Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Yeşil floresan proteini (GFP) ve türevleri yaygın protein lokalizasyonu ve hücre iskeleti yeniden ve canlı hücrelerin veziküler kaçakçılığı gibi olaylar dinamiklerini incelemek için kullanılan araçlardır. Kimerik GFP füzyonu kullanılarak niceliksel yöntemler birçok uygulama için geliştirilmiştir; Ancak, GFP, proteoliz biraz dayanıklıdır böylece floresan endositik yolunda kargo ticareti ölçümü engelleyebilir lizozom / vakuol, devam etmektedir. endositoz sonrası endositik trafik olayları ölçülmesi için alternatif bir yöntem, superecliptic pHluorin, asidik ortamlarda söndürülür GFP bir pH-duyarlı bir varyantın kullanır. multiveziküler organları (MVBs) ve lizozom / vakuol lümene sunumuna kargo dahil edildikten sonra floresan nemlendirme transmembran Yük proteinleri sonuçlar sitoplazmik kuyruk pHluorin kimerik füzyon. Bu nedenle, vakuolar floresans söndürme quantifi kolaylaştırırendositoz ve endositik yolunda erken olayların katyon. Bu çalışma, floresan mikroskobu ile endositoz miktarının pHluorin etiketli yükleri yöntemler kullanılarak, hem de akış sitometrisi kullanılarak popülasyon bazlı tahliller açıklanmaktadır.
Veziküler trafik ökaryotik hücrelerde organel kimliği ve işlevini muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynar ve tek tek hücre bölümlerinde protein ve zar bileşimi düzenlemek için önemli bir mekanizmadır. endositoz yoluyla üretilen keseler daha sonra geri dönüşüm veya lizozoma hedefleme için yüzeyinden zar ve proteinleri uzaklaştırmak ise plazma membranında, ekzositik veziküllerin füzyon, hücrenin yüzeyine yeni proteinler ve membranlar sağlar. Bu nedenle, endositoz besin alımı ve hücre dışı ortama yanıtları için önemlidir. Ekzositoz ve endositoz plazma zarı yüzey alanı düzenleyen ve hasarlı proteinlerin ciro izin dengelenir.
maya ve memeli hücrelerinde yapılan çalışmalar en çeşitli yanıt olarak bir endositoz katılan proteinlerin büyük sayıda, hem de belirli bir yükün içselleşmesini çerçevesinde çok endositik yollar ya da hareket belirledikvironmental koşullar. en iyi çalışılmış yol klatrin ve sitosolik yardımcı proteinleri oluşmakta endositik vezikül stabilize etmek için bir kaplama yapısına monte edildiği klatrin aracılı endositoz (STE) vardır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae yapılan deneyler dinamikleri ve birçok endositik proteinler 1-3 için işe alım düzenine temel anlayışlar vermiştir. Özellikle, CME makine yüksek evrim boyunca muhafaza edilir maya STE ile ilişkili proteinlerin çoğunluğu, insan ortologlarını olduğu; böylece, maya tomurcuklanan yüksek ökaryotlarda korunmuş olan endositoz mekanizmalarını anlamak için önemli bir araç olmuştur. Örneğin, tomurcuklanan maya kullanılarak çalışmalar ek endositik aksesuar işe ardından CME yapılarının bu oluşumunu ve olgunlaşmasını (maya olarak kortikal aktin yamalar anılacaktır) Klatrin ve kargo bağlayıcı adaptör proteinleri ile başlayan, pek çok protein sıralı akınıdır tespit proteinler,ARP2 / 3-aracılı aktin polimerizasyonu aktivasyonu ve vezikül kesme 1,2 katılan proteinlerin işe. aktin yamaları kortikal için CME makine proteinlerinin İşe çok sipariş edilen ve basmakalıp bir süreçtir ve birçok protein için işe kesin sipariş CME makine diğer bileşenleri ile ilgili olarak kurulmuştur. Daha da önemlisi, son çalışmalar memeli hücrelerinde 4 Klatrin kaplı çukurlar CME proteinler için işe benzer bir düzen doğruladı.
