Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Varianten sind Werkzeuge zur Untersuchung von Proteinlokalisierung und Dynamik von Ereignissen wie Zytoskelett-Umbau und Vesikeltransport in lebenden Zellen weit verbreitet. Quantitative Methoden unter Verwendung von chimären GFP-Fusionen wurden für viele Anwendungen entwickelt; jedoch GFP ist etwas resistent gegen Proteolyse, wodurch seine Fluoreszenz bleibt im Lysosom / Vakuole, die Quantifizierung von Frachthandels in der endocytischen behindern können. Ein alternatives Verfahren zur Quantifizierung Endozytose und post-endocytic Handel Ereignisse nutzt superecliptic pHluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP, die in sauren Umgebungen abgeschreckt wird. Chimäre Fusion von pHluorin zum Zytoplasmaschwanz von Transfracht-Proteine führt zu einer Dämpfung der Fluoreszenz bei der Gründung der Ladung in multivesicular Körper (MVBs) und Auslieferung an die Lysosomen / Vakuole Lumen. Somit Löschung der Vakuole Fluoreszenz erleichtert quantifiKation der Endozytose und der frühen Ereignisse im endocytischen. Dieses Papier beschreibt Methoden pHluorin-markierte Frachten für die Quantifizierung der Endozytose über Fluoreszenzmikroskopie sowie populationsbasierten Assays Durchflusszytometrie verwendet wird.
Vesikeltransport spielt eine wichtige Rolle Organell Identität und Funktion in eukaryontischen Zellen beibehalten wird, und ist ein Schlüsselmechanismus Protein und Membranzusammensetzung der einzelnen zellulären Kompartimenten zur Regulierung. An der Plasmamembran, Fusion von Vesikeln Exozytose liefert neue Proteine und Membranen auf der Oberfläche der Zelle, während die erzeugten Bläschen durch Endozytose Membran und Proteine von der Oberfläche zum Lysosom zur anschließenden Wiederverwertung oder Targeting entfernen. Somit ist Endozytose wichtig für die Nährstoffaufnahme und für Reaktionen auf die extrazelluläre Umgebung. Exozytose und Endozytose werden ausgewogen Plasmamembranoberfläche zu regulieren, und der Umsatz von beschädigten Proteinen zu ermöglichen.
Studien in Hefe und Säugerzellen haben eine große Anzahl von Proteinen in der Endozytose, sowie mehrere endocytic Wegen beteiligt identifiziert, die zu einer Vielzahl von en Internalisierung spezifischer Frachten oder diese Handlung als Reaktion fördernbungsbedingungen. Die am besten untersuchten Weg ist Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), in der Clathrin und zytosolischen akzessorischen Proteine in einer Schichtstruktur zusammenstellen, die im Entstehen begriffenen endocytic Vesikel zu stabilisieren. Experimente in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae haben wichtige Einblicke in die Dynamik und die Reihenfolge der Rekrutierung ergab für viele endocytic Proteine 1-3. Bemerkenswerterweise wird die CME Maschinen stark durch die Evolution konserviert, so dass die Mehrheit der CME-verwandten Proteinen in Hefe menschliche Orthologe haben; Somit Hefe Knospung hat ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen der Endozytose gegeben, die in höheren Eukaryonten konserviert sind. Zum Beispiel Studien Bäckerhefe mit bestimmt, dass die Bildung und Reifung von CME-Strukturen (als kortikalen Aktin-Patches in Hefe bezeichnet) umfasst die schrittweise Einstellung vieler Proteine, beginnend mit Clathrin und Fracht-bindenden Adapterproteine, gefolgt von Einstellung zusätzlicher endocytic Zubehör Proteine,Aktivierung von Arp2 / 3-vermittelte Aktin – Polymerisation und die Rekrutierung von Proteinen in Vesikel scission 1,2 beteiligt. Die Rekrutierung von CME Maschinen Proteine Aktin-Patches zu kortikalen ist eine hoch geordnete und stereotypisch Prozess, und die genaue Reihenfolge der Rekrutierung für viele Proteine in Bezug auf andere Komponenten der CME Maschinen etabliert. Wichtig ist , dass die jüngsten Studien haben eine ähnliche Reihenfolge der Rekrutierung für CME Proteine bei Clathrin beschichteten Gruben in Säugetierzellen 4 bestätigt.
Neben CME besitzen viele Zelltypen eine oder mehrere Clathrin-unabhängige endocytic (CIE) Wege , die auf alternative Mechanismen beruhen Vesikelbildung und Internalisierung von der Plasmamembran 5-7 zu fördern. In Hefe identifizierten wir vor kurzem eine CIE – Weg, der die kleine GTPase Rho1 und seine Aktivierung Guaninnukleotidaustauschfaktor (GEF), Rom1 8,9 verwendet. Rho1 aktiviert die formin Bni1 Actinpolymerisation 1 zu fördern0,11, die für diese Form der Clathrin-unabhängige Endozytose in Hefe 12 erforderlich ist. Außerdem rekrutieren die α-Arrestin Familie von Proteinen , die Ubiquitin – Ligase Rsp5 zur Ladung Ubiquitinierung und anschließende Internalisierung durch CME 13-17, und auch fördern Ladung Internalisierung über den CIE – Weg, möglicherweise durch direkte Interaktion mit Proteinen beteiligt in CIE 18 fördern. Eine Vielzahl von CIE Wege existieren auch in Säugerzellen, einschließlich Clathrin-unabhängige und phagozytischen Bahnen , die auf der Rho1 Ortholog verlassen, RhoA 9,19. Die Rolle von RhoA in Säuger CIE ist wenig bekannt; also Studien in Bäckerhefe kann zusätzliche mechanistische Erkenntnisse liefern, die auf Säugetier CIE anwendbar sind.
Eine genaue Quantifizierung von endocytic Ereignisse können, Endozytose bei der Regulierung der wichtige Informationen über die Rollen von spezifischen Proteinen liefern und die Auswirkungen der Mutationen auf die Ladung Verinnerlichung oder progressio offenbarenn durch den endocytischen. Zu diesem Zweck können biochemische Verfahren verwendet werden, Liganden-Aufnahme zu überwachen oder Abbauraten von endocytischen Frachtproteinen zu messen. In lebenden Zellen Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Frachten von Interesse ermöglicht die direkte Visualisierung von Frachtverkehr. Allerdings GFP-markierten Frachten sind von begrenztem Nutzen für die Quantifizierung der Endozytose, weil GFP zu einem Abbau in den Lysosomen (oder Vakuole in Hefe) resistent ist. Außerdem ist GFP – Fluoreszenz nur teilweise empfindlich gegenüber Änderungen in pH und bleibt innerhalb der Vakuole Lumen 20,21 nachweisbar. Folglich Fluoreszenz des GFP-Tag besteht in der Vakuole, lange nachdem der Rest der Ladung abgebaut worden ist, und ganze zellbasierten Quantifizierung von Ladungsintensität kann durch langfristige GFP-Fluoreszenz in die Vakuole ungenau sein.
Um die Nachteile von vakuolären GFP-Fluoreszenz zu überwinden, wir zuvor Verwendung superecliptic pH gemachtluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP , die hell bei neutralem pH fluoresziert, verliert aber Fluoreszenz in sauren Umgebungen , wie beispielsweise das Lumen der Vakuole / Lysosomen 20,22,23. Eine pHluorin Tag auf der zytoplasmatischen Schwanz von endocytischen cargos Platzierung erlaubt die Visualisierung der Frachten an der Plasmamembran und am frühen Endosomen, in denen die pHluorin Tag in das Zytoplasma (1A) ausgesetzt bleibt. Bereits Endosomen reifen, die Endosomen Sortierkomplexe , die für Transport (ESCRT) Maschinen – Pakete oberflächen lokalisierte Frachten in Vesikeln, die in das Lumen des Endosomen Knospe, Erzeugung multivesicular Körper (MVBs) 24. Für Frachten, die in interne MVB Vesikel aufgenommen wurden, steht die pHluorin Tag in Richtung der Vesikel Lumen. Interne MVB Vesikel werden angesäuert; so verlieren pHluorin-markierte Frachten Fluoreszenz auf frühe Endosomen , wie sie reifen in MVBs 20. Die anschließende Verschmelzung der MVB mit der Vakuole liefert die MVB luminalen Inhaltefür den Abbau und pHluorin Tags bleiben in der sauren Umgebung der Vakuole Lumen gequencht.
Dieses Dokument enthält detaillierte Beschreibungen der quantitativen endocytic Assays Cargos mit zytoplasmatischen pHluorin Tags in Hefe verwendet. Die Stämme pHluorin-markierte Frachten exprimieren, können in kinetische und / oder Endpunkt-Assays verwendet werden, abhängig von den Eigenschaften und den Handel Verhalten der spezifischen Ladung. Darüber hinaus sind einige pHluorin-tagged cargos zugänglich Hochdurchsatz-Analyseverfahren, einschließlich Durchflusszytometrie. Wichtig ist, dass die pHluorin Tag ein vielseitiges Werkzeug für die in lebenden Zellen endocytic Ereignisse zu studieren, so dass eine Quantifizierung der Endozytose und den Vergleich von endocytic Funktion in Wildtyp und Mutantenstämmen.
Anwendungen von pHluorin zur Quantifizierung von endocytischen Ereignisse in Hefezellen macht von Transmembran- cargos in der die fluoreszierende Markierung an den zytoplasmatischen Schwanz des Proteins (1A) fusioniert ist. Für die Tests hier beschriebenen Frachten sind hell fluoreszierende, wenn die pHluorin Tag neutralen Umgebungen ausgesetzt ist, aber abgeschreckt werden, wenn die pHluorin Tag sauren Bedingungen trifft. So a pHluorin-markierte endocytic Ladung leicht an der zytoplasmatischen Gesicht…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |