Protocol
1. Scaffold Fabrication
- Mahlen NaCl in einem Labormischer für 20 min trocknen und es auf einem Erhitzer auf 100 ° C.
- Setzen Sie den getrockneten NaCl (45 g zum Zeitpunkt) in einer Siebmaschine 30 Minuten bei der höchsten verfügbaren Frequenz ohne in Resonanz auftritt. Sammeln sechs Salzfraktionen, im Bereich von 500 um bis 1000 um (M 500); von 300 um bis 500 um (M 300); von 100 um bis 200 um (M 100); von 90 um bis 100 (M 90); von 45 & mgr; m bis 65 & mgr; m (M 45) und schließlich 10 M mit Salzpartikel Größe kleiner als 45 um , wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
- Vakuum-Trocknen über Nacht alle Materialien, um hydrolytische Spaltung bei der Verarbeitung zu vermeiden. Für jedes Material wählen, die Temperatur, um den Trocknungsgrad ohne Überwindung zu maximieren - im Falle von Polymeren, - die Glasübergangs. Daher T = 90 ° C für PLA und T = 25 ° C für PEG, T = 105 ° C für NaCl wählen.
- FütternPLA, PEG und NaCl, mit einem Gewichtsprozentzusammensetzung 20/5/75 jeweils zu einem Chargenmischer Betriebs bei T = 190 ° C, und n = 60 rpm und dann verarbeiten, bis ein konstanter Wert des Drehmoments zu erreichen, in der Regel nach ca. 10 Minuten. Danach sammeln schnell das erhaltene Material.
- Bereiten Sie die Monoschichten durch eine Laborpresse bei 210 ° C betrieben wird, legen Sie die Mischungen in geeigneten zylindrischen Formen mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 3 mm und halten sie für 60 Sekunden bei Umgebungsdruck und 3 Minuten bei 180 bar . Danach kühlen die Mischungen bei Raumtemperatur, um den Druck von 180 bar gehalten wurde.
- Versammlung der Drei-Schichten über Formpressen
- Bereiten Sie jede einzelne Schicht in der gleichen Weise wie in (1.5), aber unter Verwendung unterschiedlicher Formen, dh einen Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 1 mm. Schließlich erhalten 6 Scheiben mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 1 mm, mit sechs unterschiedlichen Teilchengrößen: M 500, M 300, M 100,
- for Montage dreischichtige Gerüst A (TLS A), häufen sich M 500, M 300 und M 100 innerhalb der zylindrischen Form und kompressions formen sie in einer Laborpresse für 60 Sekunden bei Umgebungsdruck und 3 Minuten bei 210 ° C, der bei 180 bar und abgekühlt, dann bei Raumtemperatur, um den Druck von 180 bar gehalten wurde.
HINWEIS: Bereiten Sie die TSL B von M aufeinander stapeln 90, M 45 und M 10 in den gleichen Formen und führen die Formpressen Betrieb durch das gleiche Verfahren wie für die TLS-A verwendet folgende
- Entfernen Sie die Platten aus den zylindrischen Formen und steckte sie in einem siedenden Wasserbad entmineralisiert, ohne sich zu rühren. 3 Stunden nach, entfernen Sie die erhaltenen porösen Strukturen aus dem Bad und lassen Sie sie für 12 Stunden bei Raumtemperatur in einer chemischen Haube trocken.
2. Morphologische Analyse
- Werten die Morphologien der Gerüste durch Rasterelektronenmikroskopie.
- Überwinden Sie die Proben unter flüssigem Stickstoff und befestigen Sie dann dieProben auf einem Aluminium Stub einen Klebstoff Kohlenstoffband verwendet wird. Schließlich Sputter-coate mit Gold für 90 s unter Argonatmosphäre vor der Abbildung, um während der Prüfung elektrostatische Entladungen zu vermeiden.
3. Scaffold Porengröße
- Aufwendige die durch SEM-Analyse erhaltenen Bilder mit einer Bildverarbeitungssoftware können die Porengrößenverteilung des Gerüsts zu erkennen.
HINWEIS: In dieser Arbeit wird die Verteilungsanalyse Porengröße wurde zuvor eine MATLAB-basierte Software durchgeführt 33 beschrieben
4. Porösität
- Wiegen der Proben vor dem Auslaugen und bewerten die theoretische Porosität nach dem folgenden Ausdruck:
HINWEIS: M NaCl, m und m PEG PLA, sind jeweils die theoretische Masse von NaCl, PEG und PLA, durch homogene Mischungen übernehmen. Ter Dichten (ρ) von NaCl, PEG und PLA jeweils 2,16 g / cm 3, 1,12 g / cm 3 e 1,24 g / cm 3. - Wiegen Sie die Proben nach dem Auslaugen und Trocknen, um die scheinbare Dichte der Proben (ρ Gerüst) zu beurteilen, und dann auszuwerten die reale Porosität als der Kehrwert des Verhältnisses zwischen der scheinbaren Dichte des Gerüsts und die Dichte des nicht-porösen PLA durch Verwendung von Ausdruck (2).
HINWEIS: Es drückt das Verhältnis zwischen dem Leervolumen des Gerüsts und das volle Volumen des Gerüsts (leer + voll).
5. Mechanische Eigenschaften
- Testen Sie die Proben unter Druckmodus einen Zug-Maschine, ausgerüstet mit einer 1 kN Lastzelle. Stellen Sie einen konstanten Verformungsgeschwindigkeit von 1 mm min -1.
- Um die mechanische Leistung der Proben in physiologischer Umgebung zu untersuchen, statten die dynamometer mit einem Bad mit (PBS) (pH = 7,4) bei 37 ° C und den Test mit dem gleichen Aufbau wie in Punkt 5.1 beschrieben durchführen.
- Vor jeder Messung in feuchter Umgebung, genießen Sie die Proben mit PBS in einem Vakuumflasche für 5 Minuten, um PBS zu lassen alle Poren füllen. Danach ermöglichen es die Gerüste für 15 min bei 37 ° C in PBS zu bleiben, um die Solltemperatur zu erreichen.
- Bestimmung der Grenzflächenhaftfestigkeit (IAS) zwischen den Schichten von TL und TL A B durch eine anwendungsspezifische Grenzflächenfestigkeit Testausrüstung verwendet, die mit einer mechanischen Prüfmaschine nach einem Verfahren in der Literatur beschrieben 32,34.
- Befestigen Sie das Gerüst auf der Anlage und sorgen für die korrekte Ausrichtung mit der Wägezelle und Grundplatte der Maschine. Bringen Sie die Gerüst Proben auf Aluminiumtest Stubs durch eine hohe Viskosität Klebstoff und legen Sie sie in das Gerät zum Testen.
- Für den nassen Zustand Test, Hydrat die Proben in PBS für 1 Stunde prioder zum Testen. Verwenden einer 1 kN Lastzelle unter einer Zugbelastung bei einer Dehnungsgeschwindigkeit von 1 mm aufgetragen min -1.
Hinweis: Berücksichtigen Sie, dass der Ausfall entweder bei der Zugfestigkeit von einer der Schichten oder wegen der Ablösung an den Schnittstellen auftreten können. Bewerten Sie die IAS als die maximale Stärke der Spannungs-Dehnungs-Kurve.
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Representative Results
Der Einfluss von NaCl Partikelgröße auf der Porenarchitektur der Gerüste wurde qualitativ und quantitativ bewertet , indem die Morphologie der Proben untersucht und die Porengrößenverteilung durch Bildanalyse zu berechnen, jeweils 2a Figur -. F zeigt SEM - Aufnahmen von einschichtigen Gerüste resultierende von Salz-Auslaugung von Materialien mit unterschiedlichen NaCl Partikelgrößen enthält.
Mehr im Detail, M 500 (Abbildung 2a) zeigten Poren mit einem mittleren Durchmesser von 500 um, wahrscheinlich aufgrund der Bruch von Salzpartikeln mit einem Durchmesser von mehr als 500 & mgr; m während des Schmelzmischens. Wie deutlich sichtbar aus der gleichen Figur Porenarchitektur durch eine geringe Anzahl von unregelmäßigen Poren gekennzeichnet ist, schlecht miteinander verbunden sind , 10 durch die Wände von etwa umgeben um. 2b berichtet die Morphologie von M 300. In dieserFall wurden die Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser im gleichen Bereich der Salzpartikel während des Schmelzmisch (300-500 & mgr; m), wodurch bestätigt wird, dass kein Teilchen Bruch trat innerhalb von Schmelzmischverfahren gefüllt zu zeigen gefunden. Pore Wände waren dünner zu sein (etwa 5 & mgr; m) als die in M 500 Schicht beobachtet gefunden. M 100, (Abbildung 2c) zeigt eine bimodale Porenstruktur, die von einem heterogenen Netzwerk von großen Poren zusammengesetzt aus (100-200 um), umgeben von kleineren. Diese Porenarchitektur sorgt für eine bessere Vernetzung und eine erhöhte Porendichte für Volumeneinheit, obwohl eine drastische Ausdünnung der Wände Dicke zu bestimmen. Die Morphologie von M 90, in Figur 2d zeigt grob cubic Poren homogen über die Polymermatrix verteilt ist , aufgrund der geringeren Salzgrößenbereich (90-100 um) in diesem Fall verwendet. Mikroporen, waren aufgrund PEG Solvatation vorhanden als Mikrotunnel innerhalb der Mauern, die in der Tat sehr rau erscheinen. SEM Mikrographie von 45 M, in Figur 2e gezeigt ist , zeigt eine hohe Dichte von Poren, die Durchmesser von 45 um bis 65 um liegen. 10 M (Figur 2f) angezeigt , um die höchste Dichte von Poren pro Volumeneinheit, einer mittleren Porengröße ungefähr gleich 20 um, mit einem hohen Grad an Vernetzung und sehr dünnen (<1 um) Wänden.
Figur 3a, a ', a "zeigt einen Querschnitt von TLS A, nach der Laugung mit unterschiedlicher Vergrößerung. In Figur 3a ist es möglich , deutlich die drei Schichten identifizieren, die jeweils durch unterschiedliche mittlere Porengröße gekennzeichnet, während die Platten a 'und a "beziehen sich auf M 100-M 300 und M 300-M 500 - Schnittstelle Regionen sind. Wie deutlich sichtbar, präsentieren das ganze Gerät über keine internen Spaltungen noch Matrix Diskontinuität zwischen den verschiedenen Schichten. Analog dazu TLS B und zugehörige Schnittstellen sind in 3b, b 'gemeldet,b ". Die Bilder zeigten eine Morphologie ähnlich der von TLS A. Tatsächlich drei Schichten mit Poren unterschiedlicher Größen können leicht (Panel b) erkannt werden, während sowohl M 10-M 45 (Panel b ') und M 45-M 90 (Panel b ") Grenzflächenbereiche zeigten keine Abplatzungen noch Diskontinuität. Wie erwartet, behält jede einzelne Schicht die gleiche Porenarchitektur nach der Montage und Auslaugung Schritte.
Tabelle 1 zeigt die Kompressionselastizitätsmoduln der Materialien, gemessen in Luft (trocken) und in PBS (wet) -Umgebung. Diese Eigenschaft wurde gefunden eine monotone Zunahme mit der mittleren Porengröße zu folgen. Die Elastizitätsmoduln der endgültigen Vorrichtungen sind hauptsächlich durch ihre jeweiligen schwächeren Schicht (dh M 100 für TLS A und M 10 für TLS B) sowohl für die TLSS bestimmt sucht. Tabelle 2 zeigt IAS für TLS A und TLS B in trockenen und feuchten Umgebung . Keine Zwischen Delaminationserscheinungen beobachtet wurden, seit dem Scheiternin der Mitte der schwächsten Schichten TLS A (M 100) und TLS B (M 10) immer auftrat. TLS A angezeigt, um die besten IAS Leistung.
Abb . 1: Schema von NaCl Granulometrie Granulometrie gesiebter NaCl - Partikel und entsprechende Probe - Codes.
Abbildung 2: Morphologie von einschichtigen Gerüste REM - Aufnahmen von einschichtigen Gerüste durch unterschiedliche Porengrößenverteilungen charakterisiert:. M 500 (a), Maßstabsbalken = 400 & mgr; m; M 300 (b), Maßstabsbalken = 400 & mgr; m; M 100 (c), Maßstabsbalken = 400 & mgr; m; M 90 (d), Maßstabsbalken = 200 & mgr; m; M 45 (e), Maßstabsbalken = 40081;. M und M 10 (f), Maßstabsbalken = 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3: Morphology of dreischichtige Gerüste (a, a ', a' ') REM - Aufnahmen von dreischichtigen Gerüsttyp A (TLS A): (a) gesamten Querschnitt, Maßstabsbalken = 500 & mgr; m; (A ') M 100-M 300 - Schnittstelle, Maßstabsbalken = 250 & mgr; m; (A '') M 300-M 500 - Schnittstelle, Maßstabsbalken = 250 & mgr; m. (B, b ', b' ') REM - Aufnahmen von dreischichtige Gerüst Typ B (TLS B): (b) gesamten Querschnitt, Maßstab 500 & mgr; m; (B ') M 10-M 45 - Schnittstelle, Maßstabsbalken; = 100 um; (B '') M 45-M 90 - Schnittstelle, Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Beispielcode | Dry - E (MPa) | Wet - E (MPa) |
| M 500 | 40,33 ± 6,04 | 33,23 ± 4,96 |
| M 300 | 37,62 ± 6,89 | 31,42 ± 5,83 |
| M 100 | 32,12 ± 5,11 | 28,03 ± 4,04 |
| M 90 | 30,87 ± 4,93 | 26,91 ± 3,79 |
| M 45 | 25,36 ± 5,82 | 22,83 ± 5,01 |
| M 10 | 21 0,76 ± 3,91 | 19,87 ± 3,93 |
| TL A | 33,08 ± 5,21 | 29,55 ± 4,09 |
| TL B | 22,31 ± 5,46 | 20,54 ± 3,87 |
Tabelle 1: mechanische Druckergebnisse Druck Young - Modul von Mono- und dreischichtige Gerüste mit verschiedenen Porengrößen im nassen und trockenen Umgebung.. Die Werte sind als Mittelwert ± SD angegeben.
| Beispielcode | Trocken - IAS (kPa) | Wet - IAS (kPa) |
| TL A | 350,8 ± 51,2 | 299,6 ± 35,1 |
| TL B | 262,3 ± 62,2 | 220,5 ± 31,3 |
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Discussion
Der erste wichtige Schritt ist die Optimierung der Effizienz Siebung. Die hohe Kontrolle der NaCl-Partikelgröße ist von grundlegender Bedeutung für die Herstellung Gerüst mit gewünschten Porengrößenverteilung. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Vermeidung der Bruch der dünnen PLA Monolayern während der Probenentnahme aus der Form. Die Bildverarbeitungs Analyse möglicherweise nicht repräsentativ für das gesamte Gerät.
Während Zugversuche kann die Probe losreißen von dem Gerät.
Vor Schritt Sieben, festzustellen, dass das Salz gut, um eine höhere Kontrolle über die NaCl Partikelgröße zu erhalten getrocknet wurden. Dieses Problem ist wichtig, vor allem für die kleinsten Salzpartikelgröße aufgrund seiner extrem hohen Hygroskopizität. Vor der Kompression Formungsschritt, eine dünne Teflon Sprühbeschichtung auf die Formen, um die Probenentnahme aus den Formen zu erleichtern. Die Bildverarbeitungsanalyse muss durchgeführt werden, unter Berücksichtigung verschiedener Bilder aufgenommenaus verschiedenen Regionen des Gerüsts um sicher zu sein, dass sie der gesamten Vorrichtung repräsentativ sind. Schließlich vor Tests (vor allem diejenigen, durchgeführt in nasser Umgebung) auf Zug, sorgfältig den Klebstoff überprüfen zu Klebprobe.
Die Hauptbegrenzung der Technik liegt in der Unmöglichkeit, einen kontinuierlichen Gradienten der Porengröße zu erhalten. Tatsächlich das hier beschriebene Verfahren erlaubt ein diskretes Gradienten der Porengröße zu erzielen, da sie sich auf die Montage von verschiedenen Schichten basiert. In den meisten Fällen kann eine gut definierte mehrschichtige Gerüst auf ein kontinuierlich abgestufter eine, aber nicht immer vorzuziehen. Diese Begrenzung teilweise durch die Erhöhung der Anzahl der Schichten überschritten werden kann, was wiederum in dünneren Schichten ergeben würde, offensichtlich schwieriger zu handhaben.
Anders als bei vielen anderen Fertigungstechnologien, die Strategie hier kann angenommen umweltfreundlich angesehen werden, da sie keine toxischen Lösungsmittel potentiell gefährlich erforderlich machtfür die Umwelt und für die lebenden Zellen und Geweben. Weiterhin stellt partikulären Auslaugung eine hohe Steuerung sowohl Porengröße und Porosität durch tuning jeweils die Größe und die Menge des NaCl mit dem PLA vermischt.
Künftige Fortschritte dieser Technik beruhen auf der Möglichkeit, Schichten präsentieren andere chemisch-physikalische Unterschiede zu sammeln. Beispielsweise kann man verschiedene Biopolymere montieren oder jede Schicht mit unterschiedlichen Nanoteilchen verstärken, wie Hydroxyapatit 28, 27 Nanocellulose, Graphen 35 oder seine Derivate 9,36,37 um 38 noch weitere Funktionalitäten bereitzustellen. So ist in der Tat gewährleistet dieses Verfahren eine hohe Kontrolle ganz einfach einstellen jede Region von mehrschichtigen Gerüst ermöglicht. Diese Herausforderung spielen eine entscheidende Rolle in der ITE, da die Anwesenheit von mehrphasige und / oder anisotrope bio-Strukturen, die nach und nach von einem Gewebe zu einem anderen wechseln sind typische Merkmale von Schnittstellen Geweben, wie Ligamentum-to-beine, Sehne-Knochen und Knorpel zu Knochen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(lactic acid) | NatureWorks | PLA 2002D | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma | 83797-1KG-F | |
| Sodium Cloride | Sigma | 793566-5KG-D | |
| Phosfate Buffer Solution | Sigma | P5368-10PAK | |
| Laboratory Mixer | Brabender | PLE 330 - Plasticorder | |
| Laboratory Press | Carver | ||
| Scanning Electron Microscopy | Phenom-world | ProX | |
| Universal Testing Machine | Instron | 3365 (UK) | |
| BioPuls Bath | Instron, Norwood | ||
| Sieving Machine | Endecotts | E.V.F.1. | |
| Vacuum Oven | ISCO | NSV9035 | |
| Precision Balance | Sartorius | AX224 |
References
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