Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על גירסאותיה משמשים כלים נרחב ללימוד לוקליזציה חלבון ודינמיקה של אירועים כגון שיפוץ cytoskeletal וסחר שלפוחי בתאים חיים. מתודולוגיות כמותיות באמצעות התכת GFP כימרי פותחו עבור יישומים רבים; עם זאת, GFP הוא מעט עמיד proteolysis, ובכך הקרינה שלה נמשכת ליזוזום / vacuole, אשר יכול לעכב כימות של סחר המטען במסלול endocytic. שיטה חלופית לכימות אנדוציטוזה ופוסט endocytic אירועים סחר עושה שימוש superecliptic pHluorin, וריאנט pH רגיש של GFP כי הוא הרווה בסביבה חומצית. היתוך Chimeric של pHluorin לזנב cytoplasmic של תוצאות חלבונים מטען הטרנסממברני בתוך ריסון של הקרינה על ההתאגדות של המטען לתוך הגוף multivesicular (MVBs) והסעה לבית לומן ליזוזום / vacuole. לכן, מרווה הקרינה vacuolar מקלה quantifiקטיון של אנדוציטוזה ואירועים מוקדם מסלול endocytic. מאמר זה מתאר שיטות באמצעות מטענים מתויגים pHluorin כימות של אנדוציטוזה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם מבחנים מבוססי אוכלוסייה באמצעות cytometry זרימה.
סחר שלפוחי ממלא תפקיד חשוב בשמירה על הזהות אברון ותפקוד בתאים איקריוטיים, והוא מכשיר מרכזי להסדרת הרכב חלבונים בממברנה של תאים סלולריים הפרט. על הממברנה הפלזמה, שילוב של שלפוחית exocytic מספק חלבונים וממברנות חדשים אל פני השטח של התא, ואילו שלפוחית שנוצרה באמצעות אנדוציטוזה להסיר קרום וחלבונים מפני השטח למחזור עקב או מיקוד אל ליזוזום. לפיכך, אנדוציטוזה חשוב ספיגת חומרים מזינה ועל תגובות הסביבה התאית. Exocytosis ו אנדוציטוזה מאוזנים להסדיר שטח הממברנה, וכדי לאפשר מחזור של חלבונים פגומים.
עיונים שמרים בתאי יונקים זיהו מספר רב של חלבונים המעורבים אנדוציטוזה, כמו גם מסלולים endocytic מרובים שמקדמים הפנמה של מטענים ספציפיים או מעשה שיש בהם בתגובה במגוון enתנאים סביבתיים. מסלול-למד הכי טוב הוא אנדוציטוזה מתווכת clathrin (CME), שבו clathrin אביזר cytosolic חלבונים להרכיב למבנה מעיל לייצב את שלפוחית endocytic המתהווה. הניסויים cerevisiae Saccharomyces שמרים ניצני הניבו תובנות חשובות על הדינמיקה והסדר של גיוס חלבונים endocytic רבים 1-3. יש לציין, כי מכונה CME הוא שמור ביותר בתהליך האבולוציה כזה שרוב החלבונים הקשורים CME בשמרים יש orthologs אדם; וכך, נבגי שמרים כבר כלי חשוב להבנת המנגנונים של אנדוציטוזה כי הם משומר אאוקריוטים גבוה. לדוגמא, מחקרים באמצעות שמרי ניצנים נקבעו כי היווצרות והתבגרות של מבני CME (המכונה טלאים יקטינו קליפת מוח כמו שמרים) כרוך הגיוס הרציף של חלבונים רבים, החל clathrin וחלבוני מתאם מחייב למשא ואחריו גיוס של אבזר endocytic נוסף חלבונים,הפעלת Arp2 / פילמור אקטין 3 בתיווך, וגיוס של חלבונים המעורבים 1,2 scission שלפוחית. גיוס של חלבונים מכונים CME כדי קליפת מוח טלאים יקטינו הוא תהליך הורה מאוד וסטריאוטיפי, ואת הסדר המדויק של גיוס חלבונים רבים כבר נקבע ביחס לרכיבים אחרים של מכונות CME. חשוב לציין, מחקרים שנעשו לאחרונה אישרו צו דומה של גיוס חלבונים CME בבורות מצופה clathrin בתאי יונקים 4.
בנוסף CME, סוגי תאים רבים להחזיק אחד או יותר מסלולי endocytic עצמאי-clathrin (CIE) המסתמכים על מנגנונים חלופיים לקדם היווצרות שלפוחית והפנמה מן קרום הפלזמה 5-7. בשמרים, אנו לאחרונה זיהינו מסלול CIE אשר מנצל את Rho1 GTPase הקטן גורם חליפי נוקלאוטיד גואנין ההפעלה שלה (GEF), Rom1 8,9. Rho1 מפעיל את formin Bni1 לקדם פילמור אקטין 10,11, אשר נדרש עבור סוג זה של אנדוציטוזה עצמאית-clathrin בשמרים 12. יתר על כן, המשפחה-arrestin α של חלבונים לגייס את האנזים היוביקוויטין Rsp5 לקדם ubiquitination מטען והפנמה עוקבות דרך CME 13-17, וגם לקדם הפנמה מטענים דרך מסלול CIE, ואולי באמצעות אינטראקציה ישירה עם חלבונים המעורבים CIE 18. מגוון מסלולי CIE קיים גם בתאי יונקים, כוללים מסלולי clathrin-עצמאי phagocytic המסתמכים על ortholog Rho1, RhoA 9,19. תפקידו של RhoA ב יונקים CIE הוא הבין היטב; לכן, מחקרים בשמרי ניצנים עשויים לספק תובנות מכניסטית נוספים החלימו על CIE היונק.
כימות מדויק של אירועי endocytic יכול לספק מידע חשוב על התפקידים של חלבונים ספציפיים בויסות אנדוציטוזה, והוא יכול לחשוף את ההשפעות של מוטציות על הפנמת מטען או progression דרך מסלול endocytic. לשם כך, בשיטות ביוכימיות יכולות להיות מנוצלות כדי לפקח ספיג ליגנד או כדי למדוד את שיעורים של פירוק של חלבוני מטען endocytic. בתאים חיים, שילוב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על גרסותיה כדי מטעני עניין מאפשר הדמיה ישירה של כלי רכב כבדים. עם זאת, מטענים מתויג GFP הם של שימוש מוגבל כימות של אנדוציטוזה כי GFP הוא עמיד בפני פירוק בתוך ליזוזום (או vacuole בשמרים). יתר על כן, GFP הקרינה היא רק רגיש באופן חלקי לשינויים ב- pH, ונשאר לזיהוי בתוך vacuole לומן 20,21. כתוצאה מכך, הקרינה של תג ה- GFP נמשכת vacuole הרבה אחרי שאר המטען כבר מושפלת, ושלמי כימותים מבוססי תאים של עוצמת מטען עשויים להיות לא מדויקים בשל קרינת GFP לטווח ארוכה של vacuole.
על מנת להתגבר על החסרונות של GFP הקרינה vacuolar, אנחנו קודם לכן עשו שימוש pH supereclipticluorin, וריאנט רגיש-pH של GFP כי מאיר במאור ב- pH נייטרלי, אבל מאבד הקרינה בסביבה חומצית כגון לומן של vacuole / ליזוזום 20,22,23. הצבת תג pHluorin על הזנב cytoplasmic של מטענים endocytic היתרי להדמיה של מטענים על קרום פלזמה על endosomes מוקדם, שבו תג pHluorin נשאר חשוף אל הציטופלסמה (איור 1 א). כפי endosomes מוקדם להתבגר, במתחם מיון endosomal הנדרש להובלה (ESCRT) מטענים משטח-מקומי חבילות מכונות לתוך שלפוחית כי ניצן לתוך לומן של אנדוזום, יצירת גופים multivesicular (MVBs) 24. עבור מטענים כי שולבו שלפוחית MVB פנימית, תג pHluorin פונה כלפי לומן השלפוחית. שלפוחית MVB הפנימית acidified; וכך, מטענים מתויגים pHluorin לאבד קרינה על endosomes מוקדם כשהם מתבגרים לתוך MVBs 20. ההיתוך הבא של MVB עם vacuole מספק את תוכן luminal MVBהשפלה, ותגיות pHluorin נשארים הרווה בסביבה החומצית של לומן vacuole.
מאמר זה מספק תיאורים מפורטים של מבחני endocytic כמותית באמצעות מטענים עם תגי pHluorin ציטופלסמית בשמרים. זנים להביע מטענים מתויג pHluorin יכול לשמש מבחני קינטית ו / או נקודות קצה, בהתאם להתנהגות נכסים וסחר של מטענים ספציפיים. בנוסף, כמה מטענים מתויג pHluorin ניתנים שיטות ניתוח תפוקה גבוהה, כולל זרימת cytometry. חשוב לציין כי תג pHluorin הוא כלי תכליתי עבור חוקר ענייני endocytic בתאים חיים, המאפשר כימות של אנדוציטוזה והשוואה של פונקציה endocytic ב wild-type ו זנים מוטנטים.
יישומים של pHluorin כימות של אירועי endocytic בתאי שמרים עושים שימוש מטענים הטרנסממברני שבו תג הניאון הוא קבע את זנב cytoplasmic של החלבון (איור 1 א). עבור המבחנים המתוארים כאן, מטענים הם פלורסנט במאור פנים כאשר תג pHluorin חשוף בסביבות ניטראליות, אבל להיות רווה כאשר תג pHluorin מפ?…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |