Introduction
Prenatale diagnostiek is een belangrijk klinisch hulpmiddel om genetische ziekten (dwz chromosomale afwijkingen, monogenetische of polygenetische / multifactoriële aandoeningen) en aangeboren afwijkingen (dwz hernia diafragmatica, cystic long laesies, exomphalos, gastroschisis) te evalueren. Vruchtwater (AF) cellen zijn eenvoudig te verkrijgen van routinematig geplande procedures tijdens het tweede trimester van de zwangerschap (dwz vruchtwaterpunctie en amnioreduction) of keizersneden 1, 2. De beschikbaarheid van AF cellen van prenatale en neonatale patiënten geeft de mogelijkheid om deze bron regeneratieve medicijnen en verscheidene onderzoekers onderzochten de mogelijkheid om verschillende weefselbeschadigingen of ziekten met een stamcelpopulatie geïsoleerd uit AF 3, 4, 5, 6 behandel, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Zich gemakkelijk verkrijgen AF cellen van zieke patiënten in een tijdvenster waarin de ziekte is vaak stilstaat, opent de weg naar het idee van deze cel bron voor herprogrammering doeleinden. Inderdaad zou geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen afkomstig van AF cellen worden gedifferentieerd in de cellen van belang in vitro drug tests of weefselengineering, teneinde een adequate patiënt-specifieke therapie bereiden voor de bevalling. Vele studies hebben reeds werd aangetoond dat AF cellen te herprogrammeren en onderverdeeld in een groot aantal celtypes 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.
Sinds de ontdekking van Takahashi en Yamanaka 28 van reprogrammed somatische cellen door de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4), is er vooruitgang geboekt op het gebied van de herprogrammering. Gezien de verschillende werkwijzen kunnen onderscheiden tussen virale en niet-virale benaderingen. De eerste verwacht dat het gebruik van virale vectoren (retrovirussen en lentivirussen), die een hoge efficiëntie, maar meestal onvolledige onderdrukking van de retrovirale transgen met zowel het gevolg van een gedeeltelijk geherprogrammeerd cellijn en het risico van zijninsertiemutagenese 29, 30, 31. De niet-virale werkwijze gebruikt verschillende strategieën: bijvoorbeeld plasmiden, vectoren, mRNA, eiwit, transposons. De afleiding van iPS-cellen vrij van transgene sequenties heeft tot doel de mogelijke schadelijke effecten van lekkende transgenexpressie en insertiemutagenese omzeilen. Van alle hierboven vermelde niet-virale strategie, de piggyBac (PB) transposon / transposase vereist alleen de omgekeerde terminale herhalingen flankeren een transgen en tijdelijke expressie van het transposase enzym katalyseren invoeging of excisie gebeurtenissen 32. Het voordeel bij het gebruik van transposons boven andere werkwijzen voor iPS celgeneratie is de mogelijkheid om vectorvrije iPS cellen met een niet-virale vector benadering dezelfde efficiëntie van retrovirale vectoren toont. Dit kan door trace-less excisie van het transposon geïntegreerde codering voor de reprogramming factoren naar aanleiding van een nieuwe tijdelijke expressie van de transposase in de iPS-cellen 33. Aangezien PB efficiënt in verschillende celtypes 34, 35, 36, 37, is meer geschikt voor een klinische benadering met betrekking tot virale vectoren, en maakt de productie van xeno-vrije iPS cellen strijd met de huidige virusproductie protocollen die xenobiotische gebruiken voorwaarden, wordt dit systeem gebruikt om iPS cellen te verkrijgen uit muizen AF.
Hier stellen we een gedetailleerd protocol volgende reeds gepubliceerde werk om de productie van pluripotente iPS klonen van muizen AF-cellen (iPS-AF-cellen) 38 te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waren in overeenstemming met de Italiaanse wetgeving. Murine AF monsters werden geoogst van zwangere muizen op 13,5 dagen na coïtum (DPC) van C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J muizen geroepen GFP.
1. Transposon Production
OPMERKING: Transposon expressievectoren werden gegenereerd onder toepassing van standaard kloneringswerkwijzen. Het plasmide DNA voor transfectie muis AF-cellen werd bereid onder toepassing van commerciële kits.
- Meng 10 ng plasmide DNA met 50 pl DH5a bacteriën in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Incubeer de microcentrifugebuis op ijs gedurende 20 min.
- Hitteschok bij 42 ° C gedurende 40 sec.
- Plaats microcentrifugebuis op ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg 250 pl voorverwarmde (37 ° C) lysogenie bouillon (LB) bouillon. Schudden (300 rpm) bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Verspreid 30 pi van elke transformatie op LB-platen met 0,1 mg / ml ampicilline. Platen laten drogen en incuberen omgekeerd bij 37 ° C overnight.
- De volgende dag, in de middag, kies 3 kolonies, met behulp van steriele 200 pl tips, uit elke transformatie en overzetten naar 0,1 mg / ml LB amp.
- Schudden (300 rpm) bacteriën overnacht bij 37 ° C.
- Voor plasmidezuivering gebruiken commerciële kits. De plasmiden bij -20 ° C.
2. muis embryonale fibroblast (MEF) Cultuur
- Coating van de 6-well platen met 0,1% gelatine
- Coat platen onder de motorkap toevoegen van 1 ml steriel 0,1% gelatine aan alle zes putjes. Laat de gelatine polymeriseren de incubator (37 ° C) gedurende 1 uur.
- Gooi het overtollige, en droog de platen gedurende 1 uur.
- Met parafilm te verzegelen en opslag platen bij kamertemperatuur.
- Inactivatie van MEF met mitomycine C
- Dooi een flacon van 4 x 10 6 MEF cellen met een 37 ° C bad.
- Zaad MEF in de kap op een petrischaaltje (150 mm) met MEF medium.
- Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- (LET) Voeg mitomycine C (5 mg / ml) wanneer de cellen confluent.
- Plaats cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende 3 uur.
- Verwijder medium met mitomycine C. Was de cellen drie keer met 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
- Voeg 2 ml van de commerciële trypsine en plaats cellen in de 37 ° C incubator gedurende 5 min. Daarna voeg 18 ml medium blokkeren de trypsine reactie te stoppen.
- Tel de cellen met een Burker kamer volgens het protocol van de fabrikant.
- Centrifugeer cellen bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Seed 60.000 cellen / cm2 geïnactiveerde MEF op 0,1% gelatine beklede platen.
- Cultiveren cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2, voor het zaaien AF en / of iPS-AF cellen.
3. Mouse AF Cell Isolation
- Opzetten getimede paringen en check vaginale plugs na 24 uur co-housing.
- Observeer tot 13,5 dpc en offeren zwangere dam door middel van cervicale dislocatie.
- Reinig de buikwand van het dier met behulp 70% ethanol.
- Met een schaar, voeren een middellijn laparotomie incisie de lengte van de buikwand om toegang tot de buikholte krijgen.
- Expose de baarmoeder met behulp van een tang. Verwijder de baarmoeder met een schaar en overbrengen in een 100 mm petrischaal gevuld met steriele 1x PBS op ijs geplaatst.
- Gebruik een stereomicroscoop om de AF te halen bij 10x vergroting.
- Houd de baarmoeder met een tang en verwijder de baarmoederwand met een schaar. Wees voorzichtig om schade aan de vruchtvliezen en de daaruit voortvloeiende vruchtwater lekkage te voorkomen.
- Verzamel foetussen in een 100 mm petrischaal gevuld met steriele 1x PBS en plaats op ijs.
- Pak de placenta van een foetus met een fijne punt pincet en plaats in een schone 100 mm petrischaal.
- Verwijder de dooierzak met behulp van fijne punt pincet.
- Na AF verzamelen, was elke foetus met steriele 1x PBS aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS) en verzamelen in de 15 ml conische buis met de AF.
- Centrifugeer AF bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof onder de motorkap en het zaad van de gepelleteerde AF cellen.
4. Mouse AF Cell Culture
- Het zaaien van de muis AF Cells
- Eén dag voor het zaaien Bereid een 0,1% gelatine bedekte 6-well plaat met mitomycine C behandelde MEF.
- Na AF collectie, zaad van de cellen verkregen uit een vruchtwaterpunctie (ongeveer 1 x 10 7 cellen verkregen uit 6 foetussen) op de mitotisch geïnactiveerde MEF met behulp van AF kweekmedium.
- Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO 2, waarbij het medium elke andere dag.
- Na 7 dagen cultuur, transfect AF cellen na de hieronder beschreven procedure.
5. Transfectie, iPS-AF Cell Generation en Cultuur
OPMERKING: Mouse AF-cellen werden getransfecteerd met de PB-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmide, tezamen met een transposase expressieplasmide (mPBase) en met de omgekeerde tetracycline transactivator (PB-CAG-rtTA) transposon plasmide. Alle plasmiden werden verstrekt door professor Andras Nagy 33.
- Meng 1 ug PB-tetO2-IRES-OKMS met 0,5 ug mPBase en 0,5 ug PB-CAG-rtTA (Totaal DNA: 2 ug) in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Verdun het DNA 100 ul serumvrij medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM).
- Voeg 8 pi van het transfectiereagens (bijvoorbeeld FUGENE) (in een verhouding van plasmide-DNA: transfectiemiddel van 2 ug (DNA) aan 8 pl transfectiemiddel) in de 1,5 ml microcentrifugebuis met DNA.
- Incubeer transfectiereagens / DNA mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Druppelsgewijs 100 ul van het transfectiereagens / DNA mengsel per putje van een 6-well plaat met muis AF cellen en distribueren door voorzichtig zwenken, met een eindvolume van 2 ml / putje. Laat gedurende 24 uur.
- De dag na, induceren de expressie van de factoren Yamanaka's (Oct4, Klf4, cMYC, Sox2) van het voeden van de cellen met vers iPS-AF medium gesupplementeerd met 1,5 ug / ml doxycycline (2 ml medium per putje).
- Voeden cellen elke dag, zonder passage, met verse-DOX bevattend medium (handhaven cellen in media, aangevuld met doxycycline tot punt 5.13).
- Acht cellen binnen 24 uur voor mCherry expressie en dagelijks voor kolonievorming (kolonies verschijnen meestal tussen 20 en 30 dagen na transfectie).
- Een dag voor kolonie plukken, bereiden een 96-well weefselkweek plaat met mitomycine C behandelde MEF.
- Pick enkele kolonies in 50 ul volume usinga 200 pi pipet, en zet ze achter elkaar in een 96-wells plaat in afzonderlijke putjes.
- De dag erna dissociëren elke kolonie in enkele cellen door toevoeging van 50 ul van de commerciële trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Pipet op en neer om de kolonie te splitsen.
- Overdracht 50 pi van trypsine met de gedissocieerde kolonie in een nieuwe put met geïnactiveerde MEF op een 0,1% gelatine beklede 96 well-plaat gevuld met 100 pl vers iPS-AF medium aangevuld met doxycycline.
- Wanneer cellen 60-70% confluentie bereikt, gesplitst in een putje van een 24-wells plaat.
- Wanneer cellen 60-70% confluentie bereikt, gesplitst 1: 2 tot twee putten, een met doxycycline en andere zonder doxycycline, om te controleren of kolonies ook in de toestand zonder doxycycline.
- Doorgaan met iPS-AF-klonen, doxycycline onafhankelijk te handhaven, op geïnactiveerd MEF in de iPS-AF medium.
- Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 DVDsanging medium dagelijks.
6. alkalische fosfatase Staining
- Voeren alkalische fosfatase kleuring volgens het protocol van de fabrikant wanneer er de verschijning van doxycycline onafhankelijke iPS-AF cellen.
7. Immunofluorescentie
- Wanneer er het verschijnen van doxycycline onafhankelijke iPS-AF cellen, zaad 150.000 cellen / cm2 op een putje van een 24-wells plaat met geïnactiveerde MEF en kweken cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- (NB) Bevestig de cellen door toevoeging van 300 pl per putje van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 300 ul van 0,1% NP-40 te permeabilize cellen.
- Spoel de cellen met 300 ul 0,1% PBS-Tween 20.
- Voeg 300 ul van de blokkerende buffer (10% paardenserum in 1x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Gebruik de volgende primaire antilichamen: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) en SSEA1 (1:80). Verdun SSEA1 met 1% runderserumalbumine (BSA), 10% normaal geit serum, 0,3 M glycine in 0,1% PBS-Tween-20. Verdun alle andere antilichamen met 10% paardenserum in 1x PBS.
- Incubeer antilichamen overnacht bij 4 ° C.
- Spoelen met 300 pi 0,1% PBS-Tween-20.
- Gebruik de secundaire antilichamen verdund in 10% paardenserum in 1x PBS: alexa594-geconjugeerd geit anti-muis IgG (1: 200), alexa594 geconjugeerd kip anti-geit IgG (1: 200), alexa594 geconjugeerd kip anti-konijn IgG (1: 200), Alexa568-geconjugeerd geiten anti-muis IgM (1: 200). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Spoel met 1x PBS.
- Vlek kernen met Hoechst-oplossing (1: 10.000) in 1x PBS.
8. In vitro celdifferentiatie
- Om opknoping druppel embryo lichamen (EB's) vormen, kweken enkele druppels (2000 cellen / 20 ul) op het deksel van de petrischalen, met het differentiatiemedium.
- Incubeer de gerechten bij 37 ° Cen 5% CO2 gedurende 4 dagen.
- Transfer EBS in 100 mm bacteriële-grade gerechten in de suspensie cultuur gedurende 3 dagen in differentiatie medium.
- Plate EBS in 24 goed platen bekleed met basaal membraan matrix (1:10 verdund in DMEM) voor nog eens 14 dagen.
- Voor immunofluorescentie analyses gebruikt primaire antilichamen: T (1: 100), αfp (1: 200) en Tubb3 (1: 500) 37.
9. In Vivo Teratoma Formation
- Injecteer 100 ui van 1 x PBS bevattende 1 x 10 6 cellen iPS-AF in de spier van de achterpoot van RAG2 - / - γc - / - muizen.
- Offer muizen door middel van cervicale dislocatie 6 weken na cel injectie.
- Verwijder de tumormassa's, verschillen in grootte, het achterbeen van de muizen voor de volgende analyses.
- Snijd 7-10 pm dikke dwarsdoorsneden van de isopentaan bevroren tumor met behulp van een cryostaat.
- Voor Haematoxyline eend Eosine (HE) Stain:
- Kleuren met HE het tumorweefsel preparaat zij na protocol van de fabrikant.
- Voor immunoperoxidase Stain:
- Fix teratoma secties met 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Permeabilize met 0,1% Triton X-100.
- Incubeer met de volgende antilichamen: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) en αSMA (1: 100) verdund in 1% BSA in 1x PBS. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C (voor Tubb3) of overnacht bij 4 ° C (voor andere antilichamen).
- Blok peroxidase gebruik 100% methanol gedurende 20 min.
- Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C met secundair antilichaam anti-muis HRP-geconjugeerd (1: 150).
- Spoel met 1x PBS.
- Incubeer met peroxidase (HRP) substraat (zie Materialen tabel) gedurende 5 min.
- Spoel met leidingwater gedurende 5 minuten.
- Vlek met Haematoxyline QS 9 sec.
- Spoelen met kraanwater. 10. RNA-extractie uit cellen
- Gebruik commerciële RNA extractie kit volgens de aanbevolen protocol van de fabrikant.
- Homogeniseer de teratoma met behulp van een vijzel en vloeibare stikstof om te voorkomen dat het ontdooien van het monster.
- Weeg 25 mg van het weefsel.
- Voeg 1 ml commercieel reagens voor RNA extractie en 200 ui chloroform.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Centrifugeer bij 13.000 xg en 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Breng de heldere supernatant naar een nieuwe buis.
- Te zuiveren het RNA gebruiken commerciële RNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Synthetiseren de eerste streng cDNA met behulp van een reverse transcriptase voor reverse transcriptie (RT) -polymerase kettingreactie (PCR) en oligo (dT) according het protocol van de fabrikant, tot 50 ng / ul cDNA te verkrijgen. Verdun cDNA met RNase-vrij water in een concentratie van 10 ng / ul.
- RT-PCR uit te voeren met het DNA polymerase volgens het protocol van de fabrikant, gebruikmakend van 1 ng / ul cDNA.
11. RNA-extractie uit Teratoma
12. Reverse transcriptie-polymerase kettingreactie Analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De capaciteit van herprogrammering evalueren, werden muizen AF cellen verzameld uit foetussen van GFP muizen. Cellen werden getransfecteerd met de cirkelvormige transposon plasmide PB-tetO2-IRES-OKMS, waarbij de Yamanaka factoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4) gerelateerd aan de mCherry fluorescerend eiwit in een doxycycline-induceerbare wijze tot expressie brengt, en omgekeerde tetracycline transactivator (PB- CAG-rtTA) plasmiden met het transposase expressieplasmide (mPBase). Muis AF-cellen werden getransfecteerd met Oct4, Klf4, cMYC en Sox2 na 1 week in vitro expansie over een MEF voedsterlaag. Voor de expressie van het exogene factoren, werd doxycycline toegevoegd de dag na de transfectie in een concentratie van 1,5 ug / ml, zoals eerder beschreven 39. De expressie van de mCherry zichtbaar was na 24 uur van de doxycycline Bovendien wijst transfectie. De eerste koloniën met een ES-achtige morfologie verscheen 20 dagen na de doxycycline inductie en werden opgepikt 30 dagen na transfectie. Deze kolonies werden geënt op geïnactiveerd fibroblast feeder lagen. Na het plukken, werden overlevende klonen aangehouden in medium aangevuld met doxycycline voor sommige passages totdat gevonden doxycycline onafhankelijk gerepliceerde putten 33 zijn.
Mouse iPS-AF-klonen werden geëvalueerd op verschillende parameters: mCherry uitdrukking, alkalische fosfatase kleuring, eiwit expressie van de pluripotentie markers Oct4, Sox2, Klf4, Nanog en SSEA1 expressie van exogene en endogene pluripotentie genen (Oct4, Klf4, cMYC en Sox2) in vitro (EBS) en in vivo (teratoom assay) differentiatie. Ze voldeed aan alle criteria geëvalueerd om hun pluripotentie te valideren, zoals samengevat in de figuur 1.
Figuur 1: herprogrammering van de muis AF GFP + cellen. (A) Doxycycline onafhankelijke kolonies iPS-AF GFP + cellen negatief voor de expressie van mCherry en positief voor de alkalische fosfatase (ALP) kleuring. Schaalbalken = 250 urn en 100 urn. (B) Representatieve beelden van stabiele doxycycline-onafhankelijke iPS-AF GFP + cel die Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 en SSEA1. Schaal bar = 100 micrometer. (C) RT-PCR analyse voor de expressie van exogene (vector-gebaseerde primers Tg) en endogene (Oct4, Klf4, cMYC en Sox2) genen. Beta-2-microglobuline (b2m) werd beschouwd als een housekeeping gen. Geherprogrammeerd cellijnen werden gekweekt in de aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) (96 hr) van doxycycline. R1 ES-cellen werden gebruikt als controle. (PCR panel is aangepast Bertin et al. 38 (D) Bruto uiterlijk van teratoma werd 6 weken na de injectie van iPS-AF GFP + cellen in de achterste ledematen van RAG2 - / - γc - / - muis. (E) Teratoma histologie en immunokleuring bevestigd celdifferentiatie in alle drie de kiem lagen (ectoderm, mesoderm en endoderm). αfetoprotein (AFP, endoderm), αsmooth spier actine (αSMA, mesoderm) en β3 tubuline (Tubb3, ectoderm) werden gedetecteerd in de tumor massa. Schaal bar = 100 micrometer. (F) RT-PCR analyse van EBS en teratoom (Te). C +, positieve controle; NTC, non-template control. Vimentine (Vim, mesoderm), αfetoprotein (AFP, endoderm) en β3 tubuline (Tubb3, ectoderm). (PCR panel is aangepast referentie 38). Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voor het induceren van pluripotentie verkrijgen werkwijze is relevant voor mobiele klinische veiligheid met betrekking tot langdurige transplantatie. Tegenwoordig zijn er verscheidene werkwijzen geschikt voor de herprogrammering. Onder de niet-integrerende methoden, het Sendai virus (SeV) vector een RNA virus dat grote hoeveelheden eiwitten kan produceren zonder integratie in de kern van de geïnfecteerde cellen 40 en een strategie om iPS cellen te verkrijgen zijn. SeV vectoren zou een aantrekkelijke kandidaat voor het genereren van klasse-translationele iPS cellen, maar presenteert een aantal tekortkomingen. De virale replicase is gevoelig voor de aard van de transgene sequenties. Aangezien SeV vectoren constitutief repliceren, kunnen ze moeilijk te verwijderen uit de gastheercellen, zelfs als verschillende strategieën worden gebruikt om dit aspect 41, 42 verbeteren. Het vereist speciale behandeling, zoals een Niveau 2 bioveiligheidskast. Daar ikis slechts een commerciële leverancier beschikbaar. Er is een huidige gebrek aan klinische-grade SeV voor herprogrammering en er zijn hoge kosten van iPS cel productie.
Vanwege deze aspecten kan het transposon systeem worden beschouwd als een betere benadering met betrekking tot SeV vectoren en hier stellen we dat dit systeem is een geschikte methode voor herprogrammering muis AF cellen met verschillende voordelen. Het maakt het mogelijk de productie van xenofree iPS-cellen in tegenstelling tot de huidige virale productie protocollen die lichaamsvreemde voorwaarden gebruiken. Het heeft geen duidelijke speciesbarrière en een transgen laadvermogen groter dan virussen. Het maakt een eenvoudige en veilige levering van plasmide transposons door het gebruik van standaard cel transfectie methode die gemakkelijk kan worden uitgevoerd in elk laboratorium voorzien van een Niveau 1 bioveiligheidskast. Transposase re-expressie maakt de verwijdering van PB elementen daaruit generatie footprint-vrije muizen en mensen iPS cellen, zoals aangetoond in diverse cell lijnen 32, 34, 35. Verschillende studies hebben aangetoond dat de transposon systemen vertonen een lagere frequentie in de buurt targeting kanker gerelateerde genen en minder vertekening gerichtheid actieve genen vergeleken met virus gebaseerde vectoren 43, 44, 45, 46, 47. Herprogrammering gebaseerd op transposons afhankelijk van de gekozen leveringswijze, en dit is een beperking vanwege de resistentie of toxiciteit met betrekking tot DNA transfectie methoden (lipofectie, elektroporatie of nucleofectie). Hier hebben we gebruik gemaakt van een niet-liposomale formulering ontworpen om transfecteren DNA die werkte goed met de muis AF cellen. Als andere cellen worden toegepast, zullen de tests nodig zijn om de beste aflevering methode in termen van hoge efficiëntie en lage toxiciteit. Summier, wordt de PB transposon methode beschouwd als veilig te zijn van eend lage kosten, maar met een lagere efficiëntie in vergelijking met SeV vectoren.
Betreffende de procedure muis AF cellen te verkrijgen, is het essentieel om zwangere vrouwelijke muizen beschikken. Als zodanig is het nodig dat er een voldoende aantal paringen (ten minste zes vrouwen met twee vrouwtjes per man).
Meer experimenten kunnen specifiek worden uitgevoerd op menselijke AF cellen om iPS cellen van gezonde en zieke foetussen. Gezien de waaier van aangeboren ziekte die via de prenatale diagnose kan worden gedetecteerd, cellen verkregen uit de AF tijdens de dracht geven de beste bron iPS cellen leiden voor zowel het bestuderen van de ziekte 48 en voor het plannen van een regeneratieve geneeskunde benadering bij weefseldefecten zoals hart of skeletspier 49, 50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
| DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
| Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
| Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
| LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
| Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
| Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
| MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
| MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
| Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
| Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x |
| Penicillin - Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Petri Dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
| PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
| Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
| Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
| αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
| Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
| Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
| 200 μl tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
| Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
| Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
| Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
| Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
| MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |
References
- You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
- Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
- Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
- Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
- Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
- Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
- Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
- Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
- Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
- Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
- Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
- Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
- Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
- Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
- Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
- Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
- Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
- Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
- Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
- Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
- Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
- Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
- Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
- Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
- Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
- Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
- Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
- Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
- Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
- Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
- Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
- Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).