CME ek olarak, çok sayıda hücre tipleri, plazma zarının 5-7 vezikül oluşumu ve içselleşmesini teşvik etmek için alternatif mekanizmalar kullanan bir veya daha fazla klatrin bağımsız endositik (CIE) yollarına sahiptirler. Maya, biz son zamanlarda küçük GTPaz Rho1 ve aktive guanin nükleotid değişim faktörü (GEF), ROM1 8,9 kullanan bir CIE yolu belirledi. Rho1 aktin polimerizasyonu 1 teşvik formin Bni1 aktiveMaya 12 klatrin bağımsız endositoz bu formu için gerekli olan 0,11. Ayrıca, proteinlerin α-arrestin ailesi ubikitin ligaz Rsp5 CME 13-17 yoluyla kargo yayılmasını ve daha sonra içselleşmesini teşvik etmek ve aynı zamanda CIE 18 yer alan proteinlerle muhtemelen doğrudan etkileşim yoluyla, CIE yolu ile kargo içselleştirme teşvik işe. CIE yollarının çeşitli da Rho1 ortologunun, RhoA 9,19 kullanan klatrin bağımsız ve fagositik yollar dahil, memeli hücrelerinde mevcuttur. Memeli CIE RhoA rolü tam olarak anlaşılamamıştır; böylece, tomurcuklanan maya çalışmalar memeli CIE için geçerli olan ek mekanistik bakış açıları sağlayabilir.
endositik olayların doğru ölçümü endositoz düzenleyen spesifik proteinlerin rolleri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir ve kargo içselleştirme veya progressio mutasyonların etkilerini ortaya çıkarabilirendositik yolu ile n. Bu amaç için, biyokimyasal yöntemler ligand alımını izlemek ve endositik kargo proteinlerin degradasyon oranları ölçmek için kullanılabilir. canlı hücrelerinde, yeşil floresan proteininin (GFP) ve ilgi kargolara türevleri füzyon kargo taşımacılığı doğrudan görselleştirme izin verir. GFP (maya veya vakuol) lizozom bozulmaya dirençli olduğu Ancak, GFP etiketli yükler endositoz miktarının sınırlı kullanıma sahiptir. Ayrıca, GFP flöresanmm, pH değişiklikleri kısmen duyarlıdır ve 20,21 lümen vakuol içerisinde tespit olmaya devam etmektedir. Sonuç olarak, GFP etiketi floresan kargo kalan bozulmuş olup, kargo yoğunluğuna tüm hücre tabanlı miktar nedeniyle vakuol uzun vadeli GFP floresan yanlış olabilir süre sonra vakuol devam etmektedir.
vakuolar GFP floresans sakıncaların üstesinden gelmek için, daha önce superecliptic pH kullandıluorin, nötr pH'ta parlak bir floresant, ancak bu 20,22,23 Lizozom vakuol / lümeni gibi asidik ortamlarda flüoresans kaybeder GFP bir pH-duyarlı varyantı. Endositik kargolar sitoplazmik kuyruk bir pHluorin etiketi yerleştirme plazma membranında ve pHluorin etiket sitoplazmaya (Şekil 1A) maruz kalır erken endozomlardan üzerinde kargoların görselleştirme izin verir. Erken endozomlar, endozomun lümenine tomurcuk veziküller içine taşıma (ESCRT) makine paketleri yüzey lokalize kargolar için gerekli endozomal ayırma kompleksleri, üreten multiveziküler cisim (MVBs) 24 olgun olarak. İç MVB veziküller içine dahil edilmiştir kargolar için, pHluorin etiket vezikül lümenine doğru dönüktür. İç MVB veziküller asitlendirilirler; Onlar MVBs 20 içine olgun olarak böylece pHluorin-etiketli kargolar erken endozomlardan üzerinde floresan kaybedersiniz. vakuol ile MVB daha sonraki füzyon MVB lümen içeriğini teslimindirgenmesi için ve pHluorin etiketler vakuol lümeninin asidik ortamda söndürüldü kalır.
Bu yazıda maya sitoplazmik pHluorin etiketleri ile kargoları kullanarak kantitatif endositik testlerin ayrıntılı açıklamalar sağlar. pHluorin etiketli yükleri sentezleyen cinsler, belirli yük özellikleri ve trafik davranışa bağlı olarak, kinetik ve / veya son nokta deneylerinde kullanılabilir. Buna ek olarak, bazı pHluorin-etiketli yüklerin akış sitometrisi içeren yüksek verimli analiz yöntemleri, elverişlidir. Önemli olarak, pHluorin etiketi, canlı hücrelerde endositik olayları incelemek endositoz ve vahşi tip ve mutant suşları endositik fonksiyonunun karşılaştırılması sayılmasına olanak tanıyan bir çok yönlü bir araçtır.
Maya hücrelerinde endositik olaylar miktarının pHluorin uygulamaları floresan etiketi proteini (Şekil 1A) sitoplazmik kuyruğuna kaynaşık olduğu transmembran yüklerinin kullanır. pHluorin etiketi nötr ortamlara maruz kalan, ama pHluorin etiketi asidik koşullar karşılaştığında söndürülür haline olduğunda burada tarif edilen deneyler için, kargolar parlak floresan vardır. Böylece, pHluorin-etiketli endositik kargo kolayca plazma zarının sitoplazmik yüzüne ve erken endozomlard…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |