Summary
Denne protokol viser, hvordan til at generere fluorescens mærket, genetisk definerede klonede tumorer i Drosophila øje / den antennal fantasiens diske (EAD). Den beskriver, hvordan at dissekere EAD og hjerne fra den tredje stadiums larver og hvordan at behandle dem til at visualisere og kvantificere genekspression ændringer og tumorindtrængen.
Introduction
Cancer er en af de mest genetisk heterogen gruppe af sygdomme, hvis forekomst og dødelighed er dramatisk stigende, især blandt ældre verdensplan. Cancer stammer klonalt fra en tumor-initierende celle, der undslipper iboende tumorundertrykkende mekanismer og deler ud af kontrol. Den gradvise ophobning af genetiske læsioner, der kooperativt fremmer vækst, spredning og motilitet, mens hæmme død og differentiering forvandler den indledende godartet tilgroning til en yderst ondartet, metastatisk og dødbringende tumor. Det er blevet klart, at der ud over genetiske ændringer, tumorudvikling kræver ændringer i det omgivende stroma og krydstale mellem tumor og multipel celletyper (f.eks fibroblaster, immun- og endotheliale celler) i dens mikromiljø. Forståelse af de molekylære principper malign transformation, herunder tumor-stroma interaktioner er af stor betydning for at udvikle forebygtion og tidlig screening strategier, samt nye og effektive behandlinger for kræftbekæmpelse metastaser og resistens.
Frugten flyve Drosophila melanogaster er blevet et attraktivt system til kræftforskning 1-4 på grund af sin hurtige generationstid, bemærkelsesværdige bevarelse af signalering knuder mellem fluer og mennesker, begrænset genetiske redundans og rigdom af avancerede genetiske værktøjer, der letter manipulation af næsten enhver gen i et midlertidigt og rumligt begrænset måde. Genetisk definerede tumorer af varierende malignitet kan reproducerbart manipuleret i Drosophila ved indføring GAIN- og tab-af-funktion-mutationer i en undergruppe af stamceller i en ellers vildtype væv ved hjælp af MARCM teknik 5. Den MARCM Værktøjet kombinerer FLP / FRT (FLP rekombinase / FLP Anerkendelse Target) -medieret mitotisk rekombination 6 med FLP-out 7 og Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 målgenekspressionssystemer 9. Med denne metode ekspression af enhver UAS-baserede transgen, herunder onkogen eller fluorescerende protein cDNA'er eller inverterede DNA gentagelser for dsRNA-induceret gene silencing, vil være begrænset til en klon af celler, der har mistet en specifik genetisk locus og et Gal4 repressor grund rekombination (Figur 1A). Klonale plastre markeret med grønt fluorescerende (GFP) eller rød fluorescerende proteiner (f.eks RFP, DsRed, mCherry) kan let spores gennem udvikling, isoleret og analyseret. Vigtigt er det, kan deres adfærd sammenlignes direkte til den hosliggende vildtype væv. Således spørgsmål relevante for cellen autonome og ikke-selvstændige effekter af genetiske læsioner kan nemt undersøges. Svarende til pattedyr, kun kloner, hvor flere onkogene læsioner kombineres blive ondartede i Drosophila og rekapitulere centrale kendetegnende for mammal cancer. De overproliferate, unddrage apoptose, inducerer inflammation, blive udødelig og INVAtende, i sidste ende dræbe værten 10-17.
Her beskriver vi en protokol til at generere genetisk definerede klonede tumorer i øjet / antennal og hjernevæv af Drosophila larver ved hjælp af MARCM teknik. Metoden bygger på en MARCM tester bestand, der udtrykker gær FLP rekombinasen under kontrol af den eyeless forstærker (eyFLP) 18,19. På denne måde, er GFP-mærkede kloner dannet i både peripodial og søjleepitel af EAD og neuroepithelium af hjernen hele embryonale og larvestadier (figur 1A, B og reference 20). Kloner kan let følges indtil voksenalderen som EAD udvikler sig til den voksne øjet, antenne og hoved kapsel mens neuroepithelium giver anledning til neuroblaster, der producerer differentierede optiske lobe neuroner.
For at lette omfattende molekylære, funktionelt og fænotypisk karakterisering af mosaik væv, vi deskriftlærde en protokol til dissektion af EAD og hjerne fra den tredje stadiums larver og skitsere, hvordan at behandle dem for tre forskellige anvendelser: (i) påvisning af transgene fluorescerende journalister og immunfarvning, (ii) kvantificering af tumorindtrængen og (iii) analyse af genekspression ændrer anvendelse af en kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) eller en høj-throughput mRNA sekventering (mRNA-seq) (figur 1C).
Den immunfarvning protokol kan bruges til at visualisere ethvert protein af interesse med et specifikt antistof. Transgene fluorescerende transkriptionelle reportere skabe nem og præcis Spatiotemporal information om aktiviteten af en bestemt signalvej. Celle-linjespecifikke reportere, på den anden side, afspejler kvalitative og kvantitative ændringer i celle populationer i mosaik væv og blandt tumorer af forskellige genotyper. Kvantificering af invasiv adfærd letter sammenligning af tumor malignitet mellem genotypes. Endelig protokollen beskriver indsamling og behandling af mosaik EAD til RNA isolering er velegnet til både små og store downstream applikationer såsom revers transkription efterfulgt af QRT-PCR og genom-dækkende mRNA-seq hhv. De kvalitative og kvantitative data fra disse analyser tilvejebringe nye indsigt i sociale adfærd klonede tumorer. Desuden producerer de et solidt fundament for funktionelle undersøgelser om betydningen af de enkelte gener, genetiske netværk og tumor mikromiljø i forskellige stadier og aspekter af tumorigenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Dette arbejde udnytter eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, badekar-Gal80 MARCM 82B Green tester linje 11. Crossing the MARCM 82B Green tester jomfruer til hanner af stammer såsom w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotype vil give afkom, hvor mitotisk rekombination vil forekomme mellem de rigtige arme af 3. homologe kromosomer. På denne måde vil kloner homozygote mutant til gen-c beliggende distalt for FRT82B stedet blive genereret inden EAD og hjerne neuroepithelium. Disse kloner vil udtrykke GFP, transgen a og dsRNA til gen-B (figur 1A). Forskellige eyFLP-MARCM tester linjer for rekombination på X, 2L, 2R, 3L og 3R er blevet etableret og er til rådighed inden fluen samfund.
1. Fly Håndtering, kors, og Iscenesættelse
- Udvid passende MARCM testeren lager ved stuetemperatur ved at befolke multiple bottles samtidig. Flip voksne i friske flasker hver 2-3 dage, så nok jomfruer kan opsamles for efterfølgende kors.
BEMÆRK: Ved afhentning Jomfruer, undgå en langvarig eksponering til CO 2, da dette kompromitterer kvindelige frugtbarhed. - Afhængig af omfanget af forsøget, der er nedsat flyve kors i hætteglas bruger mindst 10 MARCM tester jomfruer og 4 hanner (f.eks til billeddannelse af fluorescerende journalister og Immunofarvning) eller i flasker med mindst 30 jomfruer og 10 hanner (f.eks til RNA isolering og kvantificering af invasiv).
- Hæv afkom ved 25 ° C under en lang dag 16 timer / 8 timers lys-mørke-cyklus. Flip forældre til nye hætteglas / flasker hver 24 timer for at lette reproducerbar iscenesættelse af larver og for at forhindre overbelægning.
BEMÆRK: Fra på dag 6 efter æglægning (AEL), den sene tredje stadie kontrol larver stopper fodring, start vandre og indtast pupariation. I modsætning hertil kan indtræden af larvestadiet-puppe overgang være delagt eller ikke-eksisterende i larver med EAD bærende hyperplastiske eller maligne klonede tumorer.
2. Indsamling Tredje INSTAR Larver
- For immunfarvning, indsamle omkring 20 sen tredje stadie larver (vandre på væggen og de af en sammenlignelig kropsstørrelse fra fødevarer). Brug pincet til forsigtigt plukke larver fra hætteglasset eller flasken og overføre dem til et foster glasskål fyldt med phosphatbufret saltvand (PBS).
- For RNA isolation og kvantificering af invasiv, indsamle mindst 80 sent tredje stadie larver (vandre på væggen og de af en sammenlignelig kropsstørrelse fra fødevarer). Brug en sprayflaske at sprøjte PBS i en flue flaske, der indeholder larver indtil overfladen er dækket.
- Blødgøre de øverste lag af fødevarer med en spatel og hæld fødevarer mask indeholdende larver i en petriskål. Ved hjælp af pincet, forsigtigt plukke larver og overføre dem til et foster glas fad fyldt med PBS.
- Vask larver med PBS until alle tilbageværende fødevarer er fjernet. Undersøg larver under den fluorescerende stereomikroskop med 8 til 16X forstørrelse til at skille alle "Leopard larver", der bærer tilfældige GFP-positive pletter i hele larvestadiet kroppen (figur 2A, 2B og se Diskussion afsnit).
BEMÆRK: RNA isolering omfatter en næstsidste vasketrin i 70% EtOH i 1 min. - Skålen indeholder udvalgte larver i PBS på is indtil dissektion. Proces larver inden for 30 minutter for at undgå negative virkninger af kulde og sult.
3. Dissektion af Larver
- For at dissekere EAD under et stereomikroskop, bruge et par pincet til forsigtigt at trykke på den midterste del af larve mod glasfad bunden. Med den anden pincet, tag fat i larver munden krogene og trække dem væk fra kroppen (Figur 2C).
BEMÆRK: trækkraft er ofte tilstrækkelig til at bryde de optiske stilke forbinder EAD pair til hjernen lapper. Hvis hjernen eller dens dele forbliver knyttet til EAD og deres tilstedeværelse ikke ønskes for yderligere anvendelser, skar de optiske stilke med en hjælp af de to par pincet. For invasive tumorer (f.eks ras V12 scrib 1) bliver forbindelsen mellem EAD og hjernens lapper i stigende grad skjult med tiden ved tilgroning og migrere klonede celler.- Til fremstilling af EAD / hjerne-kompleks med en intakt ventrale nerve ledning (VNC) (figur 2D) pincet til at skære en larve i midten af legemet. Kassér den bageste halvdel.
- Hold forreste halvdel af larvestadiet krop mellem spidserne af én pincet, flip larve inside-out ved at skubbe i munden krogene med spidsen af den anden pincet og ved at rulle neglebånd over det med den første pincet par.
- Brug pincet forsigtigt fjerne alle uvedkommende væv (f.eks spytkirtlerne, fedt kroppen, og tarm) mens EAD par ellerEAD / hjerne kompleks tilsluttet munden krogene. Udrede munden kroge fra den overliggende neglebånd. Frigør VNC ved at bryde de axonale projektioner strækker til kroppens muskler og epidermis (figur 1B, 2C, 2D).
BEMÆRK: munden kroge muliggør sikker manipulation af væv med pincet og fremme en mere effektiv forliset og let anerkendelse af væv under vask. Dissekeret EAD ændre morfologi relativt hurtigt, når holdes ikke fastbundet i PBS. Begræns dissektion tid til 20-30 min. - For at overføre vævet, pels en P20 mikropipette spids ved pipettering den resterende krop kroppe flere gange op og ned. For at overføre de større EAD / hjerne-komplekser, skære P20 mikropipettespidsen med en saks.
BEMÆRK: Proceduren Belægningen er kritisk for at forhindre stikning og tab af dissekerede væv under overførslen. Anvendelse af en P20 mikropipette minimerer overførslen af PBS i fikseringsopløsning, begrænsende uønsket fortynding.- For immunfarvning, overføredet dissekerede EAD i en 0,5 ml rør fyldt med 400 pi 4% paraformaldehyd (PFA) fiksativ. Brug 1,5 ml rør med 1 ml PFA for større EAD / hjerne komplekser betød for scoring er invasiv.
ADVARSEL: PFA er meget giftigt. Bær beskyttelseshandsker og tøj. Undgå kontakt med hud, øjne eller slimhinder. - For RNA isolation overføre dissekeret EAD ind i en ny glasskål fyldt med kold PBS. Brug pincet til at rense EAD fra ringen og lymfekirtler, for at minimere prøve forureninger.
- Frigør EAD fra munden kroge ved at bryde forbindelsen mellem antenne diske og mund kroge bruger pincet (figur 2E). At undgå RNA-nedbrydning og genekspression artefakter, begrænse dissektion tid til 30 min. Fortsæt til trin 7.
BEMÆRK: En erfaren forsker kan dissekere omkring 60 larver i 30 min ekskl nødvendige tid til larver indsamling og vask. Total RNA udbytter afhænger af EAD størrelse, der varierer blandt genotyper og developmental etaper. Dissektion af 80-100 kontrol EAD par fra sene tredje stadiums larver bør give 5-8 ug totalt RNA.
- For immunfarvning, overføredet dissekerede EAD i en 0,5 ml rør fyldt med 400 pi 4% paraformaldehyd (PFA) fiksativ. Brug 1,5 ml rør med 1 ml PFA for større EAD / hjerne komplekser betød for scoring er invasiv.
4. Fastsættelse, Immunfarvning og Montage
- Fix prøver i PFA fiksativ i 25 min, mens nuterende ved stuetemperatur. Den fiksering kan udvides op til 60 minutter uden at ændre væv morfologi og antigeniciteten af proteiner.
- Fjern fikseringsmiddelpartiklerne og vask prøver med PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) tre gange i 10 min ved anvendelse af en nutator. Brug tilstrækkelig mængde PBST for hver vask trin (400 ul / 0,5 ml rør).
BEMÆRK: Fast EAD / hjerne komplekser betød for scoring er invasiv kræver ikke immunfarvning. GFP signalet forbliver godt synlig efter fiksering. Fortsæt til trin 4.4 for den endelige dissektion.- For immunfarvning, blok væv i 200 pi af en blokeringsopløsning (PBST med 0,3% BSA) i 20 minutter under forsigtig omrøring ved stuetemperatur.
- Der inkuberes med pænAry antistoffer fortyndet i 100 pi af en blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C under forsigtig omrystning. Der henvises til primært antistof datablad eller publiceret litteratur for anbefalede antistof fortynding.
BEMÆRK: Det primære antistof fortynding skal muligvis optimeres. - Efter fem 10 minutters vaske i PBST, bejdse væv med de fluorescerende sekundære antistoffer fortyndet i blokeringsopløsning under forsigtig omrystning i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C i mørke.
- Vask prøverne tre gange 10 min i PBST.
- Der inkuberes med pænAry antistoffer fortyndet i 100 pi af en blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C under forsigtig omrystning. Der henvises til primært antistof datablad eller publiceret litteratur for anbefalede antistof fortynding.
- For immunfarvning, blok væv i 200 pi af en blokeringsopløsning (PBST med 0,3% BSA) i 20 minutter under forsigtig omrøring ved stuetemperatur.
- Erstat PBST med 500 pi DAPI-farvningsopløsning. At mærke F-actin, tilføje phalloidin konjugeret til et fluorescerende farvestof til DAPI-farvningsopløsning. Efter 15 min nutationen i mørke, vask væv én gang i 10 minutter med PBST.
BEMÆRK: F-actin mærkning kan udføres uafhængigt af DAPI-farvning. - For den endelige dissektion trin, overføre vævet tilbage i en PBS-fyldte glasskål under anvendelse af en 1 ml piPette. Under anvendelse af de to par tænger klip fra munden kroge.
- Adskil hjerner der vil blive anvendt til kvantificering af invasiv fra EAD ved at skære den optiske stilk som tilgroet EAD kan hæmme analysen.
- Placer en dråbe af den stigende medium (15 pi for en 22 mm x 22 mm dækglas) på en objektiv dias. Ved hjælp af pincet tips, distribuere mediet til et tyndt lag. Transfer EAD, hjerner eller EAD / hjerne-komplekser i montering medium med en P20 mikropipette.
- Brug tang tips eller en wolfram stang til at distribuere væv og ret VNC på diaset.
- For at undgå dannelse af bobler, mens montering, første touch-ene kant af et dækglas til montering medium og derefter langsomt lavere på montering medium ved hjælp af pincet. Bruge små stykker filtrerpapir eller væv tørre til at absorbere overskydende monteringsmedium omkring dækglasset kanterne.
BEMÆRK: DABCO / Poly (vinyl alkohol) 4-88 montering medium hærderved 4 ° C inden for en time. Slides kan opbevares i måneder ved 4 ° C.
5. Konfokal Imaging
- Anskaf enkelt konfokale sektioner og stakke ved hjælp af en konfokal mikroskop udstyret med 20x, 40X og 60X olie mål.
- Undgå pixel mætning. Brug samme billedoptagelse parametre, herunder billedopløsning, laser indgangseffekt, gain, offset, frame gennemsnitsberegning, et skridt størrelse i en z-serie og opretholde disse indstillinger for alle genotyper for at muliggøre sammenligninger af pixel intensiteter mellem forskellige genotyper 21,22.
BEMÆRK: visualisering af EAD / hjerne komplekse, generere maksimale projektioner og sy respektive, tilstødende billeder. For endelige billede forberedelse, brug indlæg billedbehandling software til panel montering og til at justere lysstyrke og kontrast.
6. Kvantificering af tumorindtrængen
- Definer et pointsystem, der vil karakterisere de forskellige niveauer af tumor invasiveness overvejer den rumlige mønster af invasion og mængden af GFP-positive celler spredes til hjernen og VNC. Forbered evalueringsskemaer til dokumentation (figur 3A).
- Mount mindst 80 faste intakte hjerner for hver genotype på et dias ved hjælp 40 pi montering medium pr 24 mm x 50 mm dækglas.
- For at tillade uvildig scoring, så spørg en neutral part anonymisere dias, så scoring procedure er saglig. Vurdere anonymiserede slides ved uafhængigt to lab medlemmer. Offentliggøre genotyper efter optællingen er afsluttet.
- Vurdere graden af malignitet af en blind scoring af monterede hjerner under en fluorescerende stereomikroskop udstyret med et GFP-filter sæt. Brug en markør til at mærke hjerner, der allerede er blevet set at undgå dobbelttælling (figur 3B).
- Beregn procentdelen af hjerner, der falder ind i hver af de definerede invasive kategorier pr genotype. Bestem de statistiske significance anvendelse af en chi-square test (figur 3C).
7. RNA Isolation, DNase Behandling og Kvalitet Check
BEMÆRK: Alle reagenser (løsninger, plasticware), der anvendes i de følgende trin skal være fri for RNase aktivitet. Brug altid handsker og bruge en kemisk hætte til arbejde med organiske opløsningsmidler.
- Overfør ren EAD med en coatet P20 mikropipettespids i 1,5 ml rør.
- Lad væv synker til bunden af røret, fjern forsigtigt PBS og erstatte det med 100 pi RNA lysis reagens (nok til op til 140 EAD).
- Lyse væv ved hvirvelbehandling. På dette tidspunkt kan prøver dybfryses i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C eller direkte forarbejdning med standard RNA-isolering protokol.
BEMÆRK: Prøver af lignende genotyper fra flere dissektion runder kan samles en gang i RNA lysis reagens. - Fyld prøvevolumen til 0,9 ml med RNA lysis reagens. Tilsæt 0,2 ml chloroform og blandes prøver vigorously til 15-20 sek.
- Efter 2 til 3 minutters inkubering ved stuetemperatur, centrifugeres prøverne ved 10.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør farveløs øvre vandige fase indeholdende RNA til et frisk rør uden at forstyrre interfasen. Bo væk fra interfasen da det indeholder proteiner og genomisk DNA.
BEMÆRK: opsamlede rumfang bør være ca. 60% af mængden af RNA lysis reagens, der anvendes til homogenisering. - Udfælde RNA ved tilsætning af 0,5 ml isopropylalkohol. Vortex og inkuber prøverne ved stuetemperatur i 10 min.
- Centrifugeres prøverne ved 10.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres, og vask RNA pellet en gang med 600 pi 75% ethanol. Efter en kort vortex og centrifugering (10.000 x g i 7 minutter ved 4 ° C) kasseres alt ethanol og lad RNA pellet lufttørre i 5-10 min placere det åbne rør på en ren væv tørre.
BEMÆRK: RNA pellet kan være synlig som en lille uigennemsigtig / hvid stmodne ved bunden af røret eller usynlig. De resterende ethanol dråber kan fjernes forsigtigt med P10 mikropipettespids. - Opløs RNA i 50 pi DEPC-behandlet vand ved hvirvelbehandling eller passerer opløsning nogle få gange gennem en pipettespids.
- For at minimere kontaminering med genomisk DNA, behandle total RNA med DNase ved tilsætning af 50 pi af en blanding indeholdende 1 pi DNase (2 U / pl) og 10 pi 10x DNase puffer i DEPC-behandlet vand. Vortex og spin ned.
- Inkuber prøverne ved 37 ° C i et vandbad eller en varmeblok i 30 til 40 min. Efter inkubation tilsættes 100 pi DEPC-behandlet vand i hver prøve.
- At inaktivere den enzymatiske aktivitet og ren RNA fra DNase, tilsættes 200 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) opløsning, vortex i 1 min og centrifugeres prøverne ved 10.000 x g i 7 min ved 4 ° C.
- overføre omhyggeligt den øvre vandige fase indeholdende RNA i et frisk rør. Tilføj lige volumen (200 ul)chloroform, bland og gentag centrifugeringen skridt fra oven.
- Saml forsigtigt den øvre fase og udfælde RNA ved tilsætning 1/10 volumen 3 M natriumacetat, pH 5,2 fremstillet i DEPC H2O og 2,5 volumener 100% ethanol. Bland grundigt ved hvirvelbehandling.
BEMÆRK: Tilføjelse 0,5 pi glycogen (20 pg / pl) til en udfældning mix hjælper til at visualisere RNA pellet. For at minimere RNA tab, brug silikoniseret, lav-bindende 1,5 ml mikrocentrifugerør. - Udfælde RNA ved -20 ° C i mindst 1 time.
BEMÆRK: Inkuberingen kan udføres natten over. Prøver kan placeres ved -80 ° C samt. - Pellet RNA ved hjælp af centrifugering ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Vask og tør pellet efter beskrivelsen i 7.9.
- Opløs RNA i 10-15 pi DEPC-behandlet vand. Store RNA ved -80 ° C.
- Bestem mængden og renheden af RNA ved at måle OD ved 230 nm, 260 nm og 280 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. Beregn RNA concentration ved at anvende konventionen, at en OD ved 260 nm er lig 40 pg / ml RNA.
BEMÆRK: A 260/280 forholdet mellem "rene" RNA lig 2,0, mens en A 260/230 forholdet være i området fra 2,0-2,2. RNA-prøver med en A 260/280 forholdet mellem 1,7 og 2,0 er egnede til downstream-applikationer såsom cDNA syntese. Til fremstilling af mRNA-seq biblioteker kvaliteten og mængden af RNA bør kontrolleres anvendelse af et automatiseret elektroforese system. Den 28S / 18S forholdet skal være over 1,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere potentialet i eyFLP-MARCM teknik til at generere GFP-mærkede pletter af definerede genotyper i Drosophila EAD blev tre typer af kloner induceret: (1) kontrol udtrykker GFP kun, (2) maligne tumorer, der udtrykker en onkogen form af det lille G-protein Ras (Ras V12) i en baggrund af homozygot tab af et tumorsuppressorgen kradse (scrib 1), og (3) tilgroning men ikke-invasiv ras V12 scrib 1 JNK DN-kloner, hvor Jun N-terminale kinase (JNK) blev inaktiveret ved ekspression af sin dominerende negative formular (figur 4, tabel 1 for genotyper). Det har vist sig, at invasiv af ras V12 scrib 1 klonale tumorer kræver afvigende aktivering af JNK signalering og nedstrøms transskription faktorer 10,12,23,24. Desuden ras V12 scrib 1 Drosophila larve, hvilket resulterer i infiltrering af immunceller (hæmocytter) ind EAD 14,25.
For at overvåge niveauer og rumlige fordeling af JNK aktivitet i mosaik væv og blandt tumorer af forskellige genotyper, den etablerede transgene, blev JNK-responderende TRE-DsRed reporter ansat 26. Konfokal mikroskopi af dissekeret, fikseret EAD og EAD / hjerne-komplekser afslørede markant opregulering af TRE-DsRed reporter-aktivitet i væv, der bærer maligne ras V12 scrib 1 tumorer (figur 4B). Den DsRed signal mærkede ras V12 scrib 1 kloner i EAD (figur 4B) samt tumorceller spredes over hjernen lapper og invaderende VNC (figur 4E, 4F). I modsætning hertil TRE-DsRed reporter aktivity forblev begrænset til en streng af celler der strækker sig fra den antennal for øjet del af kontrol- skiverne (Figur 4A). Blokering JNK signalering resulterede i et dramatisk fald i TRE-DsRed signal i klonal ras V12 scrib 1 JNK DN tumorer (figur 4C, 4D). Disse data giver således funktionel bevis for et krav om JNK signalering at aktivere TRE-afhængige transkriptionel respons i maligne ras V12 scrib 1 tumorer. En slægt-specifikke hmlΔ-DsRed reporter, udtænkt til sporing Drosophila hæmocytter 27,28 viste en akkumulering af immunceller i væv, der bærer maligne ras V12 scrib 1 tumorer (figur 5B). I modsætning hertil blev der påvist kun enkelte hæmocytter eller få lokaliserede hemocyte patches i kontrol og ras V12 scrib en JNK DN mosaik EAD og hjernevæv(Figur 5A, 5C). Immunfarvning med en pan-hemocyte anti-Hemese antistof (H2) 29 bekræftede immun celle identitet hmlΔ-dsRed positive celler (figur 5D, 5E). I overensstemmelse med offentliggjorte rapporter 12,23,24, uvildig kvantificering af tumorindtrængen bekræftede en central rolle JNK signalering at fremme tumor invasion ind i de tilstødende hjernen lapper og VNC (figur 3C). Endelig blev totalt RNA isoleret fra mosaik EAD. Prøver blev underkastet enten til QRT-PCR eller analyseres på et automatiseret elektroforese system til kvalitet og kvantitet. Figur 6A viser signifikant JNK-afhængig opregulering af matrixmetalloproteinase 1 (MMP1) transskript i EAD bærer maligne ras V12 scrib 1 klonale tumorer, hvilket bekræfter den tidligere offentliggjorte undersøgelsesresultater 12,24,30,31. Vurdering af totalt RNA under anvendelse af et automatiseret elektroforese, viste, that tre uafhængige EAD prøver havde en 28S / 18S forholdet over 1,8 (figur 6B). Imidlertid EAD 2 RNA var delvist nedbrudt, reflekteret af et udstrygningspræparat på gelen (figur 6C). I modsætning hertil EAD 3 prøve havde en lav koncentration. Multiple bånd med højere molekylvægt på gel billede (figur 6B) og små toppe på elektroferogram (figur 6C), også foreslået DNA-kontaminering. Således ville kun EAD en prøve være egnet til et præparat af mRNA-seq bibliotek.
Figur 1: Skematisk af MARCM system til generering af genetiske mosaikker i Drosophila EAD og downstream-applikationer (A) MARCM systemet gør det muligt generation af klonede pletter med definerede genetiske læsioner i en ellers vildtype (heterozygot).sammenhæng. Ekspressionen af FLP under kontrol af en vævsspecifik promotor (f.eks eyeless) katalyserer rekombination mellem de to FRT elementer flankerer STOP kassette mærket med en gul (Y) genet (handling> y +> Gal4). Ved fjernelse af STOP-kassetten, den ubikvitært Gal4 transkriptionel aktivator (Act-Gal4) kan drive ekspression af enhver UAS-baserede transgen såsom UAS-GFP (også UAS-ras V12). I en parental celle imidlertid Gal4 aktivitet blokeret af en Gal80 repressor, hvis ekspression styres af et tubulin-promotor (kar-Gal80). I G2-fasen af cellens cyklus, FLP medierer udveksling af de ikke-søsterchromatider mellem de homologe kromosomer distalt for FRT-steder. Adskillelse af de rekombinante kromosomer under mitose vil give anledning til to datterceller, det ene er homozygot mutant for et bestemt genomisk locus (f.eks scrib
Figur 2: Sortering af tredje stadiums larver og repræsentative eksempler på EAD og EAD / hjerne komplekser anvendes til forskellige downstream-applikationer (AB) Fluorescerende mikrografer af tredje stadiums larver bærende kontrol GFP-mærkede kloner induceret med eyFLP-MARCM 82B Green tester.. (A) Repræsentant kontrol larve med kloner begrænset til EAD og hjernen lapper. (B) Et eksempel på en "Leopard larve" bærer GFP-positive kloner i forskellige væv i hele kroppen. (C) Lysfelt billeder af dissekeret EAD og (D) EAD / hjerne-komplekser fastgjort til munden kroge, og (E) EAD renset fra al uvedkommende væv, herunder munden kroge. Scale barer = 2 mm (AB) og 500 um (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Kvantificering af tumorindtrængen (A) Fluorescerende konfokale billeder af hjerner dissekeret fra ras V12 scrib 1 larver (7 dage AEL) repræsenterer den virkelige eksempler på de fire forskellige kvaliteter af tumorindtrængen spænder fra ikke-invasiv (Score 0), en hjerne lap invaderet (Score 1) begge hjernen lapper invaderet (Score 2) til en stærk tumor invasion med klonal væv, der dækker både hjernen lapper og indtaste VNC (Score 3). Billeder er fremskrivninger af flere konfokale sektioner og eksempler på Resultat 2 og 3 er syet fra 2 x 2 konfokale billeder. Skalapanelerne = 100 um. (B) Et eksempel på en anonymiseret objektglas med faste hjerner anvendes til unbiasedudføre under en fluorescerende stereomikroskop. Scorede hjerner er markeret med en pen til at forhindre dublerede registrering. Scale bar = 500 um (C) I forhold til meget invasive ras V12 scrib 1 tumorer, hæmning af JNK signalering (ras V12 scrib en JNK DN) elimineret invasion af klonede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Aktivering af transkriptionelle TRE-DsRed reporter i maligne ras 'V12' scrib '1 klonale tumorer er JNK-afhængig (A. TRE-DsRed reporter mærket en smal stribe af celler, der kører fra antennal til øjet del (pilespidser). (B) Aktiviteten af TRE-DsRed reporter blev markant forøget i ras V12 scrib 1 GFP-positive kloner sammenlignet med den omgivende ikke-klonal EAD epitel. (C) Hæmning af JNK aktivitet resulterede i en klar reduktion af DsRed signal intensitet i ras V12 scrib en JNK DN-kloner. (D) Yderligere forbedring af DsRed signal afslørede ikke-autonom aktivering af JNK signalering i celler omgiver ras V12 scrib en JNK DN-kloner. (E) På dag 8 AEL, ras V12 scrib 1 celler overgrew hele EAD og spredt over hjernen lapper til VNC (pil). (F) De klonede celler invaderer VNC (nærbillede af regionen marked med pilen i E) blev beriget for DsRed signalet. (AC) Vis fremskrivninger af flere konfokale sektioner, (E) er syet fra 3x3 konfokale billeder og (D, F) repræsenterer enkelt sektion. Scale barer = 50 um. EAD, øje / antennal disk; BL, hjerne lobe; VNC, ventral nerve ledning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Lineage-specifikke HML Δ -DsRed transgene reporter afslører berigelse af ras V12 scrib en tumor-associeret hæmocytter (A) I kontrol EAD, hmlΔ-DsRed reporter-mærket hemocyte ko sters er fanget i fordybningerne i øjet og antennal epitel. (B) EAD og hjernevæv består af ras V12 scrib 1 GFP-mærket tumorer udviste et forøget antal af hæmocytter spredt over den klonale væv. (C) Antallet af tilhørende hæmocytter faldt dramatisk på hæmning af JNK signalering i ras V12 scrib en JNK DN mosaik væv. (DE) HmlΔ-dsRed positive hæmocytter blev også mærket med en H2-antistof, der registrerer pan-hemocyte markør Hemese. (AC) Vis fremskrivninger af flere konfokale sektioner, (A) er syet fra 2 x 2 og (BC) er syet fra 3 x 3 konfokale billeder. (DE) Repræsentere enkelte sektioner. Scale barer = 100 um (AC) og 10 um (DE). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:.. Vurdering af mængden og kvaliteten af total RNA isoleret fra dissekeret EAD (A) Et repræsentativt eksempel på QRT-PCR resultater ved hjælp af fire biologiske replikater for hver genotype MMP1 transkriptniveauer var normaliseret til rp49. Fold ændringer i genekspression blev beregnet under anvendelse af den relative standardkurve metode 32. Dataene er middelværdier ± SEM; *** P <0,001 ved anvendelse af Students uparrede to-halet t-test med ulige varians. (B, C) Vurdering af total RNA kvalitet og mængde ved hjælp af et automatiseret elektroforese system. Den virtuelle gel billede (B) viser de to fremtrædende bands i 18S og 28S rRNA som svarer til de veldefinerede toppe på elektroferogrammer (C). DNA-kontaminering og RNA-nedbrydning reflekteres af såMear (pilespidser) og extranumerary bands og toppe (pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fly Stammer | Source / Kommentarer |
| eyFLP1; handling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, karbad-Gal80 | eyFLP-MARCM 82B Green Tester 11 |
| w; UAS-ras V12; FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; UAS-ras V12; UAS-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | denne undersøgelse, w; hmlΔ-DsRed fra Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B | denne undersøgelse |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | denne undersøgelse |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | denne undersøgelse, w; TRE-DsRed fra Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B | denne undersøgelse |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B scrib 1 / TM6B | denne undersøgelse |
Tabel 1: Sammenfatning af Drosophila linjer anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De teknikker til at danne genetiske mosaikker i Drosophila er blandt de mest avancerede værktøjer til at analysere og manipulere genfunktion 33. Den eyFLP-MARCM systemet har vist stærke og robuste som den tillader induktionen af visuelt markeret, genetisk definerede kloner i et rumligt begrænset vis, dvs i væv, hvor den eyeless enhancer er aktiv 9,18. Dette er især vigtigt, når flere genetiske læsioner er kombineret i de samme celler. Mens disse meget afvigende plastre tillader larveudviklingen når begrænset til EAD og hjerne neuroepithelia, kan de forårsage letalitet, når spredt i hele larvernes kroppen som i tilfældet med varmechok-kontrollerede FLP (hsFLP) kloner. Betydeligt, induktion af kloner i fluen EAD epitel, hvor aktiverede onkogener kombinere med tab af tumorsuppressorer rekapitulerer fremkomsten og udviklingen af solide epiteliale tumorer i nogle menneskelige kræftformer. HoWever, at systemet har også sine begrænsninger, som vil blive kortvarigt diskuteret. Eftersom insekter har et åbent kredsløb, har sande metastaser som observeret i humane cancere ikke forekomme. Derfor den komplekse proces af metastatisk spredning kan ikke trofast modelleret i Drosophila. Alligevel EAD tumorer, såsom de ras V12 scrib 1 kloner do vise maligne egenskaber som de nedbryder basalmembranen omkring EAD og invadere tilstødende hjernen 11,12,31. Graden af tumor aggressivitet kan kvantificeres og sammenlignes mellem forskellige genotyper som beskrevet i denne undersøgelse. Det er også vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen af specifikke genetiske læsioner i mosaik EAD kan påvirke udviklingsmæssig timing og varighed af larvernes vækst. Iscenesættelse af larver vil afgøre, om analyse af mosaik væv vil ske ved hjælp af dyr af samme kronologiske eller udviklingsstadiet. Udførelse et pilotforsøg for at vurdere virkningen af enny EAD klonal genotype på udviklingsmæssige timing er ønskelig.
Der er tekniske begrænsninger som godt. Det første er antallet af forskellige klonale genotyper, der kan bygges med eyFLP-MARCM værktøjet er stor, men ikke uendelig. For eksempel er der kombinerer to mutant alleler, der findes på forskellige kromosomer hindres af lav effektivitet af rekombination på begge kromosomer samtidig og gener lokaliseret på den lille fjerde kromosom er generelt utilgængelige. Gene knockdown hjælp transgene RNAi er en alternativ løsning. Det er imidlertid vigtigt at indse, at transgener ikke udtrykkes umiddelbart efter mitotisk rekombination - ikke før Gal80 repressoren nedbrydes. Aktiviteten af Gal4 / UAS ekspressionssystem kan forøges ved voksende larver ved 29 ° C. Det er dog vigtigt at huske på, at forhøjet temperatur påvirker forskellige udviklingsmæssige, fysiologiske og molekylære parametre, herunder vækst, udviklingsmæssige timing, metabolism og genekspression 34-37. Således ville tilpasninger til de medfølgende protokoller såsom iscenesættelse af larver eller antallet af dissekeret EAD for transkriptom profilering være nødvendig.
De eyFLP-MARCM testere er ikke blandt de sundeste stammer. De mange transgener i ét genom kompromis flyve fitness og frugtbarhed. Disse lagre kræver ekstra opmærksomhed skal fastholdes og udbygges til store samlinger af jomfruelige hunner. Som dokumenteret i denne undersøgelse MARCM 82B Green tester linie 11, selv om levedygtig når homozygote, er genetisk ustabile. Dette er indlysende fra den spontane optræden af "Leopard larver", der viser ektopiske, GFP-mærkede kloner inden for forskellige polyploide væv, herunder tarmen, tracheae, fedt kroppen, og larvernes epidermis. Dette fænomen forekommer i alle krydser uafhængig af faderens genotype. Vi formoder, at de ektopiske GFP patches skyldes ukontrolleret, stokastisk rekombination mellem to FRT steder i FLP-out kassette, der forårsager fjernelsen af den gule + markør og "STOP kassette". I de polyploide væv, kan tubulin-promotor-drevet Gal80 repressor være utilstrækkelig til at blokere Gal4 aktivitet. Tilstedeværelsen af genetisk modificerede celler i andre væv end EAD og hjerne kunne fremkalde systemiske signaler, som kan påvirke adfærden af de eksperimentelle kloner. Disse "leopard larver" bør derfor udelukkes fra analyser. Desuden har vi rutinemæssigt genetablere MARCM 82B Green tester fra enkelte mand-kvinde kors.
På trods af de ovennævnte faldgruber, de anvendelser af eyFLP-MARCM system til at studere gen funktioner og samspillet mellem klonede tumorer og deres omgivelser er mangfoldige. Indførelse af GAL4 / UAS-uafhængig binær ekspressionssystemer, såsom LexA / LexOp 38 eller lægemiddel styrbar QF / Quas / QS 39,40 ville give en god kontrol over transgen expression og / eller samtidig mærkning og manipulation af forskellige cellepopulationer herunder klonede, ikke-klonede epitelceller og hæmocytter. Sådanne mosaik væv kan igen behandles i henhold til protokoller, der er beskrevet her.
Metoden til dissektion af mosaik EAD og EAD / hjerne komplekser fra den tredje stadie larver (Protokol afsnit 3) kan anvendes på tidligere udviklingsstadier så godt. Vigtigt er det, at protokollen for EAD / hjerne komplekser tillader genvinding af vingen, haltere og ben fantasiens diske. Skulle disse anvendes til RNA isolering (Protokol afsnit 3.3.2 og 7), bør skive af interesse renses mod fremmed væv og behandles på samme måde som EAD. I betragtning af deres mindre størrelse, bør antallet af haltere og ben diske indsamlet øges til at erhverve tilstrækkelig mængde RNA.
Protokollen for udvinding af total RNA fra EAD (Protokol afsnit 7) er baseret på RNA-lysis reagens fås fra forskellige kommercielle vendors (se liste over materialer / udstyr). Den overordnede succes i proceduren afhænger hovedsageligt af: (i), der har tilstrækkeligt antal larver, (ii) er hurtig og præcis, mens dissekere, og (iii) at holde prøver fri fra RNaser. Hold arbejdsplads og instrumenter rene, handsker, hjælp RNase-fri plast ware og løsninger, og holde prøver på is alle reducerer RNA-nedbrydning. For at undgå forurening af RNA med enhver genomisk DNA, som måske ikke helt fjernet af DNase behandling (Protokol afsnit 7.11), er det vigtigt at undgå interfase ved indsamling vandfasen for første gang (Protokol afsnit 7.6). Både DNA-kontaminering og RNA-nedbrydning kan afsløres ved at køre prøver på et automatiseret elektroforese (figur 6B, 6C). RNA isolering protokol har en bredere anvendelse. Det er blevet anvendt til RNA ekstraktion fra hele larver på forskellige udviklingsstadier, fra voksne, og forskelligelarver organer. Det opnåede RNA var egnet til både QRT-PCR og hele genomet transkriptom analyse ved mRNA-seq 20,24,41,42. Sammenlignet med QRT-PCR, der kvantificerer snesevis af udvalgte mRNA på de fleste, fordomsfri mRNA sekventering tillader genom-dækkende udtryk analyser. Således kan man sammenligne hele transkriptom underskrifter fra tumorer induceret af specifikke genetiske læsioner på forskellige stadier af tumorigenese 24. Det er vigtigt at huske på, at RNA kommer fra hele diske, så resultaterne ikke blot vil afspejle ændringer i de kloner, men også i det omkringliggende, ikke-klonal væv. Udførelse fluorescerende aktivere cellesortering (FACS) på dissocierede mosaik EAD ved at tilpasse tilgængelige protokoller 43,44 kunne anvendes til at bestemme transskriptionel underskrift af specifikke cellulære populationer, f.eks klonal (GFP +) og ikke-klonal (GFP -) celler.
Den her beskrevne fiksering og immunfarvning protokol er egnet til simultaneous visualisering af proteiner af interesse med specifikke antistoffer og aktivitet af transgene journalister. Både GFP signal mærkning klonale celler og DsRed fluorescens produceret af en af de to transgene reportere anvendes i denne undersøgelse er bevaret i hele fiksering og immunfarvning og kan visualiseres direkte ved konfokal mikroskopi. antistoffer mod de fluorescerende proteiner, kan imidlertid forstærke signalet intensitet. Ligeledes vil anvendelse af et anti-β-galactosidase-antistof lette afsløringen af transgene reportere baseret på det bakterielle lacZ-genet. Relative reporter aktiviteter kan vurderes ved at måle de relative intensiteter af pixel kloner versus ikke-klonal væv anvendelse af billedanalyse-software (f.eks Fiji, ImageJ). Når man sammenligner reporter aktivitet blandt forskellige klonale genotyper, skal indstillingerne billedoptagelse holdes konstant (Protokol afsnit 5 og referencer 21,22). Selvom protokollen fungerer godt med mange forskellige antibodies, kan det være nødvendigt at optimere anbefalede antistofkoncentrationer. Ændringer kan også være påkrævet i fiksering tid, typen og koncentrationen af detergent (Triton X-100, Tween-20, saponin) og fiksativ (8% PFA, 4% formaldehyd, EtOH).
I modsætning til de protokoller beskrevet ovenfor, kvantificering af tumorindtrængen er begrænset til det tredje instar larvestadiet og EAD / hjerne-kompleks. Ikke desto mindre kan den samlede rationale gælder for kvantitative undersøgelser, hvor kognitiv skævhed skal undgås. Fremgangsmåden kræver grundighed. Som tumor malignitet stigninger i tid, er det vigtigt at sammenligne larver på samme alder (f.eks, 7 eller 8 dage efter æglægning). Med tiden en klonal tumor kan overgrow massivt, men tumorcellerne kan forblive inden for EAD. Det trin, hvor hjerner er adskilt fra EAD (protokollen sektion 4.4.1) er derfor afgørende for at undgå falske positive invasiv tæller. Montering af hjerner med vedlagte EAD vil Flatten væv, der forårsager den tilgroede EAD at dække hjernens strukturer og dermed forhindre enhver kvantificering. Ideelt set ville man gerne fange den invasive proces direkte i levende larve. Transgene reportere til at visualisere de involverede cellepopulationer og væv er tilgængelige og kan kombineres med eyFLP-MARCM system. Desværre, den invasive proces tager flere timer til dage, en tidsramme, der er uforenelig med at holde larver i live, mens du stadig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
