjon runder kan samles en gang i RNA lysereagensen. - Fyll prøvevolumet til 0,9 ml med RNA lysis reagens. Legg 0,2 ml kloroform og blandes prøvene Vigorously i 15-20 sekunder.
- Etter 2 til 3 minutters inkubering ved romtemperatur, sentrifuger prøvene ved 10 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Overfør fargeløs øvre vandige fase inneholdende RNA inn i et nytt rør uten å forstyrre interfase. Hold deg unna inter som den inneholder proteiner og genomisk DNA.
MERK: gjenvinnes Volumet bør være omtrent 60% av volumet av RNA lyse reagens som anvendes for homogenisering. - Utfelling av RNA ved å tilsette 0,5 ml isopropylalkohol. Vortex og inkuber prøvene ved romtemperatur i 10 min.
- Sentrifuger prøvene ved 10 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten og vask det RNA-pellet en gang med 600 ul 75% etanol. Etter en kort vortex og sentrifugering (10 000 x g i 7 min ved 4 ° C) forkaste alle etanol og la den RNA-pelleten lufttørke i 5-10 min plassere det åpne rør på en ren vev tørke.
MERK: RNA pellet kan være synlig som en liten ugjennomsiktig / hvit stmoden ved bunnen av røret eller usynlig. De resterende etanol dråper kan fjernes forsiktig med P10 mikropipette tips. - Løs opp RNA i 50 pl DEPC-behandlet vann ved å virvle eller passerer løsning noen ganger gjennom en pipette.
- For å minimere forurensning med genomisk DNA, behandle total RNA med DNase ved å tilsette 50 ul av en blanding som inneholder 1 mL av DNase (2 U / mL) og 10 ul 10x DNase buffer i DEPC-behandlet vann. Vortex og spinne ned.
- Inkuber prøvene ved 37 ° C i et vannbad eller en varmeblokk i 30 til 40 min. Etter inkubering tilsett 100 ul DEPC-behandlet vann inn i hver prøve.
- For å inaktivere den enzymatiske aktivitet og ren RNA fra DNase, tilsett 200 ul fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) løsning, vortex i 1 minutt og sentrifuger prøvene ved 10 000 x g i 7 min ved 4 ° C.
- overføre nøye den øvre vandige fase inneholdende RNA i et nytt rør. Legg likt volum (200 ul)kloroform, bland og gjenta sentrifugeringstrinn ovenfra.
- Samle nøye den øvre fase og presipitere RNA ved å tilsette 1/10 volum av 3 M natriumacetat, pH 5,2 fremstilt i DEPC H2O og 2,5 volumer 100% etanol. Bland godt ved virvling.
MERK: Legge 0,5 mL glykogen (20 ug / ul) til en utfelling mix bidrar til å visualisere RNA pellet. For å minimere RNA tap, bruke silikoniserte, lav-bindende 1,5 ml mikrosentrifugerør. - Presipitere RNA ved -20 ° C i minst 1 time.
MERK: Inkuberingen kan bli utført over natten. Prøvene kan plasseres ved -80 ° C i tillegg. - Pellet RNA ved sentrifugering ved 10 000 xg i 30 min ved 4 ° C. Vask og tørk pellet etter beskrivelsen i 7.9.
- Løs opp RNA i 10-15 pl DEPC-behandlet vann. Oppbevar RNA ved -80 ° C.
- Bestemme mengden og renheten av RNA ved å måle OD ved 230 nm, 260 nm og 280 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Beregn RNA concentration ved å anvende konvensjonen at en OD ved 260 nm er lik 40 mikrogram / ml RNA.
MERK: Forholdet A 260/280 av "rene" RNA er lik 2,0, mens en A-260/230-forholdet bør være i området 2,0-2,2. RNA prøver med en A-260/280-forhold mellom 1,7 og 2,0 er egnet til nedstrøms applikasjoner som cDNA-syntese. For utarbeidelse av mRNA-seq bibliotekene bør sjekkes kvaliteten og kvantiteten av RNA ved hjelp av en automatisert elektroforese system. Den 28S / 18S forholdet bør være over 1,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere potensialet i eyFLP-MARCM teknikk for å generere GFP-merket flekker av definerte genotyper i Drosophila EAD, ble tre typer av kloner indusert: (1) kontroll uttrykker GFP bare, (2) maligne tumorer som uttrykker en onkogen form av små G-protein Ras (Ras V12) i en bakgrunn av homozygot tap av et tumorsuppressorgen frihåndstegning (SCRIB 1), og (3) tilgroing, men ikke-invasiv ras V12 SCRIB en JNK DN kloner, hvor den Jun-N-terminal kinase (JNK) ble inaktivert av uttrykk for sin dominerende-negativ form (figur 4, tabell 1 for genotyper). Det har vist seg at invasivitet av ras V12 SCRIB 1 klonale svulster krever avvikende aktivering av JNK signalisering og dens nedstrøms transkripsjonsfaktorer 10,12,23,24. Videre ras V12 SCRIB 1 Drosophila larve, noe som resulterer i infiltrasjon av immunceller (kalt hemocytes) inn i EAD 14,25.
For å overvåke nivåene og romlig fordeling av JNK aktivitet i mosaikk vev og blant svulster i forskjellige genotyper, den etablerte transgene, JNK-responsive TRE-DsRed reporter ble ansatt 26. Konfokalmikroskopi av dissekert, fast EAD og EAD / hjerne komplekser avdekket markert oppregulering av TRE-DsRed reporter aktivitet i vev som bærer ondartet ras V12 SCRIB 1 tumorer (figur 4B). Den DsRed signal merkede ras V12 SCRIB 1 kloner i EAD (figur 4B), samt tumorceller spres på hjernelapper og invaderer VNC (figur 4E, 4F). I motsetning til TRE-DsRed reporter aktivitety forble begrenset til en streng av celler som strekker seg fra antennal til øyet del av styreplater (figur 4A). Blokkering JNK signalering førte til en dramatisk nedgang på TRE-DsRed signal i klonal ras V12 SCRIB 1 jnk DN tumorer (figur 4C, 4D). Disse dataene gir dermed funksjonell bevis for et krav av JNK signalering for å aktivere TRE avhengig transkripsjonen respons i ondartet ras V12 SCRIB 1 svulster. En avstamning-spesifikke hmlΔ-DsRed reporter, utviklet for sporing Drosophila hemocytes 27,28 viste en opphopning av immunceller i vev som bærer ondartet ras V12 SCRIB 1 tumorer (figur 5B). I motsetning til dette ble bare enkelte hemocytes eller noen få lokaliserte hemocyte flekker påvist i kontroll og ras V12 SCRIB en JNK DN mosaikk EAD og hjernen vev(Figur 5A, 5C). Farging med en pan-hemocyte anti-Hemese antistoff (H2) 29 bekreftet immunceller identiteten til hmlΔ-DsRed positive celler (figur 5D, 5E). I samsvar med publiserte rapporter 12,23,24, objektiv kvantifisering av tumor invasivitet bekreftet en sentral rolle JNK signale fremme tumorinvasjon i de tilstøtende hjernelappene og VNC (Figur 3C). Til slutt ble totalt RNA isolert fra mosaikk EAD. Prøvene ble utsatt enten til QRT-PCR eller analysert på en automatisert elektroforese system for kvalitet og kvantitet. Figur 6A viser betydelig JNK-avhengig oppregulering av matriksmetalloproteinase 1 (mmp1) avskrift i EAD bærende ondartede ras V12 SCRIB 1 klonale svulster, bekrefter tidligere publiserte funn 12,24,30,31. Vurdering av total RNA ved hjelp av en automatisert elektroforese system viste tlue tre uavhengige EAD prøver hadde et forhold 28S / 18S over 1,8 (Figur 6B). Men EAD to RNA var delvis nedbrutt, reflekteres av en smøre på gel (figur 6C). I motsetning til dette, EAD 3 prøve hadde en lav konsentrasjon. Multiple bånd med høyere molekylvekt på gel bilde (figur 6B) og små topper på elektroferogrammet (figur 6C), også foreslått DNA-kontaminering. Dermed vil bare EAD en prøve være egnet for fremstilling av et mRNA-seq bibliotek.
Figur 1: Skjematisk av MARCM system for generering av genetiske mosaikk i Drosophila EAD og nedstrømsapplikasjoner (A) MARCM systemet muliggjør generering av klonale flekker med definerte genetiske lesjoner i en ellers vill-type (heterozygot).kontekst. Ekspresjonen av FLP under kontroll av en vevsspesifikk promoter (for eksempel, eyeless) katalyserer rekombinasjon mellom de to FRT elementer som flankerer STOP kassett som er merket med en gul (y) genet (act> y +> Gal4). Etter fjerning av STOPP kassetten, den allestedsnærværende uttrykt Gal4 transkripsjonen aktivator (act-Gal4) kan drive ekspresjon av hvilken som helst UAS-baserte transgenet som UAS-GFP (også UAS-ras V12). I en foreldrecelle, derimot, er det Gal4 aktivitet blokkert av en Gal80 repressor hvis ekspresjon blir kontrollert av en tubulin promoter (kar-Gal80). I G2-fasen av cellesyklusen, medierer FLP utveksling av de ikke-søsterkromatider mellom de homologe kromosomer distale til FRT-områder. Segregering av de rekombinante kromosomer under mitose vil gi opphav til to datterceller, som blir homozygote mutante for en bestemt genomiske lokuset (f.eks SCRIB
Figur 2: Sortering av tredje instar larver og representative eksempler på EAD og EAD / hjerne komplekser brukes til ulike nedstrømsapplikasjoner (AB) Fluorescent mikrografer av tredje instar larver lagerstyrings GFP-merket kloner indusert med eyFLP-MARCM 82B Grønn tester.. (A) Representant kontroll larve med kloner begrenset til EAD og hjernelapper. (B) Et eksempel på en "leopard larve" som bærer GFP-positive kloner i forskjellige vev i hele kroppen. (C) Lysfelt bilder av dissekert EAD og (D) EAD / hjerne komplekser knyttet til munn kroker, og (E) EAD renset fra all overflødig vev inkludert munn kroker. Skala barer = 2 mm (AB) og 500 mikrometer (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Kvantifisering av tumor invasivitet (A) Fluorescerende konfokale bilder av hjernen ble dissekert fra ras V12 SCRIB en larver (7 dager AEL) representerer de virkelige eksempler på de fire forskjellige grader av tumor invasivitet som strekker seg fra ikke-invasiv (Score 0), en hjerne lapp invadert (Resultat 1), begge hjernelapper invadert (score 2) til en sterk tumorinvasjon med klonal vev som dekker begge hjernelappene og skrive inn VNC (score 3). Bildene er projeksjoner av flere confocal seksjoner og eksempler for Score 2 og 3 er sydd fra 2 x 2 confocal bilder. Skala barer = 100 mikrometer. (B) Et eksempel på en anonymisert objektglass med faste hjernen brukes til objektivscoring under en fluorescerende stereomikroskop. Scoret hjerner er merket med en penn for å unngå dobbeltregistrering. Scale bar = 500 mikrometer (C) Sammenlignet med svært invasive ras V12 SCRIB 1 svulster, hemming av JNK signalisering (ras V12 SCRIB en jnk DN) eliminert invasjon av klonale celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Aktivering av transkripsjons TRE-DsRed reporter i maligne ras 'V12' SCRIB '1 klonale svulster er JNK-avhengige (A. TRE-DsRed reporter merket en smal stripe av celler som kjører fra antennal til øye del (pilspisser). (B) Aktiviteten av TRE-DsRed reporter ble markert forbedret i ras V12 SCRIB 1 GFP-positive kloner i forhold til det omgivende ikke-klonal EAD epitel. (C) Hemming av JNK aktivitet resulterte i en klar reduksjon av DsRed signalintensitet i ras V12 SCRIB en JNK DN kloner. (D) Ytterligere forbedring av DsRed signal avslørte ikke-autonome aktivering av JNK-signal i celler som omgir de ras V12 SCRIB en JNK DN kloner. (E) På dag 8 AEL, ras V12 SCRIB 1 celler overgrew hele EAD og spredt over hjernelappene til VNC (pil). (F) De klonale cellene invaderer VNC (close-up av regionen marked med pilen i E) ble beriket for DsRed signal. (AC) Vis projeksjoner av flere confocal seksjoner, (E) er sydd fra 3x3 confocal bilder og (D, F) representerer enkelt seksjon. Skala barer = 50 mikrometer. EAD, øye / antennal plate; BL, hjerne lapp; VNC, det ventrale nervesystemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Lineage-spesifikke hml Δ -DsRed transgene reporter avslører berikelse av ras V12 SCRIB en tumor-assosiert hemocytes (A) I kontroll EAD, hmlΔ-DsRed reporter-merket hemocyte clu sters er fanget i fordypningene i øyet og antennal epitel. (B) EAD og hjernevev består av ras V12 SCRIB 1 GFP-merket svulster viste et økt antall hemocytes spredt over hele klonale vev. (C) Antall tilknyttede hemocytes dramatisk redusert ved hemming av JNK signalisering i ras V12 SCRIB en jnk DN mosaikk vev. (DE) HmlΔ-DsRed positive hemocytes ble også merket med en H2-antistoff som gjenkjenner pan-hemocyte markør Hemese. (AC) Vis projeksjoner av flere confocal seksjoner, (A) er sydd fra 2 x 2 og (BC) er sydd fra 3 x 3 confocal bilder. (DE) Representere enkeltseksjoner. Skala barer = 100 mikrometer (AC) og 10 mm (DE). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:.. Evaluering av kvantitet og kvalitet av total RNA isolert fra dissekert EAD (A) Et representativt eksempel på QRT-PCR resultater ved hjelp av fire biologiske replikater for hver genotype Mmp1 transkripsjonsnivåer ble normalisert til rp49. Brett endringer i genuttrykk ble beregnet ved hjelp av relativt standardkurve metode 32. Data er gjennomsnittsverdier ± SEM; *** P <0,001 hjelp Students uparede tosidige t-test med ulik varians. (B, C) Vurdering av total RNA kvalitet og kvantitet ved hjelp av et automatisert system elektroforese. Den virtuelle gel bilde (B) viser de to fremtredende band av 18S og 28S rRNAs som tilsvarer de veldefinerte topper på electropherograms (C). DNA forurensning og RNA degradering blir reflektert av sommear (pilspisser) og extranumerary band og topper (piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Fly Stammer | Kilde / Kommentarer |
| eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, kar-Gal80 | eyFLP-MARCM 82B Grønn Tester 11 |
| w; UAS-ras V12; FRT82B SCRIB 1 / TM6B | 12 |
| w; UAS-ras V12; UAS-JNK DN FRT82B SCRIB 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | denne studien, w; hmlΔ-DsRed fra Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B SCRIB 1 / TM6B | denne studien |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B SCRIB 1 / TM6B | denne studien |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | denne studien, w; TRE-DsRed fra Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B SCRIB 1 / TM6B | denne studien |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B SCRIB 1 / TM6B | denne studien |
Tabell 1: Oppsummering av Drosophila linjer som brukes i denne undersøkelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene for å generere genetiske mosaikk i Drosophila er blant de mest avanserte verktøy for å analysere og manipulere gen-funksjon 33. Den eyFLP-MARCM system har vist seg kraftig og robust som det lar induksjon av visuelt merket, genetisk definert kloner i en romlig begrenset måte, dvs. i vev der eyeless Enhancer er aktiv 9,18. Dette er særlig viktig når flere genetiske lesjoner er kombinert i de samme cellene. Mens disse sterkt avvikende lapper tillate larveutvikling når begrenset til EAD og hjerne neuroepithelia, kan de forårsake dødelighet når spredt over hele larve legeme som i tilfelle av varmesjokk-kontrollerte FLP (hsFLP) kloner. Betydelig, induksjon av kloner i fly EAD epitel som aktiveres onkogener kombinere med tap av tumor suppressors rekapitulerer fremveksten og utviklingen av solide epiteltumorer i enkelte menneske kreft. However, har systemet også sine begrensninger som vil bli kort diskutert. Gitt at insekter har et åpent sirkulasjonssystem, trenger sanne metastaser som observert i humane kreftformer ikke forekomme. Derfor den komplekse prosessen med metastatisk spredning ikke kan trofast modellert i Drosophila. Ikke desto mindre, EAD tumorer slik som ras V12 SCRIB 1 kloner gjøre vise ondartede egenskaper som de brytes ned basalmembranen som omgir EAD og invadere den tilstøtende hjerne 11,12,31. Graden av tumor aggressivitet kan kvantifiseres og sammenlignes mellom forskjellige genotyper som er beskrevet i denne studien. Det er også viktig å merke seg at nærværet av spesifikke genetiske lesjoner i mosaikk EAD kan påvirke utviklings tidspunktet og varigheten av larvevekst. Iscenesettelse av larver vil avgjøre om analyse av mosaikk vev vil bli gjort ved hjelp av dyr av samme kronologisk eller utviklingsstadiet. Utføre en pilotforsøk for å vurdere effekten av enny EAD klonal genotype på utviklings timing er ønskelig.
Det finnes tekniske begrensninger i tillegg. Først antall ulike klonal genotyper som kan bygges med eyFLP-MARCM verktøyet er flott, men ikke uendelig. For eksempel, er å kombinere to mutante alleler som befinner seg på forskjellige kromosomer hindret av lav effektivitet av rekombinasjon på begge kromosomer samtidig, og gener som ligger på den lille fjerde kromosomet er vanligvis utilgjengelige. Gene knockdown ved hjelp av transgene RNAi er en alternativ løsning. Imidlertid er det viktig å innse at transgener ikke er uttrykt umiddelbart ved mitotisk rekombinasjon - ikke før Gal80 repressoren blir degradert. Aktiviteten av Gal4 / UAS ekspresjonssystem kan bli forbedret ved å øke larver ved 29 ° C. Det er imidlertid viktig å huske på at forhøyet temperatur påvirker ulike utviklings, fysiologiske og molekylære parametre inkludert vekst, utviklings timing, metabolism og genuttrykk 34-37. Dermed vil tilpasninger til de angitte protokoller som iscenesettelse av larver eller antall dissekert EAD for transkriptomet profilering være nødvendig.
De eyFLP-MARCM testere er ikke blant de sunneste stammene. De mange transgener i en genom kompromiss fly fitness og fruktbarhet. Disse bestandene krever ekstra oppmerksomhet skal opprettholdes og utvides for store samlinger av jomfruelige kvinner. Som dokumentert i denne studien, MARCM 82B Grønn tester linje 11, selv om levedyktig når homozygot, er genetisk ustabil. Dette er åpenbart fra den spontane forekomsten av "leopard larver" som viser ektopiske, GFP-merket kloner innen ulike polyploide vev inkludert tarmen, tracheae, fett kroppen, og larvehuden. Dette fenomenet forekommer i alle krysser uavhengig av faderlig genotype. Vi antar at de ektopiske GFP patcher skyldes ukontrollert, stokastisk rekombinasjon mellom de to FRT nettsteder i FLP ut kassetten, forårsaker fjerning av gul + markør og "STOP kassetten". I polyploide vev, kan tubulin promoter-drevet Gal80 repressor være utilstrekkelig til å blokkere Gal4 aktivitet. Tilstedeværelsen av genetisk modifiserte celler i annet vev enn det EAD og hjerne kunne fremkalle systemiske signaler som kan påvirke oppførselen av de eksperimentelle kloner. Disse "leopard larver" bør derfor ekskludert fra analysene. Videre vi rutinemessig reetablere MARCM 82B Grønn tester fra enkle mann-kvinne kors.
Til tross for de fallgruvene som er nevnt ovenfor, anvendelser av eyFLP-MARCM system for å studere genet funksjoner og samspillet mellom klonale svulster og deres miljø er mange. Innføring av Gal4 / UAS-uavhengig binære uttrykk systemer som Lexa / LexOp 38 eller narkotika kontrollerbar QF / Quas / QS 39,40 ville gi en god kontroll over transgen expression og / eller samtidig merking og manipulering av forskjellige cellepopulasjoner, inkludert klonale, ikke-klonale epitelceller og hemocytes. Slike mosaikk vev kan bli igjen behandlet i henhold til protokollen beskrevet her.
Fremgangsmåten for disseksjon av mosaikk EAD og EAD / hjerne komplekser fra den tredje stadiums larver (Protocol seksjon 3) kan brukes til tidligere utviklingsstadier i tillegg. Viktigere, tillater protokollen for EAD / hjerne komplekser utvinning av vinge, haltere og ben imaginal plater. Skal disse brukes for RNA-isolering (Protocol avsnitt 3.3.2 og 7), bør platen av interesse renses fra overflødig vev, og behandlet på samme måte som EAD. Gitt sin mindre størrelse, bør antall haltere og beinplater innsamlede økes til å tilegne seg tilstrekkelig mengde av RNA.
Protokollen for utvinning av total RNA fra EAD (Protocol seksjon 7) er basert på RNA lysereagensen tilgjengelig fra forskjellige kommersielle vendors (se liste over materialer / utstyr). Den totale suksessen av prosedyren avhenger i hovedsak av: (i) som har tilstrekkelig antall larver, (ii) å være rask og presis mens dissekere, og (iii) å holde prøvene fri fra RNases. Holde arbeidsplass og instrumenter ren, hansker, ved hjelp av RNase-fri plast ware og løsninger, og holde prøvene på is all redusere RNA degradering. For å hindre forurensning av RNA med en hvilken som helst genomisk DNA som ikke kan fjernes helt ved DNase-behandling (Protocol seksjon 7.11), er det avgjørende for å unngå inter ved henting av den vandige fase for første gang (Protocol avsnitt 7.6). Både DNA-kontaminasjon og RNA-degradering kan avdekkes ved å kjøre prøvene på et automatisert system elektroforese (figur 6B, 6C). RNA-isolering Protokollen har en bredere anvendelse. Det har blitt brukt for RNA ekstraksjon fra hele larver på ulike utviklingsstadier, fra voksne, og ulikelarve organer. Den oppnådde RNA var egnet for både QRT-PCR og genom-wide transkriptomet analyse av mRNA-seq 20,24,41,42. Sammenlignet med QRT-PCR som kvantifiserer titalls utvalgte mRNA på det meste, tillater objektivt mRNA sekvense genom-wide uttrykk analyser. Dermed kan man sammenligne hele transkriptom signaturer av svulster forårsaket av spesifikke genetiske skader på forskjellige stadier av tumorigenesis 24. Det er viktig å huske på at RNA kommer fra hele plater, slik at resultatene vil ikke bare reflektere endringer i klonene, men også i de omkringliggende, ikke-klonal vev. Utføre fluorescerende aktivere cellesortering (FACS) på dissosierte mosaikk EAD ved å tilpasse tilgjengelige protokoller 43,44 kan brukes for å bestemme signaturen transkripsjonen av spesifikke cellepopulasjoner, f.eks klonal (GFP +) og ikke-klonal (GFP -) celler.
Fiksering og farging protokollen beskrevet her er egnet for simultaneous visualisering av proteiner av interesse med spesifikke antistoffer og aktivitet av transgene journalister. Både GFP signal merking klonale celler og DsRed fluorescens fremstilt ved en av de to transgene reportere brukt i denne studien er bevart i hele fiksering og farging, og kan være direkte visualisert ved konfokal mikroskopi. Imidlertid kan antistoffer mot de fluorescerende proteiner forsterke signalet intensitet. Likeledes vil bruk av et anti-β-galaktosidase antistoff lette deteksjon av transgene reportere basert på den bakterielle lacZ-genet. Relative reporter aktiviteter kan vurderes ved å måle de relative pixel intensiteter av kloner versus ikke-klonal vev ved hjelp av bildeanalyse programvare (f.eks, Fiji, ImageJ). Når man sammenligner reporter aktivitet blant ulike klonale genotyper, må bildeinnlastingen innstillinger holdes konstant (Protokoll § 5 og referanser 21,22). Selv om protokollen fungerer godt sammen med mange forskjellige antibodies, kan det være nødvendig å optimalisere anbefalte antistoffkonsentrasjoner. Endringer kan også være nødvendig i fiksering, type og konsentrasjon av vaskemiddel (Triton X-100, Tween-20, saponin) og fiksativ (8% PFA, 4% formaldehyd, EtOH).
I motsetning til de protokoller som er omtalt ovenfor, er kvantifisering av tumor invasivitet begrenset til det tredje instar larvestadiet og EAA / hjerne-komplekset. Likevel kan det samlede begrunnelsen gjelder alle kvantitative studier der kognitiv bias må unngås. Metoden krever grundighet. Som tumor malignitet øker i tid, er det viktig å sammenligne larver av samme alder (for eksempel 7 eller 8 dager etter egglegging). Med tiden en klonal svulst kan overgrow massivt, men tumorcellene kan forbli inne i EAD. Trinnet hvori hjerner er atskilt fra EAD (Protocol seksjon 4.4.1) er derfor avgjørende for å unngå falske positive invasivitet teller. Montering av hjernen med vedlagte EAD vil Flatten vev, forårsaker overgrodd EAD å dekke strukturer i hjernen og dermed forhindre kvantifisering. Ideelt sett ville man liker å fange invasiv prosessen direkte i levende larve. Transgene reportere å visualisere de involverte cellepopulasjoner og vev er tilgjengelige og kan bli kombinert med den eyFLP-MARCM system. Dessverre tar det invasiv prosessen flere timer til dager, en tidsramme som er uforenlig med å holde larver i live samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
