Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter används allmänt verktyg för att studera protein lokalisering och dynamik händelser såsom cytoskelettala ombyggnad och vesikulär handel med levande celler. Kvantitativa metoder använder chimära GFP fusioner har utvecklats för många tillämpningar; dock GFP något resistenta mot proteolys, därmed dess fluorescens kvarstår i lysosomen / vakuolen, som kan hindra kvantifiering av last handel i den endocytiska vägen. En alternativ metod för att kvantifiera endocytos och post-endocytiska trafficking händelser utnyttjar superecliptic pHluorin, en pH-känslig variant av GFP som släckes i sura miljöer. Chimär fusion av pHluorin till den cytoplasmatiska svansen av translast proteiner resulterar i en dämpning av fluorescens vid inkorporering av lasten i multivesikulära kroppar (MVBs) och leverans till lysosom / vakuol lumen. Således, utsläckning av vakuolär fluorescens underlättar quantifiningen av endocytos och tidiga händelser i endocytiska vägen. Detta dokument beskriver förfaranden som använder pHluorin-märkta last för kvantifiering av endocytos via fluorescensmikroskopi, samt populationsbaserade analyser med hjälp av flödescytometri.
Vesikulär trafficking spelar en viktig roll för att upprätthålla organell identitet och funktion i eukaryota celler, och är en viktig mekanism för att reglera protein och membran sammansättningen av enskilda cellulära avdelningar. Vid plasmamembranet, levererar fusion av exocytiska vesiklar nya proteiner och membran på ytan av cellen, medan vesiklar genererade genom endocytos avlägsna membran och proteiner från ytan för efterföljande återanvändning eller målinriktning till lysosomen. Således är viktigt för näringsupptag och för svar på den extracellulära omgivningen endocytos. Exocytos och endocytos balanseras för att reglera plasmamembran yta, och att tillåta omsättning av skadade proteiner.
Studier i jäst och däggdjursceller har identifierat ett stort antal proteiner som är involverade i endocytos, liksom flera endocytiska vägar som främjar internalisering av specifika last eller att agera som svar på en mängd olika svjömässiga förhållanden. Den bästa-studerade reaktionsvägen är clathrin-förmedlad endocytos (CME), i vilken clathrin och cytosoliska accessoriska proteiner montera in ett lager struktur för att stabilisera den begynnande endocytiska vesikeln. Experiment i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har gett viktiga insikter i dynamiken och ordning rekrytering för många endocytiska proteiner 1-3. Noterbart är maskiner och CME starkt konserverad genom evolutionen, så att majoriteten av CME-relaterade proteiner i jäst har mänskliga ortologer; alltså, knoppande jäst har varit ett viktigt verktyg för att förstå mekanismerna för endocytos som är bevarade i högre eukaryoter. Till exempel, studier med användning av knoppande jäst bestämdes att bildning och mognad av CME strukturer (kallad kortikala aktin patchar i jäst) involverar den sekventiella rekrytering av många proteiner, som börjar med clathrin och lastbindande adaptorproteiner, följt av rekrytering av ytterligare endocytiska tillbehöret proteiner,aktivering av Arp2 / 3-medierad aktin polymerisation, och rekrytering av proteiner involverade i vesikler uppdelning 1,2. Rekrytering av CME maskiner proteiner för att kortikala aktin plåster är en mycket beställt och stereotypa process, och den exakta ordningen för rekrytering till många proteiner har fastställts med avseende på andra komponenter i maskiner och CME. Viktigt har nya studier bekräftade en liknande ordning rekrytering för CME proteiner vid clathrin-belagda gropar i däggdjursceller 4.
Förutom CME, många celltyper har en eller flera clathrin oberoende endocytiska (CIE) vägar som är beroende av alternativa mekanismer för att främja vesikelbildning och internalisering från plasmamembranet 5-7. I jäst, nyligen identifierade vi en CIE väg som utnyttjar små GTPas Rho1 och dess aktiverande guaninnukleotidutbytesfaktor (GEF), Rom1 8,9. Rho1 aktiverar formin Bni1 att främja aktin polymerisation 10,11, vilket krävs för denna form av clathrin oberoende endocytos i jäst 12. Dessutom α-arrestin familj av proteiner rekrytera ubiquitin ligas Rsp5 att främja last ubikvitinering och efterföljande interna genom CME 13-17, och även främja last interna via CIE vägen, eventuellt genom direkt interaktion med proteiner involverade i CIE 18. En mängd olika CIE vägar finns också i däggdjursceller, inklusive clathrin oberoende och fagocytiska vägar som är beroende av Rho1 ortolog, RhoA 9,19. Rollen av RhoA i däggdjur CIE är dåligt känd, således kan studier i knoppande jäst ytterligare mekanistiska insikter som är tillämpliga på däggdjurs CIE.
Exakt kvantifiering av endocytiska händelser kan ge viktig information om de roller specifika proteiner i regleringen endocytos, och kan avslöja effekterna av mutationer på lastinternalisering eller övergång frånn genom den endocytiska reaktionsvägen. För detta ändamål, kan biokemiska metoder användas för att övervaka ligand upptag eller för att mäta hastigheter av nedbrytning av endocytiska cargo-proteiner. I levande celler, fusion av grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter till laster av intresse medger direkt visualisering av godstransport. Men GFP-märkta last är av begränsad användning för kvantifiering av endocytos eftersom GFP är resistent mot nedbrytning i lysosomen (eller vakuolen i jäst). Dessutom är GFP fluorescens endast delvis känsliga för förändringar i pH, och fortfarande går att urskilja i vakuolen lumen 20,21. Följaktligen fluorescens av GFP taggen kvar i vakuolen långt efter resten av lasten har försämrats, och hela cellbaserade kvantifiering av last intensitet kan vara felaktiga på grund av långsiktiga GFP fluorescens i vakuolen.
I syfte att övervinna nackdelarna med vakuolär GFP-fluorescens, vi tidigare använt sig av superecliptic pHluorin, en pH-känslig variant av GFP som fluorescerar starkt vid neutralt pH, men förlorar fluorescens i sura miljöer, såsom lumen i vakuolen / lysosomen 20,22,23. Placera en pHluorin tagg på den cytoplasmatiska svansen av endocytiska last medger visualisering av laster på plasmamembranet och på tidiga endosomer, där pHluorin taggen förblir exponerade till cytoplasman (Figur 1A). Så tidigt endosomer mogna, det endosomala sorterings komplexa krävs för transport (ESCRT) maskineripaket yt-lokaliserad last in i vesiklar som knoppas in i lumen av endosomen, generering multivesikulära kroppar (MVBs) 24. För last som har införlivats i den interna MVB vesikler, vetter mot pHluorin tag mot vesikler lumen. Interna MVB vesiklar surgörs; därmed pHluorin-märkta last förlorar fluorescens på tidiga endosomer som de mognar i MVBs 20. Efterföljande fusion av MVB med vakuolen levererar MVB luminala innehålletför nedbrytning förblir och pHluorin taggar släcktes i den sura miljön i vakuolen lumen.
Detta dokument innehåller detaljerade beskrivningar av kvantitativa endocytiska analyser med hjälp av laster med cytoplasmiska pHluorin taggar i jäst. Stammar som uttrycker pHluorin-märkta last kan användas i kinetiska och / eller endpoint analyser, beroende på egenskaper och handel beteende specifika last. Dessutom är vissa pHluorin-märkta last är mottagliga för hög genomströmning analysmetoder, inklusive flödescytometri. Viktigare är pHluorin taggen ett mångsidigt verktyg för att studera endocytiska händelser i levande celler, vilket möjliggör kvantifiering av endocytos och jämförelse av endocytiska funktion i vildtyps- och mutantstammar.
Tillämpningar av pHluorin för kvantifiering av endocytiska händelser i jästceller använder sig av transmembranlaster i vilka den fluorescerande taggen är fuserade till den cytoplasmatiska svansen av proteinet (Figur 1A). För de analyser som beskrivs här, last är ljust fluorescerande när pHluorin tag utsätts för neutrala miljöer, men blir släcktes när pHluorin taggen möter sura betingelser. Således är en pHluorin-taggat endocytiska last lätt detekteras vid den cytoplasmiska ytan av pla…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |