Introduction
出生前診断は、遺伝性疾患（ すなわち染色体異常、単成または複成/多因子疾患）と先天性奇形（ すなわち先天性横隔膜ヘルニア、嚢胞性肺病変、臍帯ヘルニア、胃壁破裂）を評価するための重要な臨床的ツールです。羊水（AF）細胞（ すなわち 、羊水穿刺およびamnioreduction）または帝王切開1、2妊娠中期の間に定期的にスケジュールされた手順から取得するのは簡単です。出生前または新生児の患者からのAF細胞の利用可能性は、再生医療のためのこのソースを使用する可能性を提供し、いくつかの研究は、AF 3、4、5、6から単離された幹細胞集団を使用して、異なる組織の損傷または疾患を治療する可能性を検討しました、7、8、9、10、11、12。簡単に罹患した患者からのAF細胞を得る可能性は、疾患はしばしば静止している時間ウィンドウ内で、再プログラミングのために、この細胞源を使用するというアイデアに道を開きます。実際、AF細胞由来の人工多能性幹（iPS）細胞は、出産前の適切な患者特有の治療を製造するために、 インビトロでの薬物試験のために、または組織工学的アプローチのための目的の細胞に分化することができます。多くの研究は、既に細胞型13、14、15、16、17 <広範囲に再プログラムと区別されるAF細胞の能力を実証しています/ SUP>、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。
4転写因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）の強制発現を介して、再プログラミングされた体細胞の高橋と山中28によって発見されて以来、進展が再プログラミングの分野で行われています。異なる方法を考慮すると、我々は、ウイルスおよび非ウイルス性のアプローチを区別することができます。最初は、部分的に再プログラムされた細胞株の結果とのリスクの両方で、高効率レトロウイルス導入遺伝子の通常不完全なサイレンシングを有するウイルスベクター（レトロウイルスおよびレンチウイルス）の使用を想定し挿入突然変異29、30、31。 すなわちプラスミド、ベクター、mRNA、タンパク質、トランスポゾン：非ウイルス法は、異なる戦略を使用しています。トランスジェニック配列を含まiPS細胞の誘導は、漏出性導入遺伝子発現および挿入突然変異の潜在的に有害な影響を回避することを目指しています。上記の全ての非ウイルス戦略の中で、のpiggyBac（PB）トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは挿入または切除イベント32を触媒する導入遺伝子およびトランスポザーゼ酵素の一過性発現に隣接する唯一の逆方向末端反復を必要とします。 iPS細胞の生成のための他の方法を介してトランスポゾンを使用する利点は、レトロウイルスベクターの同じ効率を示す非ウイルスベクターアプローチとベクトルフリーiPS細胞を得る可能性があります。これはreprogrのための統合されたトランスポゾンエンコーディングのトレースレス切除することにより可能ですiPS細胞33内のトランスポザーゼの新たな一過性の発現以下の要因をamming。 PBは、異なる細胞型34、35、36、37に効率的であることを考えると、ウイルスベクターに対する臨床的アプローチに適している、および生体異物を使用し、現在のウイルス産生プロトコルに反して異種非含有のiPS細胞の産生を可能にします条件は、このシステムは、マウスAFからiPS細胞を得るために使用されます。
ここでは、マウスのAF細胞（IPS-AF細胞）38からの多能性のiPSクローンの生産を表示するには、すでに発表された研究を、以下の詳細なプロトコルを提案します。
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Protocol
すべての手順は、イタリアの法律に従いました。マウスAFサンプルをGFPと呼ばれるC57BL / 6-Tgの（UBC-GFP）30Scha / Jマウスからの13.5日後交尾（DPC）で妊娠したマウスから採取しました。
1.トランスポゾン生産
注：トランスポゾン発現ベクターは、標準的なクローニング手順を用いて作製しました。マウスAF細胞のトランスフェクション用のプラスミドDNAを、市販のキットを用いて調製しました。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内DH5α細菌の50μlのプラスミドDNAの10 ngのを混ぜます。 20分間氷上でマイクロ遠心チューブをインキュベートします。
- 40秒間42℃でヒートショック。
- 2分間氷上でマイクロ遠心チューブを置きます。
- 予め温めた（37℃）LB培地（LB）培養液250μlのを追加します。 37℃で30分間（300 rpm）を振ります。
- 0.1mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上に各形質転換30μlのスプレッド。プレートを乾燥し、37°C OVで反転インキュベート許可ernight。
- 次の日は、午後に、各形質転換から、無菌の200μlのヒントを使用して、3個のコロニーを選択し、0.1mg / mlのLBアンプに転送します。
- 37℃で一晩（300 rpm）した細菌を振ります。
- プラスミド精製のための市販のキットを使用します。 -20℃でストックのプラスミド。
2.マウス胎児線維芽細胞（MEF）の文化
- 0.1％ゼラチンで6ウェルプレートのコーティング
- フードの下コートプレートは、6つの各ウェルに滅菌0.1％のゼラチンを1ml加えます。ゼラチンを1時間インキュベーター（37℃）で重合してみましょう。
- 過剰を捨てて、1時間、プレートを乾燥させます。
- 室温でプレートを密封して保存するためにパラフィルムを使用してください。
- マイトマイシンCとのMEFの不活化
- 37℃の浴を用いて4×10 6のMEF細胞のバイアルを解凍します。
- MEF媒体とペトリ皿（150ミリメートル）上のフードにMEFをシード。
- 37℃で細胞を培養し、5％CO 2。
- （注意）細胞がコンフルエントであるマイトマイシンC（5 mg / mlで）を追加します。
- 3時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）に入れる細胞。
- マイトマイシンCで洗浄細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回培地を除去します。
- 5分間37℃のインキュベーターに商業トリプシンと場所細胞の2ミリリットルを追加します。後、トリプシン反応を停止するためにメディアをブロックする18ミリリットルを追加します。
- 製造業者のプロトコルに従ってburkerチャンバーを用いて細胞を数えます。
- 5分間、145×gで遠心分離した細胞。上清を捨てます。
- シード0.1％ゼラチンコーティングしたプレート上の不活性化MEFの60,000細胞/ cm 2。
- AFおよび/またはIPS-AF細胞を播種する前に、37℃で24時間、5％CO 2の細胞を養います。
3.マウスのAF細胞の単離
- 時限交配を設定し、膣のPLUをチェック共同住宅の24時間後にGS。
- 13.5 DPCまで観察し、頸椎脱臼を通して妊娠中のダムを生け贄に捧げます。
- 70％エタノールを用いて動物の腹壁を清掃してください。
- はさみを使用して、腹腔内へのアクセスを得るために腹壁の長さを切開正中開腹術を行います。
- 鉗子を使用して子宮を公開します。はさみを使用して子宮を取り出して、滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に移す氷上に置きました。
- 10X倍率でAFを収集するために実体顕微鏡を使用してください。
- 鉗子で子宮を持ち、はさみで子宮壁を取り除きます。胎児膜およびその結果としての羊水漏れへの損傷を避けるように注意してください。
- 滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に胎児を収集し、氷上に置きます。
- きれいな100ミリメートルペトリ皿に細かい点鉗子と場所との1胎児の胎盤をつかみます。
- 細かい点の鉗子を使用してSAC卵黄を削除してください。
- AF収集した後、1％ウシ胎児血清（FBS）を補充した滅菌1×PBSで各胎児を洗い、そして15ml中にAFを含有する円錐管を集めます。
- 5分間、145×gで遠心分離AF。ボンネットの下に上清を除去し、ペレット化したAF細胞を播種します。
4.マウスのAF細胞培養
- マウスAF細胞の播種
- ある日播種の前に、マイトマイシンC処理MEF 0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。
- AF収集後、AF用培地を用いて（約1×10 7細胞を6胎児から得た）分裂不活性化MEFに羊水穿刺から得られた細胞を播種します。
- 37℃で細胞を培養し、5％CO 2、一日おきに培地を変えます。
- 培養7日後、トランス以下の手順でfect AF細胞。
5.トランスフェクション、IPS-AF細胞の生成と文化
注：マウスAF細胞（PB-CAG-rtTAの）トランスポゾンプラスミドトランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒に、逆テトラサイクリントランスアクチベーターで、PB-tetO2-IRES-OKMSトランスポゾンプラスミドでトランスフェクトしました。全てのプラスミドは、教授アンドラーシュナジ33によって提供されました。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに：mPBase0.5μgのとPB-CAG-rtTAの（2μgのトータルDNA）の0.5μgのでPB-tetO2-IRES-OKMS1μgのを混ぜます。
- 無血清培地で100μL（ - DMEMダルベッコ改変イーグル培地）にDNAを希釈します。
- DNAを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに：トランスフェクション試薬の8μL（ 例えば 、FUGENE）（8μLのトランスフェクション剤に2μgの（DNA）のトランスフェクション剤のプラスミドDNAの比で）を追加します。
- 室温で15分間トランスフェクション試薬/ DNA混合物をインキュベートします。
- /ウェル2 mLの最終容量で、マウスのAF細胞と6ウェルプレートにウェル当たりトランスフェクション試薬/ DNA混合物の100μLを滴下添加して、静かに旋回することにより配布します。 24時間放置。
- 翌日は、ドキシサイクリンの1.5μgの/ mLの（各ウェルのメディアの2ミリリットル）を補充した新鮮なのiPS-AF培地で細胞を供給することにより、山中の要因（Oct4の、Klf4の、CMYC、Sox2の）の発現を誘導します。
- 新鮮なDOX含有培地（ポイント5.13までドキシサイクリンを補充した培地中で細胞を維持する）で、通過することなく、毎日の細胞を養います。
- mCherryを発現のために24時間以内に、毎日のコロニー形成（コロニーは、典型的には、トランスフェクション後20〜30日の間に表示される）のための細胞を観察します。
- 一日コロニーピッキングの前に、マイトマイシンC処理したMEF 96ウェル組織培養プレートを準備します。
- ボリュームusinの50μLに、単一のコロニーをピックアップGA 200μLピペット、および個々のウェルで96ウェルプレートに順次転送します。
- 翌日、商業トリプシンを50μl添加することによって、単一細胞にすべてのコロニーを解離し、37℃で5分間インキュベートします。
- コロニーを脱凝集するために上下にピペット。
- ドキシサイクリンを補充した新鮮なのiPS-AF媒体の100μLを充填した96ウェルプレートコーティングされた0.1％ゼラチンで不活性化MEFで新しいウェルに解離したコロニーを含むトリプシンの譲渡50μL。
- 細胞60〜70％コンフルエンスに達すると、24ウェルプレートのウェルに分割。
- コロニーはドキシサイクリンなしの状態でも表示されるかどうかを確認するために2つの井戸、ドキシサイクリンなしのドキシサイクリンとの1および他に2：細胞が60から70パーセントコンフルエンスに達したら、1を分割します。
- IPS-AF媒体に不活性化MEFに、ドキシサイクリンの独立したiPS-AFクローンを、維持し続けます。
- 37℃、5％CO 2、CHで細胞を培養毎日培地をanging。
6.アルカリホスファターゼ染色
- ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、製造業者のプロトコルに従って、アルカリホスファターゼ染色を実行します。
7.免疫蛍光
- ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、不活性化MEF 24ウェルプレートのウェルに15万細胞/ cm 2を播種し、37℃、5％CO 2で48時間、細胞を増殖させます。
- （注意）を室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり300μLを加えることにより細胞を固定してください。
- 細胞を透過性にするために、0.1％NP-40の300μLを加えます。
- 0.1％PBS-Tweenで20300μlで細胞を洗浄。
- 室温で1時間ブロッキング緩衝液（1×PBS中の10％ウマ血清）の300μlのを追加します。
- （1:10のOct4（1:80）、Sox2の（1:80）、Klf4の（1:80）、Nanogの次の一次抗体を使用して、0）およびSSEA1（1:80）。 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清でSSEA1を希釈し、0.3Mグリシン0.1％PBS-Tween-20を含みます。 1×PBS中の10％ウマ血清を持つすべての他の抗体を希釈します。
- 4℃で一晩抗体をインキュベートします。
- 0.1％PBS-Tween-20での300μlですすいでください。
- Alexa594結合ヤギ抗マウスIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ヤギIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ウサギIgGを1×PBS中の10％ウマ血清で希釈した二次抗体を使用し（1：200）、Alexa568結合ヤギ抗マウスIgM（1：200）。室温で2時間インキュベートします。
- 1×PBSですすいでください。
- 1×PBS中：ヘキスト溶液（万1）で染色核。
インビトロ細胞分化8.
- ハンギングドロップ胚様体（EB）を形成するために、分化培地を使用して、ペトリ皿の蓋の上に単一の滴（2,000細胞/ 20μl）を養います。
- 37℃で皿をインキュベート4日間、5％CO 2。
- 分化培地中で3日間懸濁培養100mmの細菌等級皿にEBSを移します。
- 別の14日間（DMEMで1:10に希釈した）基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルプレート中にプレートしたEB。
- T（1：100）、αFP（1：200）とTubb3（1：500）37免疫蛍光分析のために、一次抗体を使用しています。
9. インビボテラトーマ形成
- - / - γC - / -マウスRAG2の後肢の筋肉に1×10 6のiPS-AF細胞を含有する1×100μlのPBSを注入します。
- 6週間細胞注射後に頸椎脱臼を通してマウスを生け贄に捧げます。
- 以下の分析のためのマウスの後肢から、その大きさによって区別、腫瘍塊を除去します。
- クライオスタットを用いて、イソペンタン、凍結腫瘍の7-10μmの厚さの横断切片をカットします。
- ヘマトキシリンANのためのdはエオシン（HE）染色：
- 製造業者のプロトコールに従って、腫瘍組織の組成を評価するためにHEで染色。
- 免疫染色のために：
- 室温で15分間、4％PFAでテラトーマのセクションを修正しました。
- 0.1％トリトンX-100で透過性。
- 以下の抗体を用いてインキュベートする：Tubb3（1：100）、αFP（1：50）およびαSMA（1：100）は、1×PBS中の1％BSAで希釈しました。 1（Tubb3用）37℃で時間または4℃で一晩（他の抗体用）インキュベートします。
- 20分間、100％メタノールを用いてペルオキシダーゼを遮断します。
- 二次抗体抗マウスHRPコンジュゲート（150 1）を用いて37℃で45分間インキュベートします。
- 1×PBSですすいでください。
- 5分間ペルオキシダーゼ（HRP）基板（ 材料表を参照してください）でインキュベートします。
- 5分間水道水ですすいでください。
- 9秒間ヘマトキシリンQSで染色。
- 水道水ですすいでください。 細胞からの10 RNA抽出
- 製造業者の推奨プロトコルに従って、商業用のRNA抽出キットを使用してください。
- サンプルを解凍避けるために、乳棒と乳鉢および液体窒素を使用して奇形腫を均質化。
- 組織25mgを秤量します。
- RNA抽出のための市販試薬1mLのクロロホルムの200μLを追加します。
- 5分間、室温でインキュベートします。
- 13,000×gで遠心分離し、15分間、4°C。
- 新しいチューブにクリアして上清を移します。
- RNAは、製造業者のプロトコルに従って商用のRNA抽出キットを使用して精製しました。
- 逆転写（RT） - ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびオリゴ（dT）アコーために逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成製造業者のプロトコルに丁は、50 ngの/ cDNAのμLを得ました。 10 ngの/μLの濃度でRNaseフリー水を用いてcDNAを希釈します。
- cDNAの1 ngの/μLを利用し、製造業者のプロトコルに従って、DNAポリメラーゼを用いてRT-PCRを行います。
奇形腫から11 RNA抽出
12.逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応分析
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Representative Results
再プログラミングの能力を評価するために、マウスAF細胞をGFPマウスの胎児から採取しました。細胞は、PB-（ドキシサイクリン誘導方法でmCherryを蛍光タンパク質に連結山中因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）を発現円形トランスポゾンプラスミドPB-tetO2-IRES-OKMSでトランスフェクション、およびテトラサイクリントランスを逆にしました。 CAG-のrtTA）トランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒にプラスミド。マウスAF細胞をMEFフィーダー層上のインビトロ拡張の1週間後のOct4、Klf4の、CMYCおよびSox2のトランスフェクトしました。以前39に記載されているように 、外因性因子の発現のために、ドキシサイクリンは、1.5 / mlの濃度で、トランスフェクションの翌日に添加しました。 mCherryをの発現は、トランスフェクションを示すドキシサイクリン加え、24時間後に見えました。 ES様の形態を持つ最初のコロニーは20日DOX後に登場しましたycycline誘導および30日後にトランスフェクションを採取しました。これらのコロニーは、不活性化された線維芽細胞フィーダー層上に播種しました。複製されたウェル33内の独立したドキシサイクリンであることが判明するまで、ピッキングした後、生き残ったクローンは、いくつかの通路のためにドキシサイクリンを添加した培地中で維持しました。
マウスのiPS-AFのクローンが異なるパラメータについて評価した：mCherryを発現、アルカリホスファターゼ染色、多能性マーカーのOct4、Sox2の、Klf4の、Nanog及びSSEA1のタンパク質の発現は、外因性および内因性多能性遺伝子の発現（Oct4の、Klf4の、CMYCおよびSox2の） 、 インビトロ （EBS）およびin vivoで （奇形腫アッセイ）分化。 図1にまとめたように彼らは、彼らの多能性を検証するために評価されたすべての基準を満たしました。
図1： マウスのAF GFP + 細胞 の再プログラミング 。 IPS-AF GFP +細胞の（A）ドキシサイクリン独立したコロニーは、アルカリホスファターゼ（ALP）染色にmCherryを発現するための陰性および陽性でした。スケールバー= 250μmから100μmです。 （B）のOct4、Sox2の、Nanogの、Klf4のとSSEA1を発現する安定ドキシサイクリン非依存のiPS-AF GFP +細胞の代表的な画像を。スケールバー=100μmです。 （C）外因性（ベクトルベースプライマーTg）は内因性（ のOct4、Klf4 の、CMYCおよびSox2の ）遺伝子の発現のためのRT-PCR分析。 β-2-ミクログロブリン （B2M）は、ハウスキーピング遺伝子としました。ドキシサイクリンの（96時間） - （）再プログラム化細胞株は存在（+）または非存在下で増殖させました。 R1 ES細胞を対照として使用しました。 （PCRパネルはベルタンらから変更されている。38 （D）6週間RAG2の後肢へのiPS-AF GFP +細胞の注射の後に得られた奇形腫の総出現- / - γC - / -マウス。 （E）奇形腫の組織学および免疫染色はすべての3つの胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）への細胞分化を確認しました。 αfetoprotein（AFP、内胚葉）は、αsmooth筋アクチン（αSMA、中胚葉）、およびβ3チューブリン（Tubb3、外胚葉）は、腫瘍塊で検出されました。スケールバー=100μmです。 （F）のEB及びテラトーマ（TE）のRT-PCR分析。 C +、ポジティブコントロール。 NTC、非テンプレートコントロール。 ビメンチン （Vimの 、中胚葉）、αfetoprotein（AFP、内胚葉）及びβ3チューブリン （Tubb3、外胚葉）。 （PCRパネルは、基準38から変更されています）。 番目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図です。
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Discussion
多能性の誘導を得るために選択された方法は、長期移植に関して細胞臨床的安全性に関連します。今日では、再プログラミングに適したいくつかの方法があります。非組込み方法のうち、センダイウイルス（センダイウイルス）ベクターは、感染した細胞40の核内に統合することなく、タンパク質を大量に生産することができ、iPS細胞を得るための戦略であり得るRNAウイルスです。センダイウイルスベクターは、翻訳グレードiPS細胞の生成のための魅力的な候補かもしれないが、それはいくつかの欠点を提示します。ウイルスレプリカは、トランスジェニック配列の性質に敏感です。センダイウイルスベクターは、構成的に複製するので、別の戦略は、この態様41,42を改善するために使用される場合であっても、宿主細胞から排除することは困難です。このようなレベル2の生物学的安全キャビネットのように、特別な処理を必要とします。そこで私唯一の商業ベンダーが利用可能です。再プログラミングのための臨床グレードのセンダイウイルスの現在不足しているとiPS細胞の生産の高コストがあります。
このような側面のおかげで、トランスポゾンシステムは、センダイウイルスベクターに関して、より良いアプローチと考えることができ、ここで私たちは、このシステムは、様々な利点とマウスAF細胞を再プログラミングするのに適した方法であることを規定しています。これは、生体異物の条件を使用して、現在のウイルス産生プロトコルに反しxenofree iPS細胞を製造することができます。これは明らかな種の壁を持たないウイルスよりも大きな導入遺伝子カーゴ容量を有します。これは、簡単にレベル1の生物学的安全キャビネットを装備したすべての実験室で実施することができる標準的な細胞トランスフェクション法の使用により、プラスミドトランスポゾンの簡単かつ安全な送達を可能にします。トランスポザーゼ再発現は、様々なCEに示されているように、足跡のないマウスおよびヒトiPS細胞の結果的生成とPB要素の除去を可能にしますLL線32、34、35。別の研究では、トランスポゾンシステムは、癌関連遺伝子およびウイルスベースのベクター43、44、45、46、47と比較して活性遺伝子を標的にあまりバイアス近く標的に低い周波数を表示することを示しました。トランスポゾンに基づくリプログラミングは、選択された配送方法に依存しており、これが原因で、DNAトランスフェクション法（リポフェクション、エレクトロポレーションまたはヌクレオ）に関連した抵抗性または毒性に制限です。ここでは、マウスのAF細胞とよく働いたDNAをトランスフェクトするために設計された非リポソーム製剤を使用していました。他のセルが使用される場合は、試験は高効率かつ低毒性の点で最良の配信方法を使用することが必要であろう。即決、PBトランスポゾン方法は、安全ANであると考えられていますD低コストが、センダイウイルスベクターを用いて比較して低い効率で。
マウスAF細胞を得るための手順については、利用可能な妊娠中の雌マウスを持っていることが重要です。このように、交配の適切な数（オスあたり2人の女性との少なくとも6人の女性）を設定する必要があります。
より多くの実験は、健康と病気の胎児からiPS細胞を生成するために、ヒトAF細胞に特異的に行うことができます。出生前診断によって検出することができる先天性疾患の広い範囲を考慮すると、妊娠中にAFから得られた細胞は、病気48を検討し、また、組織欠損の場合には再生医療のアプローチを計画するための両方のためのiPS細胞を誘導するための最良のソースを表します心臓や骨格筋49、50など。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
| DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
| Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
| Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
| LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
| Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
| Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
| MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
| MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
| Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
| Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x |
| Penicillin - Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Petri Dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
| PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
| Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
| Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
| αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
| Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
| Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
| 200 μl tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
| Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
| Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
| Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
| Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
| MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |
References
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