Protocol
1.足場製作
- 20分間実験室ブレンダー中のNaClを粉砕し、100℃のヒーターでそれを乾燥させます。
- 共振で発生することなく、利用可能な最高周波数で30分間ふるい機で乾燥させたNaClを（一度に45グラム）を入れてください。 500ミクロン〜1000ミクロン（M 500）に至るまで、6塩画分を収集します。 300ミクロンから500ミクロン（M 300）へ。 100μmから200μmの（M 100）。 90ミクロンから100（M 90）へ。 図1に図式のような塩の粒子と45ミクロン〜65ミクロン（M 45）から、最終的にM 10は、45ミクロンよりも小さいサイズ。
- 真空は、処理中に加水分解切断を回避するために、一晩、すべての材料を乾燥させます。ガラス転移 - ポリマーの場合に - 各材料については、克服することなく、乾燥の程度を最大化するために温度を選択します。したがって、PEGのためのPLAのためのT = 90℃、T = 25°C、T = NaClを105℃を選択します。
- フィード通常、約後、次にそれぞれ20/5/75の重量パーセント組成を有するPLA、PEGおよびNaCl、T = 190°Cで動作するバッチミキサーおよびN = 60回転数とトルクの一定値を達成するまで、それらを処理し、 10分。その後、急速に得られた材料を集めます。
- 10ミリメートルの直径と3ミリメートルの高さと適切な円筒状の金型でブレンドを入れて、周囲圧力で60秒、3分の180バーでのためにそれらを保つため、210℃で動作する実験用プレスを用いて、単層を準備します。その後、180バールの圧力を維持し、室温でブレンドを冷却します。
- 圧縮成形を介した三層の組立
- 10mmの直径および1mmの高さを有する同一（1.5）に記載されているような方法が異なる金型を用いて、すなわち、各単層を調製します。最後に、6つのディスクは、6つの異なる粒子サイズを含む、10mmの直径および1mmの高さを有し得る：M 500、M 300、M 100、
- フォーR 3層足場A（TLS A）を組み立て、M 500、M 300を積み上げるとM 100、円筒状金型内および周囲圧力で60秒間、210℃で動作する実験用プレスでそれらを圧縮成形し、3分でその後、180バーとは、180バールの圧力を維持し、室温で冷却しました。
注：相互M 90上に積層してTSL Bを準備M 45とM 10と同じ金型及びTLS Aに用いたのと同じ手順に従って、圧縮成形作業を行います
- 円筒型からディスクを削除し、攪拌せずに、沸騰脱塩水浴に入れます。 3時間後、浴から得られた多孔質構造体を除去し、化学フード中、室温で12時間のためにそれらが乾燥してみましょう。
2.形態素解析
- 走査型電子顕微鏡により、足場の形態を評価します。
- 取り付け後、液体窒素下で試料を分解し、接着剤カーボンテープを使用したアルミニウムスタブ上のサンプル。最後に、スパッタcoateを金で撮影前にアルゴン雰囲気下で90秒間の試験中に静電放電を回避するために。
3.足場孔径
- 足場の孔径分布を認識することができる画像処理ソフトウェアを用いてSEM分析によって得られた画像を精巧。
注：この研究では、細孔径分布分析は、MATLABベースのソフトウェアを用いて行った以前33に記載
4.気孔率
- 浸出の前にサンプルを秤量し、次式により理論的な多孔性を評価します：
注：NaClを 、 メートルPEGおよびm PLAを M、均質なブレンドを仮定することにより、それぞれのNaCl、PEG、およびPLAの理論上の質量です。 T彼は（ρ）のNaCl、PEG及びPLAのは、それぞれ2,16グラム/ cm 3であり、1,12グラム/ cm 3の電子1,24グラム/ cm 3である密度。 - 試料（ρ 骨格 ）の見掛け密度を評価するために浸出し、乾燥後の試料を秤量し、次に足場の見掛け密度との比とすることにより、非多孔質PLAの濃度の逆数として実際の多孔性を評価します式（2）を使用。
注：これは、足場の空のボリュームと（空+フル）足場のフルボリュームとの間の比率を表しています。
5.機械的性質
- 1 kNのロードセルを装備した引張機を使用して、圧縮モードでサンプルをテストします。分-1 1mmの一定の歪み速度を設定します。
- 生理学的環境におけるサンプルの機械的性能を調べるために、dynamometeを装備37℃で含有する浴（PBS）、（でpH = 7.4）とrと点5.1で説明したものと同じ設定でテストを行います。
- 湿潤環境内の各測定の前に、PBSは、全ての孔を埋めるようにするために5分間の真空フラスコ中で、PBSでサンプルを浸します。その後、足場は設定点温度に到達するために15分間37℃でPBS中に残存することを可能にします。
- 文献32,34に記載の方法以下の機械的試験機に接続されたカスタムデザインの界面強度試験装置を用いてTL AとTL Bの層の間の界面接着強度（IAS）を決定します。
- リグ上の足場を修正して、マシンのロードセルとベースプラテンとの正確な位置合わせを確保します。高粘度の接着剤を用いてアルミニウム試験スタブに足場サンプルを取り付け、テストのための機器に入れます。
- 湿潤状態の試験では、1時間のpri PBS中のサンプルを水和または試験へ。分-1 1mmのひずみ速度で適用される引張荷重の下で、1 kNのロードセルを使用してください。
注：障害がいずれかの層の一つの極限引張強さでため、または界面での剥離の発生する可能性があることを考慮してください。応力 - ひずみ曲線の最大強度としてIASを評価します。
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Representative Results
足場の孔のアーキテクチャ上のNaCl粒子サイズの影響は、それぞれ、試料の形態を調査し、画像解析により細孔サイズ分布を計算することによって定性的および定量的に評価した図2a - 。fは 、得られた単層足場のSEM顕微鏡写真を示します別のNaCl粒子サイズを含む材料の塩浸出から。
より詳細には、M 500（ 図2a）は、おそらく溶融混合中に500ミクロンよりも大きい直径を有する塩粒子の破壊に、500μmの平均直径を有する細孔を示しました。同図から明らかなように見える、細孔構造は、約10μmの壁に囲まれ乏しい相互接続された不規則な気孔、、の数が少ないことを特徴としている。 図2bは、このでM 300の形態を報告しますケースは、細孔は、このように何も粒子破壊が溶融混合プロセス内で発生していないことを確認し、溶融混合（300~500ミクロン）の間に充填された塩粒子の同じ範囲内の平均粒径を示すことが見出されました。細孔壁はM 500層において観察されるものよりも薄い（約5μm）であることが見出されました。 M 100は、（ 図2c）、小さいものに囲まれた大きな細孔（100-200ミクロン）により構成される異種ネットワークによって特徴づけられる二峰性多孔質構造を示しています。この細孔構造は、壁の厚さの大幅な間伐を決定するが、ボリューム単位のためのより良い相互接続性と増加した孔密度を提供します。 図2dに設けられたM 90の形態は、均一に起因し、この場合に使用されるより小さな塩サイズ範囲（90〜100ミクロン）に、ポリマーマトリックス全体に分布略立方体孔を示しています。 PEGの溶媒和に起因する微細孔は、実際には、非常に粗く表示され、壁の内側にマイクロトンネルとして存在していました。 SE図2eに示すM 45のM顕微鏡写真は、直径が45ミクロンから65ミクロンの範囲の細孔の高密度を表示します。 M 10（ 図2fが ）高い相互接続性の程度と非常に薄い（<1μm）の壁と、単位体積あたりの細孔の最高密度、20ミクロンにほぼ等しい平均細孔サイズを表示しました。
図3a、A '、 "異なる倍率で、浸出工程の後、TLS Aの断面を表示する。ながら、 図3aにおいては、明らかに三つの層、異なる平均孔径によって特徴付けられるそれぞれを識別することが可能ですパネルa 'と」は、それぞれ、M 100-M 300およびM 300-M 500界面領域を参照してください。はっきりと見えるように、装置全体は、異なる層の間の任意の内部の切断や行列の不連続性を提示しません。同様に、TLS Bおよび関連インタフェースは、 図3b、B 'に報告されています、B」の画像がM 10-M 45（パネルb '）とM 45-Mの両方に対し、実際には、異なるサイズの孔を有する三層が容易に（パネルB）を認識することができるTLS A.と同様の形態を明らかにしました90（パネルb」）の界面領域は全く剥離や不連続性を示しませんでした。予想されたように、各単層は、アセンブリと浸出のステップ後の同じ細孔構造を保持しています。
表1は、（乾燥）空気中とPBS（湿った）環境で測定された材料の圧縮弾性率を、報告します。このプロパティは、平均細孔サイズを有する単調増加に追従することが見出されました。最終的なデバイスの弾性率は、主にTLSs両方について調査（TLS B用すなわち TLS AのためのM 100およびM 10）には、それぞれの弱い層によって決定されます。TLS AおよびTLS B 表2レポートのIASをドライとウェットの環境で。いいえ、層間剥離現象が失敗するので、観察されませんでした常にTLS A（M 100）およびTLS B（M 10）の最も弱い層の途中で発生しました。 TLS Aは最高のIASのパフォーマンスを示しました。
図1：NaCl の粒度の回路図ふるいにかけられたNaCl粒子と対応するサンプル・コードの粒度。
図2： モルフォロジー単層足場の異なる細孔サイズ分布によって特徴付けられる単層足場のSEM顕微鏡写真：M 500（a）は 、スケールバー=400μmの。 M 300（b）は 、スケールバー=400μmの。 M 100（c）は 、スケールバー=400μmの。 M 90（d）に 、スケールバー=200μmの。 M 45（E）= 400スケールバー81; mおよびM 10（f）は 、スケールバー=100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。 図3： 三層足場の形態 （A '、A' '）三層足場タイプA（TLS A）のSEM顕微鏡写真（a）は全体の断面図、スケールバー= 500ミクロン。 （A '）M 100-M 300インターフェース、スケールバー=250μmです。 （A ''）M 300-M 500インターフェース、スケールバー=250μmです。 （B、B '、B' '）は、3層スキャフォールドタイプB（TLSのB）のSEM顕微鏡写真、（b）は断面全体、スケールバーは500μm。 （B '）M 10-M 45インターフェース、スケールバー; =100μmの。 （B ''）M 45-M 90インターフェース、スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| サンプルコード | ドライ- E（MPa）と | ウェット- E（MPa）と |
| M 500 | 40.33±6.04 | 33.23±4.96 |
| M 300 | 37.62±6.89 | 31.42±5.83 |
| M 100 | 32.12±5.11 | 28.03±4.04 |
| M 90 | 30.87±4.93 | 26.91±3.79 |
| M 45 | 25.36±5.82 | 22.83±5.01 |
| M 10 | 21 0.76±3.91 | 19.87±3.93 |
| TL A | 33.08±5.21 | 29.55±4.09 |
| TL B | 22.31±5.46 | 20.54±3.87 |
表1：圧縮機械結果モノとウェットとドライの環境で異なる孔径を備えた3層足場の圧縮ヤング率。値は平均値±SDとして与えられます。
| サンプルコード | ドライ- IAS（キロパスカル） | ウェット- IAS（キロパスカル） |
| TL A | 350.8±51.2 | 299.6±35.1 |
| TL B | 262.3±62.2 | 220.5±31.3 |
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Discussion
最初の重要なステップは、効率を篩い分けの最適化です。 NaClの粒径の高い制御は、所望の細孔サイズ分布を有する足場を調製するための基本です。もう一つの重要なステップは、金型からサンプル抽出の際に薄いPLA単層の破壊を回避されています。画像処理解析は、装置全体の代表ではないかもしれません。
引張試験中、サンプルは機器から離れて引き裂くことができます。
ステップをふるい分けする前に、塩をよくのNaCl粒子サイズのより高い制御を得るために乾燥されていることを確かめます。この問題は、その非常に高い吸湿性に起因し、特に最小の塩の粒子サイズのために重要です。圧縮成形工程の前に、金型からのサンプルの除去を容易にするために、金型の上に薄いテフロンスプレーコーティングを施します。画像処理解析を採取異なる画像を考慮して行わなければなりません足場の異なる領域から、彼らは装置全体の代表的なものであることを確認します。最後に、引張試験（湿潤環境で行わ特に）の前に、慎重に密着をサンプリングする接着剤を検証します。
技術の主要な制限は、細孔サイズの連続的な勾配を得ることが不可能です。実際、この方法は、本明細書中、それが別の層の組み立てに基づいているため、孔径の個別の勾配を達成することを可能にします。ほとんどの場合、明確に定義された多層足場は、連続的に1ではないが、これまで段階的に好ましいことがあります。この制限は、部分的に処理するのがより困難明らかに、交互に薄い層をもたらすであろう、層数を増やすことによって超えてもよいです。
それは潜在的に危険な任意の毒性溶媒を必要としないので異なって、他の多くの生産技術から、ここで採用戦略は、環境に優しいと考えることができます環境のための生細胞や組織のために。また、粒子状の浸出は、それぞれのサイズとPLAとブレンドのNaClの量を調整することにより細孔径と気孔率の両方の高い制御を提供します。
この技術の将来の進歩は、他の化学 - 物理的な違いを提示層を収集する可能性に依存しています。例えば、1は、異なる生体高分子を組み立てることができるか、そのようなハイドロキシアパタイト28、nanocellulose 27、グラフェン35またはその誘導体であっても、さらに機能38を提供するために、9,36,37など、さまざまなナノ粒子、とそれぞれの層を強化します。実際には、この方法は、このように簡単に調整する多層足場の各領域をすることを可能にする高い制御を保証します。徐々に別の組織から変更する多相および/または異方性バイオ構造の存在は、そのような靱帯ツーbとのインタフェース組織の典型的な特徴であるので、この挑戦は、ITEに重要な役割を果たしています1、腱、骨へと軟骨の骨。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(lactic acid) | NatureWorks | PLA 2002D | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma | 83797-1KG-F | |
| Sodium Cloride | Sigma | 793566-5KG-D | |
| Phosfate Buffer Solution | Sigma | P5368-10PAK | |
| Laboratory Mixer | Brabender | PLE 330 - Plasticorder | |
| Laboratory Press | Carver | ||
| Scanning Electron Microscopy | Phenom-world | ProX | |
| Universal Testing Machine | Instron | 3365 (UK) | |
| BioPuls Bath | Instron, Norwood | ||
| Sieving Machine | Endecotts | E.V.F.1. | |
| Vacuum Oven | ISCO | NSV9035 | |
| Precision Balance | Sartorius | AX224 |
References
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