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Bioengineering

एक सतही और पारिस्थितिकी के अनुकूल रूट के निर्माण के लिए साथ वर्गीकृत ताकना आकार पाली (लैक्टिक एसिड) Scaffolds

Published: October 17, 2016 doi: 10.3791/54595

Protocol

1. पाड़ निर्माण

  1. 20 मिनट के लिए एक प्रयोगशाला ब्लेंडर में सोडियम क्लोराइड पीस और 100 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटर पर सूखी।
  2. सूखे सोडियम क्लोराइड (समय में 45 ग्राम) प्रतिध्वनि में होने वाली बिना उच्चतम उपलब्ध आवृत्ति पर 30 मिनट के लिए एक sieving मशीन में डाल दिया। छह नमक अंशों लीजिए, माइक्रोन 500 से 1000 माइक्रोन (एम 500) को लेकर; से 300 माइक्रोन के लिए 500 माइक्रोन (एम 300); से 100 माइक्रोन के लिए 200 माइक्रोन (एम 100); से 90 माइक्रोन के लिए 100 (एम 90); 45 माइक्रोन नमक कणों के साथ (एम 45) से 65 माइक्रोन और अंत में एम 10 से छोटे से अधिक 45 माइक्रोन आकार के रूप में चित्र 1 में schematized।
  3. वैक्यूम आदेश प्रसंस्करण के दौरान hydrolytic तराश से बचने के लिए रात भर सभी सामग्री सूखी। कांच संक्रमण - पॉलिमर के मामले में - प्रत्येक सामग्री के लिए, आदेश पर काबू पाने के बिना सूखने की डिग्री को अधिकतम करने के तापमान का चयन करें। इसलिए, टी = 90 डिग्री पीएलए के लिए टी = 25 डिग्री सेल्सियस खूंटी के लिए सी और, टी = NaCl के लिए 105 डिग्री सेल्सियस चुनें।
  4. चारापीएलए, खूंटी और सोडियम क्लोराइड, क्रमशः 20/5/75 के एक वजन प्रतिशत रचना के साथ, टी = 190 डिग्री सेल्सियस पर एक बैच मिक्सर परिचालन और एन = 60 rpm और तब के बारे में बाद टोक़ के एक निरंतर मूल्य प्राप्त करने के लिए जब तक उन्हें प्रक्रिया है, आमतौर पर करने के लिए 10 मिनटों। इसके बाद तेजी से जिसके परिणामस्वरूप सामग्री इकट्ठा।
  5. एक प्रयोगशाला प्रेस 210 डिग्री सेल्सियस पर परिचालन का उपयोग करके मोनो परतों को तैयार 10 मिमी की एक व्यास और 3 मिमी की ऊंचाई के साथ उचित बेलनाकार नए नए साँचे में मिश्रणों डाल दिया है और उन्हें परिवेश के दबाव में 60 सेकंड और 180 बार में 3 मिनट के लिए रख । इसके बाद, कमरे के तापमान पर मिश्रणों शांत, 180 बार के दबाव को बनाए रखने।
  6. संपीड़न मोल्डिंग के माध्यम से तीन परतों के विधानसभा
    1. में (1.5) में वर्णित है कि उसी तरह के रूप लेकिन विभिन्न molds का उपयोग कर, यानी 10 मिमी की एक व्यास और 1 मिमी की ऊंचाई होने में प्रत्येक एकल परत तैयार करें। अंत में, प्राप्त 6 डिस्क 10 मिमी की एक व्यास और 1 मिमी की ऊंचाई होने के छह अलग अलग कण आकार युक्त एम 500, एम 300, एम 100,
    2. एफओआर तीन परत पाड़ एक कोडांतरण (टीएलएस ए), बेलनाकार मोल्ड के अंदर एम 500, एम 300 और एम 100 ढेर और परिवेश के दबाव में 60 सेकंड और 3 मिनट के लिए 210 डिग्री सेल्सियस पर काम कर रही एक प्रयोगशाला प्रेस में उन्हें संपीड़न ढालना 180 बार और फिर कमरे के तापमान पर ठंडा, 180 बार के दबाव को बनाए रखने।
      नोट: टीएलएस ए के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करते हुए एक दूसरे को एम 90, एम 45 और एक ही नए नए साँचे में एम 10 और आचरण संपीड़न मोल्डिंग आपरेशन पर stacking द्वारा टीएसएल बी तैयार
  7. बेलनाकार नए नए साँचे से डिस्क निकालें और सरगर्मी के बिना, एक उबलते demineralized पानी के स्नान में डाल दिया। 3 घंटे के बाद, स्नान से उत्पन्न झरझरा संरचनाओं को हटाने और उन्हें एक रासायनिक हुड में कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए सूखी।

2. morphological विश्लेषण

  1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा scaffolds के morphologies का मूल्यांकन।
    1. तरल नाइट्रोजन के तहत नमूने नीचे तोड़ने के लिए और तो देते हैंएक चिपकने वाला कार्बन टेप का उपयोग कर एक एल्यूमीनियम ठूंठ पर नमूने हैं। अंत में, धूम-coate सोने से पहले इमेजिंग आर्गन वातावरण के तहत 90 S के लिए आदेश परीक्षण के दौरान electrostatic छुट्टी से बचने के लिए।

3. पाड़ ताकना आकार

  1. एक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पाड़ के छेद के आकार वितरण पहचान करने में सक्षम के साथ SEM विश्लेषण से प्राप्त छवियों प्रकाश डालेंगे।
    नोट: इस काम में ध्यान में लीन होना आकार वितरण विश्लेषण एक MATLAB आधारित सॉफ्टवेयर पहले से 33 में वर्णित का उपयोग किया गया

4. Porosity

  1. leaching पहले नमूने वजन और निम्न अभिव्यक्ति के अनुसार सैद्धांतिक porosity का मूल्यांकन:
    1 समीकरण
    नोट: सोडियम क्लोराइड, मी मी खूंटी और पीएलए मीटर, क्रमशः सोडियम क्लोराइड, खूंटी, और पीएलए के सैद्धांतिक बड़े पैमाने पर कर रहे हैं, सजातीय मिश्रणों संभालने के द्वारा। टीवह घनत्व सोडियम क्लोराइड, खूंटी और पीएलए के (ρ) क्रमश: 2,16 ग्राम / सेमी 3, 1,12 ग्राम / सेमी 3 ई 1,24 ग्राम / सेमी 3 रहे हैं।
  2. Leaching और व्यवस्था के नमूने पाड़) की स्पष्ट घनत्व का आकलन करने में सुखाने के बाद नमूने वजन, और फिर पाड़ की स्पष्ट घनत्व और गैर झरझरा पीएलए के घनत्व के बीच अनुपात के पारस्परिक रूप में वास्तविक porosity का मूल्यांकन अभिव्यक्ति का उपयोग (2)।
    नोट: यह पाड़ की खाली मात्रा और (खाली + पूर्ण) पाड़ की पूरी मात्रा के बीच का अनुपात व्यक्त करता है।
    2 समीकरण

5. यांत्रिक गुण

  1. compressive मोड के तहत नमूने एक तन्य मशीन, एक 1 केएन लोड सेल के साथ सुसज्जित का उपयोग कर परीक्षण। 1 मिमी -1 मिनट की एक निरंतर तनाव दर निर्धारित करें।
  2. आदेश मनोवैज्ञानिक वातावरण में नमूनों की जांच करने के लिए यांत्रिक प्रदर्शन में, dynamomete लैस(पीबीएस) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक स्नान युक्त, (पीएच = 7.4) के साथ आर और बिंदु 5.1 में वर्णित है कि जैसे ही स्थापना के साथ परीक्षण करते हैं।
    1. गीला वातावरण में प्रत्येक माप से पहले, आदेश पीबीएस भरने के सभी pores जाने के लिए 5 मिनट के लिए एक वैक्यूम फ्लास्क में पीबीएस के साथ नमूने लेना। इसके बाद, scaffolds सेट बिंदु तापमान तक पहुंचने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रहने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. एक कस्टम डिजाइन इंटरफेसियल शक्ति परीक्षण उपकरण, एक विधि साहित्य 32,34 में वर्णित के बाद एक यांत्रिक परीक्षण मशीन से जुड़ा का उपयोग करके इंटरफेसियल आसंजन ताकत (आईएएस) एल ए और एल बी की परतों के बीच निर्धारित करते हैं।
    1. रिग पर पाड़ फिक्स और मशीन के लोड सेल और बेस प्लेट के साथ अपने सही संरेखण किया जाता है। एक उच्च चिपचिपापन चिपकने का उपयोग करके एल्यूमीनियम परीक्षण स्टब्स को पाड़ नमूने देते हैं और उन्हें परीक्षण के लिए उपकरण में जगह है।
    2. गीला हालत परीक्षण के लिए, 1 घंटा प्राथमिक के लिए पीबीएस में नमूने हाइड्रेटया परीक्षण करने के लिए। एक 1 केएन लोड सेल का प्रयोग करें, एक तन्य लोड 1 मिमी मिनट -1 के एक तनाव दर से लागू तहत।
      नोट: खाते में है कि विफलता हो सकता है या तो परतों में से एक का अंतिम तन्य शक्ति पर या इंटरफेस में delamination की वजह से। आईएएस तनाव तनाव की अवस्था का अधिकतम शक्ति के रूप में मूल्यांकन।

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Representative Results

Scaffolds के ध्यान में लीन होना वास्तुकला पर NaCl कण आकार के प्रभाव के नमूनों की जांच की आकृति विज्ञान और छवि विश्लेषण से ताकना आकार के वितरण की गणना क्रमश गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन किया गया था 2A आंकड़ा -। मोनो बहुस्तरीय scaffolds जिसके परिणामस्वरूप के SEM micrographs से पता चलता है सामग्री विभिन्न सोडियम क्लोराइड युक्त कण आकार के नमक-लीचिंग से।

विस्तार में और अधिक, एम 500 (चित्रा 2) 500 माइक्रोन के एक औसत व्यास के साथ दिखाया है pores, शायद अधिक से अधिक 500 माइक्रोन पिघल मिश्रण के दौरान व्यास के साथ नमक कणों का टूटना के कारण है। जैसा कि स्पष्ट रूप से एक ही व्यक्ति से दिखाई दे, ताकना वास्तुकला अनियमित pores, खराब परस्पर, के बारे में 10 माइक्रोन की दीवारों से घिरा हुआ है की कम संख्या की विशेषता है। चित्रा 2 बी एम 300 की आकृति विज्ञान इस रिपोर्ट मेंमामले, pores इस प्रकार पुष्टि है कि कोई कण टूटना पिघल मिश्रण प्रक्रिया के भीतर हुई, नमक पिघल मिश्रण (300-500 माइक्रोन) के दौरान भरे कणों का एक ही सीमा के भीतर एक औसत व्यास प्रदर्शन करने के लिए पाए गए। ताकना दीवारों एम 500 परत में मनाया उन लोगों की तुलना में पतली (लगभग 5 माइक्रोन) पाए गए। एम 100, (चित्रा 2 सी), एक bimodal झरझरा संरचना, एक विषम बड़े pores (100-200 माइक्रोन) छोटे लोगों से घिरा द्वारा रचित नेटवर्क की विशेषता से पता चलता है। हालांकि दीवारों की मोटाई की एक कठोर पतले होने का निर्धारण इस ताकना वास्तुकला, एक बेहतर इंटरकनेक्टिविटी और मात्रा इकाई के लिए एक बढ़ा ताकना घनत्व प्रदान करता है। चित्रा 2 डी में प्रदान एम 90 की आकृति विज्ञान, पता चलता है, मोटे तौर पर घन pores, समान रूप से बहुलक मैट्रिक्स भर में वितरित, छोटे नमक आकार रेंज (90-100 माइक्रोन) इस मामले में इस्तेमाल की वजह से। Micropores, खूंटी solvation के कारण दीवारों कि, वास्तव में, बहुत कठिन दिखाई अंदर सूक्ष्म सुरंगों के रूप में उपस्थित थे। एसईएम 45 के एम माइक्रोग्राफ़, चित्रा 2 ई में दिखाया गया है, pores, जो व्यास 45 माइक्रोन से 65 माइक्रोन के लिए रेंज के एक उच्च घनत्व प्रदर्शित करता है। एम 10 (चित्रा 2 एफ) एक दूसरे का संबंध के एक उच्च डिग्री और बहुत पतली (<1 माइक्रोन) की दीवारों के साथ, प्रति इकाई मात्रा औसतन ताकना आकार 20 माइक्रोन के लगभग बराबर है pores के उच्चतम घनत्व का प्रदर्शन किया।
चित्रा 3 ए, ए ', एक "टीएलएस ए के एक पार अनुभाग प्रत्येक एक अलग औसत ताकना आकार की विशेषता को प्रदर्शित करता है, लीचिंग की प्रक्रिया के बाद, विभिन्न आवर्धन पर। चित्रा 3 ए में यह स्पष्ट रूप से तीन परतों की पहचान करने के लिए संभव है, जबकि पैनल के एक 'और एक' एम उल्लेख करने के लिए 100 एम 300 और एम 300 एम 500 इंटरफेस क्षेत्रों, क्रमशः। स्पष्ट रूप से दिखाई के रूप में, पूरे डिवाइस किसी भी आंतरिक चोली पेश न ही अलग परतों के बीच अलगाव मैट्रिक्स नहीं है। तुलनात्मक रूप से, टीएलएस बी और संबंधित इंटरफेस चित्रा 3 बी में रिपोर्ट कर रहे हैं, ख ',बी "। छवियों, विभिन्न आकार के pores के साथ तीन परतों को आसानी से पहचाना जा सकता है (पैनल बी), एक आकृति विज्ञान टीएलएस ए दरअसल के समान का पता चला है, जबकि दोनों एम 10 एम 45 (पैनल बी ') और एम 45 एम 90 (पैनल बी ") इंटरफेसियल क्षेत्रों कोई flaking है और न ही अलगाव का प्रदर्शन किया। जैसी कि उम्मीद थी, प्रत्येक एकल परत विधानसभा और लीचिंग कदम के बाद ही ध्यान में लीन होना वास्तुकला बरकरार रखती है।

तालिका 1 सामग्री के compressive लोचदार moduli, हवा (सूखा) और पीबीएस (गीला) वातावरण में मापा जाता रिपोर्ट। यह संपत्ति मतलब ताकना आकार के साथ एक monotonic वृद्धि का पालन करने के लिए मिला था। अंतिम उपकरणों की लोचदार moduli मुख्य रूप से सूखे और गीले वातावरण में अपने-अपने कमजोर परत से निर्धारित होते हैं (यानी एम 100 टीएलएस ए और एम 10 टीएलएस बी के लिए) के लिए दोनों TLSS की जांच की। टीएलएस ए और बी टीएलएस के लिए 2 टेबल रिपोर्टों आईएएस । कोई interlayer delamination घटना मनाया गया, असफलता के बाद सेहमेशा टीएलएस ए (एम 100) और टीएलएस बी (एम 10) की सबसे कमजोर परतों के बीच में आ गई है। टीएलएस एक सबसे अच्छा आईएएस प्रदर्शन का प्रदर्शन किया।

आकृति 1
चित्रा 1:। NaCl granulometry के Schematics sieved NaCl कणों और इसी नमूना कोड के granulometry।

चित्र 2
चित्रा 2: आकृति विज्ञान monolayer scaffolds के विभिन्न ताकना आकार वितरण की विशेषता monolayer scaffolds के SEM micrographs:। एम 500 (क), स्केल बार = 400 माइक्रोन; एम 300 (ख), स्केल बार = 400 माइक्रोन; एम 100 (सी), स्केल बार = 400 माइक्रोन; एम 90 (डी), स्केल बार = 200 माइक्रोन; एम 45 (ई), स्केल बार = 40081;। एम और एम 10 (च), स्केल बार = 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: तीन परत scaffolds की आकृति विज्ञान (एक, एक ',' एक ') त्रि-स्तरीय पाड़ प्रकार एक (टीएलएस ए) के SEM micrographs: (क) पूरे पार अनुभाग, स्केल बार = 500 माइक्रोन; (ए ') एम 100 एम 300 इंटरफेस, स्केल बार = 250 माइक्रोन; ( 'एक') एम 300 एम 500 इंटरफेस, स्केल बार = 250 माइक्रोन। (बी, बी ',' बी '') त्रि-स्तरीय पाड़ ग्रुप बी (टीएलएस बी) के SEM micrographs: (बी) पूरे पार अनुभाग, पैमाने बार 500 माइक्रोन; (ख ') एम 10 एम 45 इंटरफेस, स्केल पट्टी; = 100 माइक्रोन; (ख '') एम 45 एम 90 इंटरफेस, स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना कोड सूखी - ई (एमपीए) गीले - ई (एमपीए)
एम 500 40.33 ± 6.04 33.23 ± 4.96
एम 300 37.62 ± 6.89 31.42 ± 5.83
एम 100 32.12 ± 5.11 28.03 ± 4.04
एम 90 30.87 ± 4.93 26.91 ± 3.79
एम 45 25.36 ± 5.82 22.83 ± 5.01
एम 10 21 .76 ± 3.91 19.87 ± 3.93
टी एल ए 33.08 ± 5.21 29.55 ± 4.09
टी एल बी 22.31 ± 5.46 20.54 ± 3.87

तालिका 1: Compressive यांत्रिक परिणाम मोनो और गीले और सूखे वातावरण में विभिन्न ताकना आकार के साथ त्रि-स्तरीय scaffolds के Compressive युवा मापांक।। मान ± एसडी साधन के रूप में दिया जाता है।

नमूना कोड सूखी - आईएएस (केपीए) गीले - आईएएस (केपीए)
टी एल ए 350.8 ± 51.2 299.6 ± 35.1
टी एल बी 262.3 ± 62.2 220.5 ± 31.3
ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> तालिका 2:।। ± एसडी मतलब है के रूप में पाड़ इंटरफेसियल आसंजन ताकत इंटरफेसियल आसंजन शक्ति परीक्षण एल ए और बी एल के लिए परिणाम सूखे और गीले हालत में मान दिया जाता है।

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Discussion

पहला महत्वपूर्ण कदम दक्षता sieving का अनुकूलन है। NaCl कण आकार के उच्च नियंत्रण वांछित ताकना आकार के वितरण के साथ पाड़ की तैयारी के लिए मौलिक है। एक और महत्वपूर्ण कदम मोल्ड से नमूना निकासी के दौरान पतली पीएलए monolayers के फ्रैक्चर से परहेज है। इमेज प्रोसेसिंग विश्लेषण पूरे डिवाइस के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है।

तन्यता परीक्षण के दौरान, नमूना उपकरणों से दूर फाड़ कर सकते हैं।

कदम sieving करने से पहले, पता लगाना है कि नमक अच्छी तरह से आदेश NaCl कण आकार के एक उच्च नियंत्रण पाने के लिए सूखे की है। यह समस्या अपने बेहद उच्च hygroscopicity के कारण, विशेष रूप से छोटी से छोटी नमक के कण आकार के लिए महत्वपूर्ण है। संपीड़न मोल्डिंग कदम से पहले, आदेश में नए नए साँचे से नमूना हटाने की सुविधा के लिए नए नए साँचे पर एक पतली Teflon स्प्रे कोटिंग लागू होते हैं। इमेज प्रोसेसिंग विश्लेषण विचार अलग छवियों लिया द्वारा बाहर किया जाना चाहिएपाड़ के विभिन्न क्षेत्रों से यकीन है कि वे पूरे डिवाइस के प्रतिनिधि हैं होने के लिए। अंत में, पूर्व परीक्षण (विशेष रूप से गीला वातावरण में किए गए उन) तन्यता, ध्यान से चिपकने वाला आसंजन नमूने को सत्यापित करने के लिए।

तकनीक की प्रिंसिपल सीमा में छेद के आकार की एक सतत ढाल प्राप्त करने के लिए असंभव में निहित है। दरअसल, विधि यहाँ बताया क्योंकि यह विभिन्न परतों के संयोजन पर आधारित है की अनुमति देता है, ताकना आकार के एक असतत ढाल प्राप्त करने। ज्यादातर मामलों में, एक अच्छी तरह से परिभाषित बहुपरत पाड़ के लिए एक लगातार एक है, लेकिन कभी नहीं वर्गीकृत पसंद किया जा सकता है। इस सीमा को आंशिक रूप से जाहिर परतों की संख्या है, जो बदल जाता है पतली परतों में नतीजा होगा, बढ़ती अधिक संभालना मुश्किल से पार किया जा सकता है।

अलग तरह से कई अन्य उत्पादन प्रौद्योगिकियों से, यहाँ रणनीति को अपनाया पर्यावरण के अनुकूल माना जा सकता है, क्योंकि यह किसी भी विषाक्त विलायक संभावित खतरनाक आवश्यकता नहीं हैपर्यावरण के लिए और कोशिकाओं और ऊतकों जीने के लिए। इसके अलावा, कण लीचिंग दोनों छेद के आकार और porosity ट्यूनिंग द्वारा के एक उच्च नियंत्रण क्रमशः आकार और सोडियम क्लोराइड की मात्रा को पीएलए के साथ मिश्रित है।

इस तकनीक का भविष्य अग्रिमों संभावना पर भरोसा अन्य केमो-शारीरिक मतभेद पेश परतों इकट्ठा करने के लिए। उदाहरण के लिए, एक अलग biopolymers इकट्ठा या इस तरह के हाइड्रॉक्सियापटाइट 28, Nanocellulose 27, graphene 35 या उसके डेरिवेटिव आदेश भी आगे कार्यक्षमताओं 38 प्रदान करने के लिए 9,36,37 के रूप में विभिन्न नैनोकणों, के साथ प्रत्येक परत मजबूत कर सकते हैं। वास्तव में, इस पद्धति का एक उच्च इस तरह आसानी से बहुपरत पाड़ के प्रत्येक क्षेत्र धुन करने के लिए अनुमति नियंत्रण सुनिश्चित करता है। यह चुनौती है, ITE में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते के बाद से बहु phasic और / या anisotropic जैव-संरचनाओं की उपस्थिति है कि धीरे-धीरे एक ऊतक से दूसरे को बदलने ऐसे बंध-से-ख के रूप में इंटरफ़ेस के ऊतकों के विशिष्ट विशेषताएं हैं,एक, पट्टा करने वाली हड्डी और उपास्थि करने वाली हड्डी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(lactic acid) NatureWorks PLA 2002D
Poly(ethylene glycol) Sigma 83797-1KG-F
Sodium Cloride Sigma 793566-5KG-D
Phosfate Buffer Solution Sigma P5368-10PAK
Laboratory Mixer Brabender PLE 330 - Plasticorder
Laboratory Press Carver
Scanning Electron Microscopy Phenom-world ProX
Universal Testing Machine Instron 3365 (UK)
BioPuls Bath Instron, Norwood
Sieving Machine Endecotts E.V.F.1.
Vacuum Oven ISCO NSV9035
Precision Balance Sartorius AX224

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 116 कार्यात्मक वर्गीकृत चबूतरा इंटरफ़ेस ऊतक इंजीनियरिंग मिश्रण पिघला पार्टिकुलेट leaching ताकना आकार ढाल पीएलए खूंटी
एक सतही और पारिस्थितिकी के अनुकूल रूट के निर्माण के लिए साथ वर्गीकृत ताकना आकार पाली (लैक्टिक एसिड) Scaffolds
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Scaffaro, R., Lopresti, F., Botta, L., Maio, A., Sutera, F., Mistretta, M. C., La Mantia, F. P. A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size. J. Vis. Exp. (116), e54595, doi:10.3791/54595 (2016).

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