Introduction
Fosterdiagnostik är ett viktigt kliniskt verktyg för att utvärdera genetiska sjukdomar (dvs kromosomavvikelser, monogena eller polygenetisk / multifaktoriella sjukdomar) och medfödda missbildningar (dvs. medfödd diafragmabråck, cystisk lunglesioner, exomphalos, gastroschis). Fostervatten (AF) celler är enkelt att få från rutinmässigt schemalagda förfaranden under andra trimestern av graviditeten (dvs. fostervattenprov och amnioreduction) eller kejsarsnitt 1, 2. Tillgängligheten av AF-celler från prenatal eller neonatala patienter ger möjligheten att använda denna källa för regenerativ medicin, och flera forskare undersökt möjligheten att behandla olika vävnads skador eller sjukdomar med användning av en stamcellspopulation isolerades från AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Möjligheten att enkelt få AF celler från sjuka patienter, i ett tidsfönster där sjukdomen är ofta stillastående, öppnar vägen till idén att använda denna cellkälla för omprogrammering ändamål. I själva verket kan inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler från AF-celler differentieras i cellerna av intresse för in vitro-drogtestning eller för vävnadstekniska metoder, i syfte att förbereda en lämplig patientspecifik behandling före förlossningen. Många studier har redan visat förmågan hos AF celler som skall omprogrammeras och differentieras till ett brett spektrum av celltyper 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.
Sedan upptäckten av Takahashi och Yamanaka 28 omprogrammeras somatiska celler genom tvångs uttryck av fyra transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, cMyc och Klf4) har framsteg gjorts när det gäller omprogrammering. Med tanke på de olika metoder, kan vi skilja mellan virala och icke-virala metoder. Det första förväntar sig att användningen av virala vektorer (retrovirus och lentivirus), som har hög effektivitet men vanligtvis ofullständigt tystande av den retrovirala transgenen, med både en följd av en delvis omprogrammeras cellinje och risken förinsättningsmutagenes 29, 30, 31. Den icke-virala metod använder olika strategier: dvs plasmider, vektorer, mRNA, protein, transposoner. Härledningen av iPS-celler fria från transgena sekvenser syftar till att kringgå de potentiellt skadliga effekterna av läckande transgenexpression och insertionsmutationer. Bland alla de ovan nämnda icke-virala strategier kräver piggyBac (PB) transposon / transposas systemet endast de inverterade terminala upprepningar som flankerar en transgen och transient uttryck av nämnda transposas enzym att katalysera inser eller excision händelser 32. Fördelen med att använda transposoner jämfört med andra metoder för IPS cell generation är möjligheten att erhålla vektorfria iPS-celler med en icke-viral vektor tillvägagångssätt som visar samma effektivitet av retrovirala vektorer. Detta är möjligt genom spårlösa excision av den integrerade transposonen kodning för reprogrAmming faktorer efter en ny transient uttryck av transposaset i iPS-celler 33. Med tanke på att PB är effektiv i olika celltyper 34, 35, 36, 37, är mer lämplig för ett kliniskt synsätt med avseende på virala vektorer, och möjliggör för framställningen av xeno-fria iPS-celler i motsats till nuvarande virusproduktionsprotokoll som använder xenobiotisk betingelser, är detta system användas för att erhålla iPS-celler från murin AF.
Här föreslår vi ett detaljerat protokoll följer redan publicerat arbete som visar framställningen av pluripotenta iPS kloner från mus AF-celler (iPS-AF-celler) 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden var i enlighet med italiensk lag. Murin AF prover skördades från dräktiga möss på 13,5 dagar efter coitum (DPC) från C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J-möss som kallas GFP.
1. Transposon Produktion
OBS: transposon expressionsvektorer genererades med användning av standardkloningsförfaranden. Plasmid-DNA för mus AF celler transfektion framställdes med hjälp av kommersiella kit.
- Blanda 10 ng av plasmid-DNA med 50 | il av DH5a-bakterier i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkubera mikrocentrifugrör på is under 20 min.
- Värmechock vid 42 ° C under 40 sek.
- Placera mikrocentrifugrör på is under 2 min.
- Lägg 250 pl förvärmd (37 ° C) lysogeni buljong (LB) buljong. Skaka (300 rpm) vid 37 ° C under 30 min.
- Sprid 30 | il av varje transformation på LB-plattor med 0,1 mg / ml ampicillin. Tillåta plattorna torka och inkubera inverteras vid 37 ° C overnight.
- Nästa dag, på eftermiddagen, plocka 3 kolonier, med hjälp av sterila 200 pl tips från varje omvandling och överföring på 0,1 mg / ml LB amp.
- Skaka (300 rpm) bakterier över natten vid 37 ° C.
- För plasmidrening använda kommersiella kit. Aktie plasmider vid -20 ° C.
2. Mouse embryonala fibroblast (MEF) Kultur
- Beläggning av de sex-brunnars plattor med 0,1% gelatin
- Coat plattor under huven tillsätta 1 ml steril 0,1% gelatin till var och en av de sex brunnar. Låt gelatinet polymerisera på inkubatorn (37 ° C) under 1 timme.
- Kassera överskott, och torka plattorna under 1 timme.
- Använda parafilm för att täta och lagra plattorna vid rumstemperatur.
- Inaktivering av MEF med Mitomycin C
- Tina en flaska med 4 x 10 6 MEF celler med användning av ett 37 ° C bad.
- Utsäde MEF i huvan i en petriskål (150 mm) med MEF medium.
- Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
- (OBS) Lägg mitomycin C (5 mg / ml) när cellerna är konfluenta.
- Placera cellerna i en inkubator (37 ° C och 5% CO2) under 3 h.
- Avlägsna medium med mitomycin C. Tvätta cellerna tre gånger med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 2 ml av den kommersiella trypsin och placera cellerna i 37 ° C inkubator under 5 min. Efter, tillsätt 18 ml blockeringsmedium för att stoppa trypsin reaktionen.
- Räkna cellerna med användning av en Burker-kammare enligt tillverkarens protokoll.
- Centrifugera cellerna vid 145 xg under 5 min. Kassera supernatanten.
- Seed 60.000 celler / cm2 inaktiverat MEF på 0,1% gelatinbelagda plattor.
- Odla cellerna under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2, före sådd AF och / eller iPS-AF-celler.
3. Mus AF cellisolering
- Ställ in tids parningar och kontrollera vaginal plugs efter 24 timmars co-bostäder.
- Observera tills 13,5 DPC och offra gravid dammen genom halsdislokation.
- Rengöra bukväggen hos djuret med användning av 70% etanol.
- Med användning av en sax, utför en mittlinjen laparotomi incising längden av bukväggen för att få tillträde in i bukhålan.
- Exponera livmodern med hjälp av pincett. Ta bort livmodern med sax och överföring till en 100 mm petriskål fylld med steril 1x PBS placerades på is.
- Använd en stereomikroskop för att samla AF vid 10X förstoring.
- Håll livmodern med pincett och ta bort livmoderväggen med en sax. Var noga med att undvika skador på fosterhinnorna och därmed fostervatten läckage.
- Samla foster i en 100 mm petriskål fylld med steril 1x PBS och placera på is.
- Ta tag i moderkakan hos ett foster med en fin spets pincett och lägg i en ren 100 mm petriskål.
- Ta gulesäcken med fin punkt pincett.
- Efter AF samling, tvätta varje foster med sterilt 1x PBS kompletterad med 1% fetalt bovint serum (FBS) och samla in 15 ml koniskt rör innehållande AF.
- Centrifugera AF vid 145 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten under huven och utsäde pellet AF-celler.
4. Mus AF Cell Culture
- Sådd av Mouse AF celler
- En dag före sådd, förbereda en 0,1% gelatin-belagda 6-brunnar med mitomycin C-behandlade MEF.
- Efter AF samling, ympa celler som erhållits från ett fostervattensprov (cirka 1 x 10 7 celler som erhållits från 6 foster) på mitotiskt inaktiverade MEF med AF odlingsmedium.
- Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2, ändra mediet varannan dag.
- Efter 7 dagars odling, transfect AF-celler enligt det förfarande som beskrivs nedan.
5. Transfektion, iPS-AF Cell Generation och kultur
OBS: Mus AF-celler transfekterades med PB-tetO2-IRES-OKMS transposon-plasmid, i samverkan med ett transposas expressionsplasmid (mPBase) och med den omvända tetracyklin transaktivator (PB-CAG-rtTA) transposon-plasmid. Alla plasmider tillhandahölls av professor Andras Nagy 33.
- Blanda 1 pg av PB-tetO2-IRES-OKMS med 0,5 ^ g av mPBase och 0,5 pg av PB-CAG-rtTA (Total DNA: 2 | j, g) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Späd DNA till 100 | il med serumfritt medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium - DMEM).
- Lägga 8 mikroliter av transfektionsreagens (t.ex. Fugene) (i förhållandet av plasmid-DNA: transfektion agent för 2 | j, g (DNA) till 8 mikroliter transfektion agent) i 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande DNA.
- Inkubera transfektionsreagens / DNA-blandningen under 15 min vid rumstemperatur.
- Droppvis tillsattes 100 mikroliter av transfektionsreagens / DNA-blandningen per brunn till en 6-brunnsplatta med mus AF-celler och distribuera av försiktig rotering, med en slutlig volym av 2 ml / brunn. Låt stå i 24 timmar.
- Dagen efter, inducera uttrycket av Yamanaka s faktorer (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) genom att mata cellerna med färska iPS-AF-medium kompletterat med 1,5 | ag / ml doxycyklin (2 ml medium för varje brunn).
- Feed celler varje dag, utan passage, med färsk DOX-innehållande medium (upprätthålla celler i media kompletterade med doxycyklin tills punkt 5.13).
- Observera celler inom 24 timmar för mCherry uttryck och dagligen för kolonibildning (kolonier visas normalt mellan 20 och 30 dagar efter transfektion).
- En dag före koloni plockning, förbereda en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta med mitomycin C-behandlade MEF.
- Plocka enskilda kolonier i 50 | il volym usinga 200 mikroliter pipett och överföra dem sekventiellt in i en 96-brunnars platta i enskilda brunnar.
- Dagen efter, dissociera varje koloni in i enstaka celler genom tillsats av 50 | il av den kommersiella trypsin och inkubera under 5 min vid 37 ° C.
- Pipettera upp och ner för att disaggregera kolonin.
- Överföring 50 mikroliter av trypsin innehållande det dissocierade kolonin in i en ny brunn med inaktiverat MEF på en 0,1% gelatin belagt 96 väl plattan fylldes med 100 | il av färsk iPS-AF-medium kompletterat med doxycyklin.
- När cellerna når 60-70% konfluens, delas upp i en brunn av en 24-brunnars platta.
- När cellerna når 60-70% sammanflödet, split 1: 2 till två brunnar, en med doxycyklin och den andra utan doxycyklin, för att kontrollera om kolonier visas också i det skick utan doxycyklin.
- Fortsätta att upprätthålla iPS-AF-kloner, doxycyklin oberoende, om inaktiverat MEF i IPS-AF-medium.
- Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2, changing mediet dagligen.
6. Alkaline Phosphatase Färgning
- Utföra alkaliskt fosfatas-färgning enligt tillverkarens protokoll närhelst det är uppkomsten av doxycyklin oberoende iPS-AF-celler.
7. Immunofluorescens
- Närhelst det är uppkomsten av doxycyklin oberoende iPS-AF-celler, utsäde 150.000 celler / cm 2 på en brunn i en 24-brunnsplatta med inaktiverat MEF, och odla cellerna under 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- (OBS) Fixera cellerna genom tillsats av 300 | il per brunn av 4% paraformaldehyd (PFA) under 15 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 300 | il 0,1% NP-40 för att permeabilisera celler.
- Skölj celler med 300 ul av 0,1% PBS-Tween 20.
- Tillsätt 300 | il av blockeringsbuffert (10% hästserum i 1 x PBS) under 1 h vid rumstemperatur.
- Använd följande primära antikroppar: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), nanog (01:100) och SSEA1 (1:80). Späd SSEA1 med 1% bovint serumalbumin (BSA), 10% normalt getserum, 0,3 M glycin i 0,1% PBS-Tween-20. Späd alla andra antikroppar med 10% hästserum i 1x PBS.
- Inkubera antikroppar över natten vid 4 ° C.
- Skölj med 300 ul av 0,1% PBS-Tween-20.
- Använda de sekundära antikropparna utspädda i 10% hästserum i 1 x PBS: Alexa594-konjugerad get-anti-mus-IgG (1: 200), Alexa594-konjugerad kyckling anti-get-IgG (1: 200), Alexa594-konjugerad kyckling-anti-kanin-IgG (1: 200), Alexa568-konjugerad get-anti-mus-IgM (1: 200). Inkubera i 2 h vid rumstemperatur.
- Skölj med 1x PBS.
- Stain kärnor med Hoechst lösning (1: 10.000) i 1x PBS.
8. In Vitro Cell Differentiation
- För att bilda droppe embryoidkroppar (EBS), odla enstaka droppar (2000 celler / 20 ^) på locket på petriskålar med hjälp av differentieringsmedium.
- Inkubera skålarna vid 37 ° Coch 5% CO2 i 4 dagar.
- Överföra EB i 100 mm bakteriell kvalitet rätter i suspensionsodling under 3 dagar i differentieringsmediet.
- Plate EB i 24-brunnsplattor belagda med basalmembranmatris (utspädd 1:10 i DMEM) i ytterligare 14 dagar.
- För immunofluorescens analyser använda primära antikroppar: T (1: 100), αfp (1: 200) och Tubb3 (1: 500) 37.
9. In vivo Teratom Formation
- Injicera 100 pl 1 x PBS innehållande 1 x 10 6 iPS-AF-celler i muskeln av bakdelen av Rag2 - / - γc - / - möss.
- Offra möss genom cervikal dislokation 6 veckor efter cellinjektion.
- Ta bort tumörmassor, utmärker sig genom sin storlek, från bakdelen av mössen för följande analyser.
- Skär 7-10 pm tjocka tvärsektioner av isopentan frysta tumör med hjälp av en kryostat.
- För Haematoxylin end Eosin (HE) Fläck:
- Färgas med HE för att utvärdera tumörvävnadssammansättning, genom att följa tillverkarens protokoll.
- För immunoperoxidas Stain:
- Fixa teratoma sektioner med 4% PFA under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Permeabilisering med 0,1% Triton X-100.
- Inkubera med följande antikroppar: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) och αSMA (1: 100) utspädd i 1% BSA i 1 x PBS. Inkubera under 1 h vid 37 ° C (för Tubb3) eller över natten vid 4 ° C (för de andra antikropparna).
- Block peroxidas med användning av 100% metanol under 20 min.
- Inkubera i 45 min vid 37 ° C med sekundär antikropp-anti-mus-HRP-konjugerad (1: 150).
- Skölj med 1x PBS.
- Inkubera med peroxidassubstrat (HRP) (Se Material tabell) under 5 min.
- Skölj med kranvatten under 5 min.
- Stain med hematoxylin QS för 9 sekunder.
- Skölj med kranvatten. 10. RNA-extraktion från celler
- Använd en kommersiell RNA-extraktion kit enligt tillverkarens rekommenderade protokoll.
- Homogenisera teratom med användning av en mortelstöt och mortel och flytande kväve för att undvika att tina provet.
- Väger 25 mg vävnad.
- Tillsätt 1 ml av kommersiellt reagens för RNA-extraktion och 200 mikroliter av kloroform.
- Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Centrifugera vid 13000 xg och 4 ° C under 15 min.
- Överför rensas supernatanten till ett nytt rör.
- För att rena RNA använda ett kommersiellt RNA-extraktion kit enligt tillverkarens protokoll.
- Syntetisera den första cDNA-strängen med användning av ett omvänt transkriptas för omvänd transkription (RT) -polymerase kedjereaktion (PCR) och oligo (dT) enligding tillverkarens protokoll, för att erhålla 50 ng / mikroliter av cDNA. Späd cDNA med RNas-fritt vatten till en koncentration av 10 ng / | il.
- Utföra RT-PCR med användning av DNA-polymeras enligt tillverkarens protokoll, med utnyttjande av en ng / mikroliter av cDNA.
11. RNA-extraktion från Teratom
12. Omvänd transkription-polymeraskedjereaktion Analys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera kapaciteten av omprogrammering, var mus AF-celler som samlats in från foster av GFP möss. Celler transfekterades med den cirkulära transposon plasmiden PB-tetO2-IRES-OKMS, som uttrycker de Yamanaka faktorer (Oct4, Sox2, cMyc och Klf4) kopplade till mCherry fluorescerande proteinet i ett doxycyklin-inducerbart sätt, och omvänd tetracyklin transaktivator (PB- CAG-rtTA) plasmider tillsammans med transposaset expressionsplasmiden (mPBase). Mus-AF-celler transfekterades med Oct4, Klf4, cMyc och Sox2 efter en vecka av in vitro-expansion under ett MEF matarskikt. För expression av de exogena faktorer, till doxycyklin sattes dagen efter transfektion vid en koncentration av 1,5 | ig / ml, såsom tidigare beskrivits 39. Uttrycket av mCherry var synlig efter 24 timmar från doxycyklin Dessutom indikerar transfektion. De första kolonier med en ES-liknande morfologi visades 20 dagar efter doxycycline induktion och plockades 30 dagar efter transfektion. Dessa kolonier ympades på inaktiverade fibroblaster matarskikt. Efter plockning, var överlevande kloner hålls i medium kompletterat med doxycyklin för vissa passager tills visat sig vara doxycyklin oberoende i replikerade brunnar 33.
Mus iPS-AF-kloner utvärderades för olika parametrar: mCherry uttryck, alkaliskt fosfatas färgning, proteinuttryck av pluripotens markörer Oct4, Sox2, Klf4, nanog och SSEA1, uttryck av exogena och endogena pluripotens gener (Oct4, Klf4, cMyc och Sox2) , in vitro (EBS) och in vivo (teratom analys) differentieringen. De uppfyllde alla kriterier utvärderas för att bekräfta deras pluripotens, som sammanfattas i Figur 1.
Figur 1: Omprogrammering av mus AF GFP + celler. (A) doxycyklin oberoende kolonier av iPS-AF GFP + celler var negativa för uttryck av mCherry och positiva för alkaliskt fosfatas (ALP) färgning. Skalstrecken = 250 | j, m och 100 | im. (B) Representativa bilder av stabila doxycyklin oberoende iPS-AF GFP + celler uttrycker Oct4, Sox2, NANOG, Klf4 och SSEA1. Skalstreck = 100 | j, m. (C) RT-PCR-analys för uttryck av exogena (vektorbaserade grundfärger, Tg) och endogena (Oct4, Klf4, cMyc och Sox2) gener. Beta-2-mikroglobulin (B2M) ansågs vara en housekeeping-gen. Omprogrammerade cellinjer odlades i närvaro (+) eller frånvaro (-) (96 tim) av doxycyklin. R1-ES-celler användes som kontroll. (PCR panel har ändrats från Bertin et al. 38 (D) Brutto utseende teratoma erhölls 6 veckor efter injektionen av iPS-AF GFP + celler i bakbenen av Rag2 - / - γc - / - mus. (E) Teratom histologi och immunfärgning bekräftade celldifferentiering i alla tre bakterieskikten (ektoderm, mesoderm och endoderm). αfetoprotein (AFP, endoderm), var αsmooth muskel aktin (αSMA, mesoderm), och β3 tubulin (Tubb3, ektoderm) påvisas i tumörmassor. Skalstreck = 100 | j, m. (F) RT-PCR-analys av EBS och teratom (Te). C +, positiv kontroll; NTC, icke-mall-kontroll. Vimentin (Vim, mesoderm), αfetoprotein (AFP, endoderm) och β3 tubulin (Tubb3, ektoderm). (PCR panel har ändrats från referens 38). Klicka här för att se en större version av thär figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som valts för att erhålla induktion av pluripotens är relevant för cell klinisk säkerhet med avseende på lång sikt transplantation. Numera finns det flera metoder som är lämpliga för omprogrammering. Bland de icke-integrerande metoder är Sendai virus (SeV) vektor ett RNA-virus som kan producera stora mängder protein utan integreras i kärnan av de infekterade cellerna 40 och kan vara en strategi för att få iPS-celler. SeV-vektorer kan vara en attraktiv kandidat för alstring av translations-grade iPS-celler, men den uppvisar vissa brister. Det virala replikas är känslig för arten av de transgena sekvenserna. Eftersom SeV-vektorer konstitutivt replikera, kan de vara svåra att eliminera från värdcellerna, även om olika strategier används för att förbättra denna aspekt 41, 42. Det kräver speciell hantering, såsom en nivå två biologiskt säkerhetsskåp. Där jagär bara en kommersiell leverantör finns. Det finns en nuvarande bristen på klinisk kvalitet SeV för omprogrammering och det finns höga kostnaderna för iPS kroppar.
På grund av dessa aspekter kan transposon systemet anses vara en bättre metod i förhållande till Sev vektorer och här etablera vi att detta system är en lämplig metod för omprogrammering mus AF celler med olika fördelar. Det tillåter framställning av xenofree iPS-celler i motsats till nuvarande virusproduktionsprotokoll som använder xenobiotiska förhållanden. Det har ingen uppenbar artbarriären och har en transgen lastkapacitet större än virus. Det möjliggör enkel och säker leverans av plasmiden transposoner genom användning av standard cell transfektion metod som lätt kan utföras i varje laboratorium utrustat med en nivå en biologiskt säkerhetsskåp. Transposas åter uttryck medger avlägsnande av PB element med åtföljande generering av fotavtryck fria mus och mänskliga iPS-celler, som visas i olika cella ledningarna 32, 34, 35. Olika studier visade att transposonet system uppvisar en lägre frekvens i inriktning nära cancerrelaterade gener och mindre bias i inriktning aktiva gener jämfört med virala-baserade vektorer 43, 44, 45, 46, 47. Omprogrammering baserat på transposoner beror på den valda leveransmetoden, och detta är en begränsning på grund av att motståndet eller toxicitet relaterad till DNA-transfektion metoder (lipofektion, elektroporation eller nucleofection). Här har vi använt en icke-liposomal formulering som syftar till att transfektera DNA som fungerade bra med mus AF celler. Om andra celler används, kommer tester vara nödvändigt att använda den bästa leveransmetod i form av hög effektivitet och låg toxicitet. Summariskt är PB transposon metoden anses vara säkra end låg kostnad, men med en lägre effektivitet jämfört med SeV-vektorer.
När det gäller förfarandet för att få musen AF celler, är det viktigt att ha gravid honmöss tillgängliga. Som sådan, är det nödvändigt att inrätta ett tillräckligt antal parningar (minst sex honor med två honor per hane).
Fler experiment kunde utföras specifikt på mänskliga AF celler för att producera iPS-celler från friska och sjuka foster. Med tanke på det breda spektrum av medfödda sjukdomar som kan detekteras genom den prenatal diagnos, celler erhållna från AF under dräktigheten representerar den bästa källan för att härleda iPS-celler för både studera sjukdomen 48 och även för planering av en regenerativ medicin tillvägagångssätt i fall av vävnadsdefekter såsom hjärt- eller skelettmuskel 49, 50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
| DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
| Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
| Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
| LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
| Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
| Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
| MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
| MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
| Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
| Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x |
| Penicillin - Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Petri Dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
| PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
| Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
| Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
| αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
| Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
| Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
| 200 μl tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
| Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
| Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
| Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
| Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
| MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |
References
- You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
- Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
- Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
- Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
- Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
- Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
- Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
- Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
- Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
- Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
- Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
- Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
- Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
- Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
- Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
- Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
- Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
- Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
- Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
- Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
- Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
- Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
- Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
- Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
- Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
- Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
- Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
- Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
- Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
- Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
- Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
- Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).
