Introduction
El diagnóstico prenatal es una importante herramienta clínica para evaluar enfermedades genéticas (es decir, aberraciones cromosómicas, enfermedades monogénicas o poligenéticos / multifactorial) y malformaciones congénitas (hernia diafragmática congénita es decir, lesiones pulmonares quísticas, onfalocele, gastrosquisis). El líquido amniótico (AF) las células son fáciles de obtener de forma rutinaria los procedimientos programados durante el segundo trimestre del embarazo (es decir, la amniocentesis y amniorreducción) o cesáreas 1, 2. La disponibilidad de las células AF de pacientes prenatales o neonatales ofrece la posibilidad de utilizar esta fuente para la medicina regenerativa, y varios investigadores investigó la posibilidad de tratar diferentes daños de tejidos o enfermedades utilizando una población de células madre aisladas de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La posibilidad de obtener fácilmente células AF de pacientes enfermos, en una ventana de tiempo en el que la enfermedad es a menudo estacionario, abre el camino a la idea de utilizar esta fuente de células para los propósitos de reprogramación. De hecho, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) derivadas de células AF podrían diferenciarse en las células de interés para las pruebas de fármacos in vitro o para los enfoques de ingeniería de tejidos, con el fin de preparar una terapia adecuada específica del paciente antes del parto. Muchos estudios ya han demostrado la capacidad de las células AF para ser reprogramado y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.
Desde el descubrimiento por Takahashi y Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas a través de la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y CMYC), se han hecho progresos en el campo de la reprogramación. Teniendo en cuenta los diferentes métodos, podemos distinguir entre los enfoques virales y no virales. La primera espera que el uso de vectores virales (retrovirus y lentivirus), que tienen una alta eficiencia, pero silenciamiento generalmente incompleta del transgén retroviral, tanto con la consecuencia de una línea de células parcialmente reprogramado y el riesgo demutagénesis por inserción 29, 30, 31. El método no viral utiliza diferentes estrategias: es decir, plásmidos, vectores, ARNm, proteínas, transposones. La derivación de células iPS libres de secuencias transgénicas pretende eludir los efectos potencialmente nocivos de la expresión del transgen con fugas y la mutagénesis por inserción. Entre todas las estrategias no virales mencionados anteriormente, el sistema de transposón / transposasa PiggyBac (PB) requiere sólo las repeticiones terminales invertidas que flanquean un transgén y la expresión transitoria de la enzima transposasa para catalizar eventos de inserción o de escisión 32. La ventaja en el uso de transposones sobre otros métodos para la generación de células iPS es la posibilidad de obtener células iPS libre de vectores con un enfoque de vector no viral que muestra la misma eficacia de los vectores retrovirales. Esto es posible mediante escisión trace-menos de la codificación transposón integrado para la reprogramming siguientes factores de una nueva expresión transitoria de la transposasa en las células iPS 33. Dado que PB es eficiente en diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, es más adecuado para un enfoque clínico con respecto a los vectores virales, y permite la producción de células iPS sin xeno contrario a protocolos de producción virales actuales que utilizan xenobiótico condiciones, este sistema se utiliza para obtener células iPS a partir murino AF.
Aquí proponemos un protocolo detallado siguientes trabajos ya publicados para mostrar la producción de iPS a partir de células pluripotentes clones AF de ratón (células iPS-AF) 38.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la ley italiana. muestras murino AF fueron cosechadas de los ratones gestantes en 13,5 días postcoital (DPC) de ratones C57BL / 6 ratones Tg (UBC-GFP) 30Scha / J llamada GFP.
Producción 1. transposón
NOTA: los vectores de expresión de transposones se generaron utilizando procedimientos de clonación estándar. El ADN plásmido para ratón AF células transfección se preparó usando kits comerciales.
- Mezclar 10 ng de ADN de plásmido con 50 l de bacterias DH5a en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar el tubo de microcentrífuga en hielo durante 20 min.
- choque térmico a 42 ° C durante 40 segundos.
- Coloque el tubo de microcentrífuga en hielo durante 2 min.
- Añadir 250 l de caldo de caldo de lysogeny (LB) precalentado (37 ° C). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min.
- Spread 30 l de cada transformación sobre placas LB con 0,1 mg / ml de ampicilina. Permita que las placas se sequen y se incuban invertidas a 37 ° C overnight.
- Al día siguiente, por la tarde, Pick 3 colonias, utilizando puntas estériles de 200 l, de cada transformación y transferencia a 0,1 mg / ml de LB amp.
- Agitar bacterias (300 rpm) durante la noche a 37 ° C.
- Para la purificación de plásmido utilizar kits comerciales. plásmidos de archivo a -20 ° C.
2. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Cultura
- El recubrimiento de las placas de 6 pocillos con 0,1% de gelatina
- recubrir placas bajo el capó adición de 1 ml de gelatina estéril al 0,1% a cada uno de los seis pozos. Deje que la gelatina se polimeriza en la incubadora (37 ° C) durante 1 hora.
- Desechar el exceso, y secar las placas durante 1 hora.
- Use parafina para sellar y las placas, almacenarlas a temperatura ambiente.
- La inactivación de MEF con mitomicina C
- Descongelar un vial de 4 x 10 6 células MEF utilizando un baño de 37 ° C.
- Semillas MEF en la campana en una placa de Petri (150 mm) con medio de MEF.
- Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO2.
- (Precaución) Añadir mitomicina C (5 mg / ml) cuando las células son confluentes.
- Células de lugar en una incubadora (37 ° C y 5% de CO2) durante 3 h.
- Retire medio con células mitomicina C. Lavar tres veces con solución salina tampón fosfato 1x (PBS).
- Añadir 2 ml de las células con tripsina y local comercial en el incubador a 37ºC durante 5 min. Después, añadir 18 ml de medio de bloqueo para detener la reacción con tripsina.
- Contar las células utilizando una cámara Burker de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- centrifugar las células a 145 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante.
- Seed 60.000 células / cm 2 de inactivada MEF sobre placas recubiertas de gelatina 0,1%.
- Cultivar las células durante 24 horas a 37 ° C y CO 2 al 5%, antes de la siembra AF y / o células iPS-AF.
3. aislamiento de células de ratón AF
- Configurar y comprobar los apareamientos programados PLU vaginalgs después de 24 h de co-vivienda.
- Observe hasta 13,5 dpc y sacrificar presa embarazada a través de la dislocación cervical.
- Limpiar la pared abdominal del animal usando 70% de etanol.
- Con unas tijeras, realizar una incisión de laparotomía media la longitud de la pared abdominal para acceder a la cavidad abdominal.
- Exponer el útero con unas pinzas. Quitar el útero utilizando tijeras y transferencia en una placa de Petri de 100 mm lleno de PBS estéril 1x colocó en hielo.
- Utilizar un microscopio estereoscópico para recoger el AF a un aumento de 10X.
- Sostener el útero con una pinza y quitar la pared uterina con unas tijeras. Tenga cuidado para evitar cualquier daño a las membranas fetales y la consiguiente pérdida de líquido amniótico.
- Recoger los fetos en una placa de Petri de 100 mm estéril lleno de 1x PBS y colocar en hielo.
- Agarre la placenta de un feto con una pinza de punta fina y colocar en un recipiente limpio 100 mm placa de Petri.
- Retire el saco vitelino con unas pinzas de punta fina.
- Después de la recogida AF, lavar cada feto con estéril 1x PBS suplementado con suero de 1% de bovino fetal (FBS) y recoger en los 15 ml tubo cónico que contiene el AF.
- Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante bajo el capó y sembrar las células sedimentadas AF.
4. ratón AF cultivo celular
- Siembra de células de ratón AF
- Un día antes de la siembra, preparar una placa de 6 pocillos recubierta con gelatina 0,1% con MEF tratado con mitomicina C.
- Después de la recogida de AF, sembrar las células obtenidas de una amniocentesis (alrededor de 1 x 10 7 células obtenidas de fetos 6) sobre el mitóticamente inactivados MEF utilizando medio de cultivo AF.
- Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, cambiando el medio cada dos días.
- Después de 7 días de cultivo, transfect células AF siguiendo el procedimiento descrito a continuación.
5. La transfección, la generación de células iPS-AF y Cultura
NOTA: células de ratón AF se transfectaron con el plásmido de transposón PB-tetO2-IRES-OKMS, en conjunción con un plásmido de expresión de la transposasa (mPBase) y con el transactivador de tetraciclina inversa plásmido transposón (PB-CAG-rtTA). Todos los plásmidos fueron proporcionados por el profesor Andras Nagy 33.
- Mezclar 1 g de PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 g de mPBase y 0,5 g de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 g) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Diluir el ADN a 100 l con medio libre de suero (de Eagle modificado por Dulbecco - DMEM).
- Añadir 8 l de la reactivo de transfección (por ejemplo, FUGENE) (en la proporción de ADN plasmídico: agente de transfección de 2 g (ADN) a agente de transfección 8 l) en el ADN que contiene 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
- Incubar la transfección mezcla de reactivos / ADN durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añadir gota a gota 100 l de la mezcla de reactivo de transfección / DNA por pocillo a una placa de 6 pocillos con células AF ratón y distribuir por agitación suave, con un volumen final de 2 ml / pocillo. Dejar durante 24 h.
- El día después, inducir la expresión de factores de la Yamanaka (Oct4, Klf4 cMyc, Sox2) por la alimentación de las células con medio fresco iPS-AF suplementado con 1,5 g / ml de doxiciclina (2 ml de medio para cada pocillo).
- Alimentar a las células de todos los días, sin paso, en un medio con dox fresca (mantener las células en medios suplementados con doxiciclina hasta el punto 5.13).
- Observar las células dentro de las 24 h para la expresión mCherry y diariamente durante la formación de colonias (colonias aparecen típicamente entre 20 y 30 días después de la transfección).
- Un día antes de la recolección de colonia, preparar una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con MEF tratado con mitomicina C.
- Recoger colonias individuales en 50 l de volumen usinga 200 pipeta l, y transferir de forma secuencial en una placa de 96 pocillos en pocillos individuales.
- El día después, se disocian todas las colonias en células individuales mediante la adición de 50 l de la tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Pipetear arriba y abajo para desagregar la colonia.
- Transferencia de 50 l de la tripsina que contiene la colonia disociada en un nuevo bien con inactivada MEF en una gelatina 0,1% recubierto de 96 pocillos de la placa llena con 100 l de medio fresco iPS-AF suplementado con doxiciclina.
- Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió 1: 2 a dos pocillos, uno con doxiciclina y la otra sin doxiciclina, para verificar si las colonias aparecen también en la condición sin doxiciclina.
- Seguir manteniendo clones iPS-AF, doxiciclina independiente, en inactivada MEF en el medio IPS-AF.
- Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, CHAnging medio diario.
6. La tinción de fosfatasa alcalina
- Realizar tinción de fosfatasa alcalina siguiendo el protocolo del fabricante cuando se produzca la aparición de células iPS-AF independientes doxiciclina.
7. La inmunofluorescencia
- Siempre que se produzca la aparición de células iPS independientes doxiciclina-AF, sembrar 150.000 células / cm2 en un pocillo de una placa de 24 pocillos con inactivada MEF, y hacer crecer las células durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- (Precaución) fijar las células mediante la adición de 300 l por pocillo de 4% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añadir 300 l de 0,1% de células para permeabilizar NP-40.
- Enjuagar las células con 300 l de 0,1% PBS-Tween 20.
- Añadir 300 l de tampón de bloqueo de la (10% de suero de caballo en 1x PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente.
- Utilice los siguientes anticuerpos primarios: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) y SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 con 1% de albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal al 10%, 0,3 M de glicina en 0,1% PBS-Tween-20. Diluir todos los otros anticuerpos con 10% de suero de caballo en 1x PBS.
- Se incuban los anticuerpos durante la noche a 4 ° C.
- Enjuague con 300 l de 0,1% PBS-Tween-20.
- Usa los anticuerpos secundarios diluidos en suero de caballo al 10% en 1 x PBS: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratón (1: 200), Alexa594-conjugado IgG de pollo anti-cabra (1: 200), Alexa594 conjugado de pollo anti-IgG de conejo (1: 200), de cabra conjugado con Alexa568 anti-IgM de ratón (1: 200). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Enjuague con 1x PBS.
- núcleos de tinción con solución de Hoechst (1: 10.000) en 1x PBS.
8. En Vitro Diferenciación Celular
- Para formar gota colgante cuerpos embrioides (EBS), cultivar las gotas individuales (2.000 células / 20 l) sobre la tapa de las placas Petri, con el medio de diferenciación.
- Incubar las placas a 37 ° Cy 5% de CO2 durante 4 días.
- Transferir los EB en 100 mm platos bacteriana grado en el cultivo en suspensión durante 3 días en medio de diferenciación.
- EBs de placas en placas de 24 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal (diluido 1:10 en DMEM) durante otros 14 días.
- Para los análisis de inmunofluorescencia, utilizar anticuerpos primarios: T (1: 100), αfp (1: 200) y Tubb3 (1: 500) 37.
Formación 9. En Vivo Teratoma
- Se inyectan 100 l de 1x PBS que contenía 1 x 10 6 células iPS-AF en el músculo de la extremidad posterior de Rag2 - / -? C - / - ratones.
- Sacrificar los ratones mediante dislocación cervical 6 semanas después de la inyección de células.
- Retire las masas tumorales, que se distinguen por su tamaño, de la extremidad posterior de los ratones durante los siguientes análisis.
- Cortar 7-10 micras secciones transversales de espesor del tumor isopentano-congelado usando un criostato.
- Para una Haematoxylind eosina (HE) de la mancha:
- Manchar con HE para evaluar la composición del tejido tumoral, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Para las manchas de inmunoperoxidasa:
- Fijar secciones teratoma con 4% PFA durante 15 min a temperatura ambiente.
- Permeabilizar con 0,1% Triton X-100.
- Incubar con los siguientes anticuerpos: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) y αSMA (1: 100) diluido en 1% de BSA en PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) o durante la noche a 4 ° C (para los otros anticuerpos).
- peroxidasa bloque usando 100% de metanol durante 20 min.
- Incubar durante 45 min a 37 ° C con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1: 150) anti-ratón.
- Enjuague con 1x PBS.
- Incubar con peroxidasa sustrato (HRP) (ver Materiales Tabla) durante 5 min.
- Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos.
- Teñir con hematoxilina QS durante 9 s.
- Enjuague con agua del grifo. 10. Extracción de ARN a partir de células
- Utilice un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.
- Homogeneizar el teratoma usando una mano de mortero y mortero y nitrógeno líquido para evitar la descongelación de la muestra.
- Pesar 25 mg de tejido.
- Añadir 1 ml de reactivo comercial para la extracción de RNA y 200 l de cloroformo.
- Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Centrifugar a 13.000 xg y 4 ° C durante 15 min.
- Transferir el sobrenadante aclarado a un tubo nuevo.
- Para purificar el RNA utilizar un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Sintetizar la primera hebra de ADNc utilizando una transcriptasa inversa para la transcripción inversa (RT) reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligo accor (dT)ding con el protocolo del fabricante, para obtener 50 ng / l de cDNA. Diluir cDNA con agua libre de RNasa a una concentración de 10 ng / mL.
- Realizar RT-PCR utilizando la polimerasa de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando 1 ng / l de cDNA.
11. La extracción de RNA de teratoma
Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa 12. Reverse Transcription
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Representative Results
Para evaluar la capacidad de la reprogramación, se recogieron las células de ratón AF de fetos de ratones GFP. Las células fueron transfectadas con el plásmido de transposón circular PB-tetO2-IRES-OKMS, que expresa los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 y cmyc) vinculados a la proteína fluorescente mCherry de una manera inducible por doxiciclina, y revertir transactivador de tetraciclina (PB- CAG-rtTA) plásmidos junto con el plásmido de expresión de la transposasa (mPBase). Células de ratón AF fueron transfectadas con Oct4, Klf4 y Sox2 cMyc después de 1 semana de la expansión in vitro sobre una capa de alimentación MEF. Para la expresión de los factores exógenos, se añadió doxiciclina el día después de la transfección a una concentración de 1,5 mg / ml, como se describió anteriormente 39. La expresión de la mCherry era visible después de 24 h de la adición de doxiciclina, lo que indica la transfección. Las primeras colonias con una morfología similar ES aparecieron 20 días después de doxycycline de inducción y se tomó 30 días después de la transfección. Estas colonias se sembraron en capas alimentadoras de fibroblastos inactivados. Después de recoger, los clones supervivientes se mantuvieron en medio suplementado con doxiciclina durante algunos pasajes hasta encontrado que la doxiciclina independiente en pocillos replicados 33.
clones de ratón iPS-AF se evaluaron para determinar diferentes parámetros: la expresión mCherry, la tinción de fosfatasa alcalina, la expresión de proteínas de los marcadores de pluripotencia Oct4, Sox2, Klf4, Nanog y SSEA1, la expresión de los genes pluripotencia exógenos y endógenos (Oct4, Klf4, CMYC y Sox2) , in vitro (EBS) y la diferenciación in vivo (ensayo de teratoma) en. Se cumplen todos los criterios evaluados para validar su pluripotencia, como se resume en la Figura 1.
Figura 1: La reprogramación de ratón AF GFP + células. (A) Doxiciclina colonias independientes de iPS-AF células GFP + fueron negativos para la expresión de mCherry y positivo para la tinción de fosfatasa alcalina (ALP). Barras de escala = 250 micras y 100 micras. (B) Imágenes representativas de células iPS-AF con doxiciclina independiente estables que expresan GFP + Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 y SSEA1. Barra de escala = 100 micras. (C) Análisis de RT-PCR para la expresión de exógena (cebadores basados en vectores, Tg) y endógenos (Oct4, Klf4, cMyc y Sox2) genes. Beta-2-microglobulina (B2M) fue considerado como un gen de mantenimiento. líneas de células reprogramadas se cultivaron en presencia (+) o ausencia (-) (96 hr) de doxiciclina. Se utilizaron células R1 ES como control. (Panel PCR ha sido modificado a partir de Bertin et al. 38 (D) Aspecto macroscópico de teratoma obtenido 6 semanas después de la inyección de IPS-AF células GFP + en las extremidades traseras de los Rag2 - / -? C - / - ratón. (E) y la histología teratoma inmunotinción confirmado la diferenciación celular en las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo). αfetoprotein (Afp, endodermo), se detectaron αsmooth actina de músculo (αSMA, mesodermo), y β3 tubulina (Tubb3, ectodermo) en masas tumorales. Barra de escala = 100 micras. (F) Análisis de RT-PCR de EBs y teratoma (Te). C +, control positivo; NTC, control sin plantilla. Vimentina (Vim, mesodermo), αfetoprotein (Afp, endodermo) y β3 tubulina (Tubb3, ectodermo). (Panel PCR se ha modificado de la referencia 38). Haga clic aquí para ver una versión más grande de THes figura.
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Discussion
El método elegido para obtener la inducción de la pluripotencia es relevante para la seguridad clínica de células con respecto al trasplante a largo plazo. Hoy en día, existen varios métodos adecuados para la reprogramación. Entre los métodos no integrativos, la viral (SEV) vector Sendai es un virus de ARN que pueden producir grandes cantidades de proteína sin integrar en el núcleo de las células infectadas 40 y podría ser una estrategia para obtener células iPS. vectores SeV podría ser un candidato atractivo para la generación de células iPS de traslación de grado, pero presenta algunas deficiencias. La replicasa viral es sensible a la naturaleza de las secuencias transgénicas. Desde vectores SeV constitutivamente replican, que pueden ser difíciles de eliminar de las células huésped, incluso si diferentes estrategias se utilizan para mejorar este aspecto 41, 42. Se requiere un manejo especial, como una cabina de seguridad biológica de nivel 2. Estoy ahíSólo hay un proveedor comercial disponible. Hay una carencia actual de SEV de grado clínico para la reprogramación y hay altos costos de la producción de células iPS.
Debido a estos aspectos, el sistema de transposón puede ser considerado un mejor enfoque con respecto a los vectores de SeV, y aquí se establece que este sistema es un método adecuado para la reprogramación de células AF ratón con diversas ventajas. Permite la producción de células iPS xenofree contrarias a los protocolos de producción virales actuales que utilizan condiciones de xenobióticos. No tiene ninguna barrera de las especies aparente y tiene una capacidad de carga más grande que los virus transgén. Permite la entrega simple y seguro de transposones de plásmido mediante el uso del método de transfección de células estándar, que se puede realizar fácilmente en cada laboratorio equipado con una cabina de seguridad biológica de nivel 1. Transposasa reexpresión permite la eliminación de elementos PB, con la consiguiente generación de células iPS de ratón y humanos sin huella, como se ha demostrado en diversos cell líneas 32, 34, 35. Diferentes estudios mostraron que los sistemas de transposón muestran una frecuencia más baja en la orientación cerca de genes relacionados con el cáncer y menos sesgo en la selección de genes activos en comparación con vectores basados en virus 43, 44, 45, 46, 47. La reprogramación basado en transposones depende del método de entrega elegido, y esto es una limitación debido a la resistencia o toxicidad relacionada con los métodos de transfección de ADN (lipofección, electroporación o nucleofection). Aquí hemos utilizado una formulación no liposómica diseñado para transfectar ADN que funcionaba bien con células AF ratón. Si se emplean otras células, serán necesarias pruebas para utilizar el mejor método de entrega en términos de eficacia alta y baja toxicidad. Resumiendo, se considera el método transposón PB ser un segurod bajo costo pero con una menor eficiencia en comparación con vectores SeV.
En cuanto al procedimiento para obtener células de ratón AF, es fundamental contar con los ratones hembra embarazada disponible. Como tal, es necesario establecer un número suficiente de apareamientos (al menos seis hembras con dos hembras por macho).
Más experimentos podrían realizarse específicamente en células AF humanos para producir células iPS a partir de fetos sanos y enfermos. Teniendo en cuenta la amplia gama de enfermedades congénitas que pueden ser detectadas a través de la diagnosis prenatal, células obtenidas a partir de la AF durante la gestación representar la mejor fuente para obtener células iPS tanto para el estudio de la enfermedad 48 y también para la planificación de un enfoque de la medicina regenerativa en caso de defectos de tejidos tales como cardiaco o músculo esquelético 49, 50.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
| DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
| Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
| Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
| LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
| Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
| Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
| MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
| MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
| Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
| Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x |
| Penicillin - Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Petri Dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
| PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
| Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
| Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
| αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
| Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
| Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
| 200 μl tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
| Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
| Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
| Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
| Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
| MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |
References
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