Protocol
1.脚手架制造
- 磨的NaCl在实验室混合器20分钟，并使其干燥在100℃的加热器。
- 把干燥的NaCl（在时间45克）的筛分机30分钟，在可用的最高频率而不在共振发生。采集6盐组分，从500微米到1000微米（M 500）;从300微米至500微米（M 300）;从100到200微米（M 100）;从90微米至100（M 90）;从盐颗粒45微米至65微米（M 45）和最后M 10的大小小于45微米， 如图1图式。
- 真空干燥一夜所有材料，以避免处理过程中发生水解断裂。在聚合物的情况下 - - 玻璃化转变每种材料中，为了最大限度地发挥干燥程度不克服选择温度。因此，选择T = 90℃，PLA和T = 25℃，PEG，T = 105℃的NaCl。
- 饲料PLA，PEG和氯化钠，分别为20/5/75重量百分比的组合物，以在T = 190℃的间歇混合机的操作和n = 60转，然后对经过处理它们，直到实现转矩的恒定值，通常10分钟。此后，迅速地收集得到的物质。
- 通过使用实验室压机在210℃下操作制备的单层，放在适当的圆柱形模子的共混物用直径为10毫米，3毫米的高度并保持在环境压力60秒，并在180巴3分钟。此后，冷却该混合物在室温下，保持180巴的压力。
- 通过压缩成型的三层组件
- 在相同的方式，在（1.5）中所述，但使用不同的模具，即具有直径为10毫米和1毫米的高度准备每个单层。最后，得到具有直径为10毫米，1毫米的高度6磁盘，包含六个不同的颗粒尺寸：M 500，M 300，M 100，
- 佛ř组装三层支架A（TLS A）堆放m个500，M 300和M 100中的圆筒形模具的内部并在实验室压机压缩模铸它们在210℃在环境压力为60秒和3分钟以上180条，然后在室温冷却，保持180巴的压力。
注：通过按照相同的程序作为用于TLS A.通过堆叠在每个其它M 90中，M 45和M 10在相同的模具中并进行压缩 - 模制操作准备TSL乙
- 从圆柱形模具中取出光盘，并把它们在沸腾软化水洗澡，不搅拌。 3小时后，从浴中取出所得的多孔结构，并让他们干，在室温下在化学罩12小时。
2，形态分析
- 通过扫描电子显微镜评价的支架的形态。
- 打破样品液氮中，然后装上在铝存根样品使用粘合碳胶带。最后，溅射coate金用于成像之前氩气气氛下90秒，以避免在试验过程中的静电放电。
3.脚手架孔径
- 阐述通过SEM分析用图像处理软件能够识别该支架的孔尺寸分布获得的图像。
注意：在本工作的细孔径分布进行了分析使用基于MATLAB软件先前所述33
4.孔隙度
- 浸出之前称重所述样品和评价根据以下表达式的理论孔隙率：
注：M 氯化钠 ， 男PEG和m PLA，分别是氯化钠，PEG和PLA的理论质量，假定均匀的共混物。 ŧ他密度的NaCl，PEG和PLA的（ρ）分别为2.16克/厘米3，1.12克/厘米3ë1.24克/厘米3。 - 称量样品淋洗并以评估样品（ρ 支架 ）的表观密度干燥后，然后评估实孔隙率支架的表观密度以及由非多孔聚乳酸的密度之间的比率的倒数使用表达式（2）。
注：表达了支架的空体积和全部体积的支架（空+满）之间的比率。
5.机械性能
- 测试使用拉伸机，搭载了1千牛顿负荷细胞下的压缩模式的样品。设置为1毫米分钟-1的恒定应变速率。
- 为了研究在生理环境中的样品的机械性能，装备dynamometeR，其中，在37℃含有浴（PBS）（pH值= 7.4）中，用相同的设置，在点5.1中所述进行测试。
- 在潮湿环境中的每个测量之前，浸泡在用PBS样品在真空烧瓶5分钟，以让PBS填充所有的孔。此后，允许支架在37℃下留在PBS 15分钟以到达设定点温度。
- 通过使用自定义设计的界面强度测试设备，连接到力学试验机按照文献32,34描述的方法确定TL A和TL B的层之间的界面粘结强度（IAS）。
- 固定在钻机的支架，并确保其与机器的称重传感器和基地台板正确对准。通过使用高粘度的胶粘剂连接支架样品铝测试存根，并将它们放到设备进行测试。
- 对于潮湿条件下的测试，滋润在PBS样品1小时PRI或测试。使用1千牛顿载荷传感器，以1mm分钟-1的应变速率施加的拉伸负荷下。
注意：考虑到可能发生故障或者在层中的一个的极限拉伸强度，或因为在界面剥离的。评价在IAS为应力 - 应变曲线的最大强度。
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Representative Results
NaCl粒子大小对支架的孔结构的影响被调查样品的形貌和分别计算由图像分析孔径分布，定性和定量评估图2a - F示出了所得的单层支架的SEM显微照片从含有不同氯化钠颗粒尺寸材料盐析。
更详细地，男500（ 图2a）显示孔为500微米的平均直径，这可能是由于盐的颗粒直径在熔融混合期间高于500微米的破损。如从相同的图中清晰可见，孔结构的特征在于一个低数不规则细孔，互联不佳，由约10μm壁包围的。 图2b报告中号300的形态在本情况下，被发现的孔为相同的范围熔融混合（300-500微米）期间填充盐颗粒内表现出的平均直径，从而证实熔体混合过程中没有发生任何颗粒破碎。孔壁被认为是较薄（约5μm）比以M 500层观察。 M 100，（ 图2c），显示了一个双峰多孔结构，其特征在于通过用较小的包围大孔隙（100-200微米）组成的异构网络。这个孔结构提供了更好的互连性和单位体积的增大的孔密度，尽管确定壁的厚度的急剧变薄。米90的形态，在图2d设置，示出了大致立方孔，在整个聚合物基质均匀地分布，由于在这种情况下使用较小的盐大小范围（90-100微米）。微孔，由于PEG溶剂化人出席如，实际上，出现非常粗糙的壁内的微通道。 SE米45的M个显微镜照片，在图2e中所示，显示细孔，其直径范围从45微米至65微米的高密度。 M 10（ 图2F）显示每单位体积，平均孔径约等于20微米的孔的密度最高，具有高度互连的和非常薄的（<1微米）的壁。
图3a，A'，A“显示的TLS A的横截面，该浸提过程后，在不同的放大倍数。在图3a，可以清楚地识别三个层，每一个特征是不同的平均孔尺寸，而面板a'和一个“是指M 100-M 300和M 300-M 500接口区域，分别。作为清晰可见，整个装置不会带来任何内部分裂也不不同层之间矩阵不连续性。类似地，TLS B和相关接口示于图3b中，B'，B“。该图像显示类似的TLS A.事实上的形态，三层具有不同尺寸的孔可以容易地识别（图b），而两个M 10-M 45（图b'）和M 45-M的90（图b“）的界面区域没有表现出剥离也不连续。正如预期的那样，每一个单层保持组装后和浸出步骤相同的孔结构。
表1报道的材料的压缩弹性模量，在空气中（干燥）并在PBS（湿）环境中测量。该属性被发现遵循与平均孔径的单调增加。最终设备的弹性模量主要是由各自的弱层在干燥和潮湿的环境所决定的（ 即 M 100为TLS A和M 10的TLS B）同时为TLSS调查。为TLS A和TLS乙表2份报告IAS 。没有观察到层间剥离现象，由于发生故障总是发生在TLS A（M 100）和TLS B（M 10）的最薄弱的层的中间。 TLS显示的最佳性能的IAS。
图 1：筛分氯化钠颗粒和相应的样本代码的氯化钠粒度的示意图颗粒度。
图2： 形态单层支架的单层支架特征在于不同孔径分布的SEM显微照片：M 500（a）中 ，比例尺= 400微米; M 300（b）中 ，比例尺= 400微米; M 100（c）中 ，比例尺= 400微米;米90（d）中 ，比例尺= 200微米;米45（E），比例尺= 40081; M和M 10（F），比例尺= 100微米请点击此处查看该图的放大版本。
。 图 3： 三层支架形态 （A，A'，A''）的三层支架A型（TLS A）的SEM显微照片：（ 一 ）的整个横截面，比例尺= 500微米; （a'）的 M 100-M 300接口，比例尺= 250微米; （A''）M 300-M 500接口，比例尺= 250微米。 （B，B'，B'）的三层支架B型（TLS B）的SEM显微照片：（B）的整个横截面，比例尺为500μm; （B'）M 10-M 45接口，比例尺; = 100微米; （B'）M 45-M 90接口，比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 示例代码 | 干- E（MPA） | 湿- E（MPA） |
| 中号500 | 40.33±6.04 | 33.23±4.96 |
| M 300 | 37.62±6.89 | 31.42±5.83 |
| M 100 | 32.12±5.11 | 28.03±4.04 |
| 米90 | 30.87±4.93 | 26.91±3.79 |
| 米45 | 25.36±5.82 | 22.83±5.01 |
| M 10 | 21 0.76±3.91 | 19.87±3.93 |
| TL A | 33.08±5.21 | 29.55±4.09 |
| TL乙 | 22.31±5.46 | 20.54±3.87 |
表1：压缩机械结果单和用在潮湿和干燥环境中不同孔径三层支架的压缩杨氏模量。数值以平均值±SD。
| 示例代码 | 干- IAS（千帕） | 湿- IAS（千帕） |
| TL A | 350.8±51.2 | 299.6±35.1 |
| TL乙 | 262.3±62.2 | 220.5±31.3 |
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Discussion
第一个关键步骤是筛分效率的最优化。 NaCl的粒径的高控制为具有期望的孔径分布制备支架的基础。另一个关键步骤是避免从模具样品提取期间薄PLA单层的断裂。图像处理分析可能不能代表整个装置。
期间拉伸试验中，样品可撕远离设备。
向筛分步骤之前，确定该盐已在为了得到NaCl粒子大小的一个更高的控制得到了很好的干燥。这个问题很重要，特别是对于最小盐粒径，由于其极高的吸湿性。之前压缩成型工序中，为了便于从模具中样本去除施加薄聚四氟乙烯喷涂到模具。图像处理分析必须考虑采取不同的图像来进行从支架的不同区域，以确保它们代表了整个设备。最后，前拉伸试验（特别是那些在潮湿的环境下进行的），认真核实粘合剂样品的粘合性。
该技术的主要限制在于不能得到所孔径的连续梯度。事实上，该方法在此描述允许实现孔径的离散梯度，因为它是基于在不同层上的装配。在大多数情况下，一个定义良好的多层支架可以优选一个连续分级之一，但不是永远。这种限制可以通过增加层的数目，这反过来会导致更薄的层，显然更难处理被部分地超过。
不同于许多其它的生产技术，这里采取的策略可以考虑生态友好的，因为它不要求任何有毒溶剂有潜在危险对环境和对活细胞和组织。此外，颗粒沥滤提供高的控制通过调整两个孔径和孔隙率的分别的尺寸和氯化钠的量共混的聚乳酸。
这种技术的未来进步，靠的可能性收集层提出其他化学物理差异。例如，可以组合不同的生物聚合物或具有不同的纳米颗粒，如羟基磷灰石28，纳米纤维素27，石墨烯35或其衍生物9,36,37，以便提供进一步的功能38相辅相成层。事实上，这种方法确保了高的控制从而允许容易地调节多层支架的每个区域。这一挑战玩在ITE至关重要的作用，因为多相和/或各向异性的生物结构的存在逐渐改变从一个组织到另一个是接口组织的典型特征，例如韧带至B之一，腱 - 骨和软骨到骨。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(lactic acid) | NatureWorks | PLA 2002D | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma | 83797-1KG-F | |
| Sodium Cloride | Sigma | 793566-5KG-D | |
| Phosfate Buffer Solution | Sigma | P5368-10PAK | |
| Laboratory Mixer | Brabender | PLE 330 - Plasticorder | |
| Laboratory Press | Carver | ||
| Scanning Electron Microscopy | Phenom-world | ProX | |
| Universal Testing Machine | Instron | 3365 (UK) | |
| BioPuls Bath | Instron, Norwood | ||
| Sieving Machine | Endecotts | E.V.F.1. | |
| Vacuum Oven | ISCO | NSV9035 | |
| Precision Balance | Sartorius | AX224 |
References
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