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Developmental Biology

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

La diagnosi prenatale è un importante strumento clinico per valutare le malattie genetiche (cioè aberrazioni cromosomiche, malattie monogeniche o poligeniche / multifattoriale) e malformazioni congenite (cioè ernia diaframmatica congenita, lesioni polmonari cistiche, onfalocele, gastroschisi). Il liquido amniotico (AF), le cellule sono semplici da ottenere dalle procedure di routine in programma durante il secondo trimestre di gravidanza (cioè l'amniocentesi e amnioreduction) o parti cesarei 1, 2. La disponibilità di cellule da pazienti AF prenatale o neonatale fornisce la possibilità di utilizzare questa fonte per la medicina rigenerativa, e diversi ricercatori studiato la possibilità di trattare diversi danni tissutali o malattie utilizzando una popolazione di cellule staminali isolate da AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilità di ottenere facilmente cellule AF di pazienti malati, in una finestra temporale in cui la malattia è spesso stazionario, apre la strada per l'idea di utilizzare questa fonte di cellule per scopi di riprogrammazione. Infatti, staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule derivate da cellule AF potrebbero essere differenziate nelle cellule di interesse per i test in vitro di droga o per gli approcci di ingegneria dei tessuti, al fine di preparare una adeguata terapia specifica per il paziente prima del parto. Molti studi hanno già dimostrato la capacità delle cellule AF da riprogrammare e differenziato in una vasta gamma di tipi di cellule 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Dal momento che la scoperta da Takahashi e Yamanaka 28 di riprogrammazione delle cellule somatiche attraverso l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4), sono stati compiuti progressi nel campo della riprogrammazione. Considerando i diversi metodi, possiamo distinguere tra approcci virali e non virali. Il primo si aspetta l'utilizzo di vettori virali (retrovirus e lentivirus), che hanno elevata efficienza, ma silenziamento solito incompleta del transgene retrovirale, sia con la conseguenza di una linea cellulare parzialmente riprogrammato e il rischio diinserzionale mutagenesi 29, 30, 31. Il metodo non virale utilizza diverse strategie: cioè plasmidi, vettori, mRNA, proteine, trasposoni. La derivazione di cellule iPS liberi di sequenze transgeniche ha lo scopo di aggirare gli effetti potenzialmente nocivi di espressione del transgene che perde e mutagenesi inserzionale. Tra tutte le strategie non virali di cui sopra, il piggyBac (PB) Sistema di trasposoni / trasposasi richiede solo le ripetizioni terminali invertite che fiancheggiano un transgene ed espressione transitoria dell'enzima trasposasi di catalizzare l'inserimento o escissione eventi 32. Il vantaggio nell'uso trasposoni rispetto ad altri metodi per la generazione di cellule iPS è la possibilità di ottenere cellule iPS privo di vettore con un approccio vettore non virale che mostra la stessa efficienza di vettori retrovirali. Ciò è possibile mediante escissione traccia meno della codifica trasposone integrato per la reprogramming fattori a seguito di una nuova espressione transitoria del trasposasi nelle cellule iPS 33. Dato che PB è efficiente in diversi tipi cellulari 34, 35, 36, 37, è più adatto per un approccio clinico rispetto ai vettori virali, e consente la produzione di cellule iPS libera-xeno contrariamente a protocolli di produzione virali correnti che utilizzano xenobiotico condizioni, questo sistema viene utilizzato per ottenere cellule iPS da murino AF.

Di seguito vi proponiamo un protocollo dettagliato seguenti lavori già pubblicati per mostrare la produzione di iPS pluripotenti cloni di cellule di topo AF (cellule iPS-AF) 38.

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Protocol

Tutte le procedure erano in conformità con la legge italiana. campioni murini AF sono state raccolte dai topi in gravidanza a 13,5 giorni dopo coitum (DPC) da C57BL / 6-Tg topi (UBC-GFP) 30Scha / J chiamato GFP.

1. Transposon Produzione

NOTA: vettori di espressione trasposoni sono stati generati utilizzando le procedure di clonazione standard. Il DNA plasmidico per il mouse AF cellule trasfezione è stato preparato utilizzando kit commerciali.

  1. Mescolare 10 ng di DNA plasmidico con 50 ml di batteri DH5α in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare la provetta in ghiaccio per 20 min.
  2. scossa di calore a 42 ° C per 40 sec.
  3. Mettere provetta in ghiaccio per 2 minuti.
  4. Aggiungere 250 ml di brodo di pre-riscaldato (C 37 °) brodo lisogenia (LB). Agitare (300 rpm) a 37 ° C per 30 min.
  5. Distribuire 30 ml di ogni trasformazione su piastre LB con 0,1 mg / ml di ampicillina. Lasciare le piastre a secco e incubare invertiti a 37 ° C overnight.
  6. Il giorno dopo, nel pomeriggio, prendere 3 colonie, utilizzando sterili 200 microlitri punte, da ogni trasformazione e trasferimento su 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Agitare batteri (300 rpm) durante la notte a 37 ° C.
  8. Per la depurazione plasmide utilizzare kit commerciali. plasmidi stock a -20 ° C.

2. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Cultura

  1. Rivestimenti dei 6 pozzetti con 0,1% di gelatina
    1. piastre Coat sotto il cofano aggiungendo 1 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina a ciascuna delle sei pozzetti. Sia la gelatina polimerizzare sulla incubatore (37 ° C) per 1 ora.
    2. Eliminare l'eccesso, e asciugare le piastre per 1 ora.
    3. Utilizzare parafilm per sigillare e piastre di conservare a temperatura ambiente.
  2. L'inattivazione del MEF con Mitomicina C
    1. Scongelare una fiala di 4 x 10 6 cellule MEF utilizzando una C vasca 37 °.
    2. Seme MEF nella cappa su una piastra di Petri (150 mm) con il mezzo MEF.
    3. Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
    4. (ATTENZIONE) Aggiungere mitomicina C (5 mg / ml) quando le cellule sono confluenti.
    5. Cellule posto in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 3 ore.
    6. Rimuovere media con cellule mitomicina C. Lavare tre volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
    7. Aggiungere 2 ml di cellule tripsina e luogo commerciale nel 37 ° C incubatore per 5 min. Dopo, aggiungere 18 ml di blocco mezzo per arrestare la reazione tripsina.
    8. Contare le cellule utilizzando una camera di Burker secondo il protocollo del produttore.
    9. cellule centrifugare a 145 xg per 5 min. Eliminare il surnatante.
    10. Seme 60.000 cellule / cm 2 di inattivato MEF su 0,1% piastre rivestite di gelatina.
    11. Coltivare cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2, prima della semina AF e / o cellule iPS-AF.

L'isolamento delle cellule 3. mouse AF

  1. Impostare accoppiamenti a tempo e verificare plu vaginalegs dopo 24 ore di co-housing.
  2. Osservare fino a 13,5 DPC e sacrificare diga incinta attraverso dislocazione cervicale.
  3. Pulire la parete addominale dell'animale utilizzando il 70% di etanolo.
  4. Utilizzando le forbici, eseguire una laparotomia mediana incisione della lunghezza della parete addominale per accedere nella cavità addominale.
  5. Esporre l'utero con pinze. Rimuovere l'utero con le forbici e il trasferimento in un piatto da 100 millimetri di Petri piena di sterile PBS 1x posto sul ghiaccio.
  6. Utilizzare uno stereomicroscopio per raccogliere l'AF a 10X di ingrandimento.
  7. Tenere l'utero con una pinza e rimuovere la parete uterina con le forbici. Fare attenzione a non danneggiare le membrane fetali e conseguente perdita di liquido amniotico.
  8. Raccogliere feti in una capsula di Petri 100 millimetri pieno di sterili 1x PBS e disporli sul ghiaccio.
  9. Afferrare la placenta di un feto con una pinza sottile punti e posto in un ambiente pulito 100 millimetri piastra Petri.
  10. Rimuovere il sacco vitellino con pinze punta fine.
  11. Dopo la raccolta AF, lavare ogni feto con sterile 1x PBS integrato con siero fetale bovino 1% (FBS) e raccogliere nei tubo da 15 ml contenente l'AF.
  12. Centrifugare AF a 145 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante sotto il cofano e seminare le cellule AF pellet.

4. mouse AF Cell Culture

  1. Semina di cellule di topo AF
    1. Un giorno prima della semina, preparare un 6-pozzetti di gelatina rivestite 0,1% con mitomicina C trattati con MEF.
    2. Dopo la raccolta AF, seminare le cellule ottenute da una amniocentesi (circa 1 x 10 7 cellule ottenute da feti 6) sul mitoticamente inattivato MEF utilizzando terreno di coltura AF.
    3. Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2, cambiando il mezzo ogni altro giorno.
    4. Dopo 7 giorni di coltura, transcellule fetto AF seguendo la procedura descritta di seguito.

5. Transfection, iPS-AF cellulare Generation e cultura

NOTA: cellule mouse AF sono state trasfettate con il plasmide trasposone PB-tetO2-IRES-OKMS, in combinazione con un plasmide di espressione trasposasi (mPBase) e con il transattivatore inverso tetraciclina trasposone plasmide (PB-CAG-rtTA). Tutti i plasmidi sono stati forniti dal professor Andras Nagy 33.

  1. Mescolare 1 mg di PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 mg di mPBase e 0,5 mg di PB-CAG-rtTA (DNA totale: 2 mg) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Diluire il DNA di 100 ml con terreno privo di siero (Dulbecco Modified Eagle Medium - DMEM).
  3. Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione (ad esempio, Fugene) (nel rapporto di DNA plasmidico: agente trasfezione di 2 mg (DNA) all'agente trasfezione 8 mL) nel DNA contenente 1,5 mL provetta.
  4. Incubare trasfezione miscela reagente / DNA per 15 min a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere goccia a goccia 100 ml della miscela di trasfezione reagente / DNA per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con cellule di topo AF e distribuire delicatamente vorticoso, con un volume finale di 2 ml / pozzetto. Lasciare agire per 24 h.
  6. Il giorno dopo, indurre l'espressione di fattori della Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) alimentando le cellule con mezzo fresco iPS-AF integrato con 1,5 mg / ml di doxiciclina (2 ml di mezzi per ogni pozzetto).
  7. Nutrire le cellule ogni giorno, senza passaggio, con il mezzo DOX contenente fresco (mantenere le cellule in mezzi integrato con doxiciclina fino punto 5.13).
  8. Osservare le cellule entro 24 ore per l'espressione mCherry e tutti i giorni per la formazione di colonie (colonie compaiono tipicamente tra i 20 e 30 giorni dopo la transfezione).
  9. Un giorno prima colonia raccolta, preparare una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con mitomicina C trattati con MEF.
  10. Scegliere singole colonie in 50 ml di volume di usinga 200 microlitri pipetta, e trasferire in sequenza in una piastra da 96 pozzetti in singoli pozzetti.
  11. Il giorno dopo, dissociarsi ogni colonia in singole cellule aggiungendo 50 ml di tripsina commerciale e incubare per 5 min a 37 ° C.
  12. Pipetta su e giù per disaggregare la colonia.
  13. Trasferire 50 ml di tripsina contenente la colonia dissociato in un nuovo pozzo con inattivato MEF su una gelatina 0,1% rivestito 96 ben piatto pieno di 100 ml di fresca media IPS-AF integrato con doxiciclina.
  14. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, suddiviso in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti.
  15. Quando le cellule raggiungono 60-70% di confluenza, raggruppati 1: 2 a due pozzetti, uno con doxiciclina e l'altro senza doxiciclina, per verificare se le colonie appaiono anche nella condizione senza doxiciclina.
  16. Continuare a mantenere cloni iPS-AF, doxiciclina indipendenti, su inattivato MEF nel medio iPS-AF.
  17. Coltivare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2, CHAnging media giornaliera.

6. fosfatasi alcalina Colorazione

  1. Eseguire alcalina colorazione fosfatasi seguendo il protocollo del produttore ogni volta che c'è la comparsa di cellule iPS-AF doxiciclina indipendenti.

7. immunofluorescenza

  1. Ogni volta che c'è l'aspetto delle cellule iPS doxiciclina indipendenti-AF, semi di 150.000 cellule / cm 2 su un pozzo di un 24-pozzetti con inattivato MEF, e far crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. (ATTENZIONE) Fissare le cellule aggiungendo 300 pl per pozzetto del 4% paraformaldeide (PFA) per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 300 microlitri di 0.1% NP-40 per permeabilize cellule.
  4. Risciacquare le cellule con 300 ml di 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Aggiungere 300 ml di tampone di bloccaggio (siero di cavallo 10% in PBS 1x) per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluire SSEA1 con 1% di siero albumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,3 M glicina in 0.1% PBS-Tween-20. Diluire tutti gli altri anticorpi con 10% di siero di cavallo in 1x PBS.
  7. Incubare gli anticorpi notte a 4 ° C.
  8. Risciacquare con 300 ml di 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Usare gli anticorpi secondari diluiti in 10% di siero di cavallo in 1x PBS: capra Alexa594 coniugato anti-topo IgG (1: 200), Alexa594 coniugato IgG pollo anti-capra (1: 200), Alexa594 coniugato pollo anti-IgG di coniglio (1: 200), capra Alexa568 coniugato anti-topo IgM (1: 200). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
  10. Risciacquare con PBS 1x.
  11. nuclei macchia con soluzione di Hoechst (1: 10.000) in PBS 1x.

8. In Vitro cellulare Differenziazione

  1. Per formare goccia d'attaccatura corpi embrionali (EBS), coltivare singole gocce (2.000 cellule / ml 20) sul coperchio di piastre Petri, utilizzando il mezzo di differenziazione.
  2. Incubare i piatti a 37 ° Ce 5% CO 2 per 4 giorni.
  3. Trasferire EBs in 100 mm piatti batterica-grade in coltura in sospensione per 3 giorni in media di differenziazione.
  4. EB piastra in 24 e piastre rivestite con matrice di membrana basale (diluito 1:10 in DMEM) per altri 14 giorni.
  5. Per analisi immunofluorescenza, utilizzare anticorpi primari: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37.

Formazione 9. In Vivo Teratoma

  1. Iniettare 100 ml di 1x PBS contenente 1 x 10 6 cellule iPS-AF nel muscolo della arti posteriori di RAG2 - / - γc - / - mice.
  2. Sacrificio topi tramite dislocazione cervicale 6 settimane dopo l'iniezione delle cellule.
  3. Rimuovere le masse tumorali, che si distinguono per le loro dimensioni, dalla arti posteriori dei topi per le seguenti analisi.
  4. Tagliare 7-10 micron di spessore sezioni trasversali del tumore isopentano congelato con un criostato.
  5. Per Ematossilina und Eosin (HE) Stain:
    1. Macchia con SE di valutare la composizione del tessuto tumorale, seguendo il protocollo del produttore.
  6. Per Stain dell'immunoperossidasi:
    1. Fissare sezioni teratoma con 4% PFA per 15 min a temperatura ambiente.
    2. Permeabilize con 0,1% Triton X-100.
  7. Incubare con i seguenti anticorpi: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) e αSMA (1: 100) diluito in 1% BSA in PBS 1x. Incubare per 1 ora a 37 ° C (per Tubb3) o per una notte a 4 ° C (per gli altri anticorpi).
  8. perossidasi blocco utilizzando il 100% di metanolo per 20 minuti.
  9. Incubare per 45 minuti a 37 ° C con l'anticorpo secondario HRP-coniugato (1: 150) anti-topo.
  10. Risciacquare con PBS 1x.
  11. Incubare con perossidasi (HRP) substrato (vedi Materiali Tavolo) per 5 min.
  12. Risciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti.
  13. Macchia con ematossilina QS per 9 sec.
  14. Risciacquare con acqua di rubinetto.
    15. 10. RNA Estrazione da cellule

    1. Utilizzare un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo consigliato dal produttore.

    11. RNA Estrazione da teratoma

    1. Omogeneizzare il teratoma con un pestello e mortaio e di azoto liquido per evitare lo scongelamento del campione.
    2. Pesare 25 mg di tessuto.
    3. Aggiungere 1 ml di reagente commerciale per l'estrazione di RNA e 200 ml di cloroformio.
    4. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    5. Centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 15 min.
    6. Trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta.
    7. Per purificare l'RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo del produttore.

    12. trascrizione inversa-polimerasi Analisi Reazione a catena

    1. Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando una trascrittasi inversa per la trascrizione inversa (RT) reazione a catena -polymerase (PCR) e oligo Accor (dT)ding il protocollo del produttore, per ottenere 50 ng / ml di cDNA. Diluire cDNA con acqua priva di RNasi ad una concentrazione di 10 ng / ml.
    2. Eseguire RT-PCR utilizzando la DNA polimerasi secondo il protocollo del produttore, utilizzando 1 ng / ml di cDNA.

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Representative Results

Per valutare la capacità di riprogrammazione, le cellule del mouse AF sono stati raccolti da feti di topi GFP. Le cellule sono state trasfettate con il plasmide trasposoni circolare PB-tetO2-IRES-OKMS, che esprime i fattori di Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4) legati alla proteina fluorescente mCherry in maniera doxiciclina-inducibile, e invertire tetraciclina transactivator (PB CAG-rtTA) plasmidi insieme con il plasmide espressione trasposasi (mPBase). Cellule di topo AF sono state trasfettate con Oct4, Klf4, cMyc e Sox2 dopo 1 settimana di espansione in vitro su uno strato alimentatore MEF. Per l'espressione dei fattori esogeni, doxiciclina stato aggiunto del giorno dopo la trasfezione ad una concentrazione di 1,5 mg / mL, come descritto in precedenza 39. L'espressione del mCherry era visibile dopo 24 h dalla aggiunta doxiciclina, indicando trasfezione. Le prime colonie con una morfologia ES-come apparvero 20 giorni dopo doxinduzione ycycline e siamo stati prelevati 30 giorni dopo la trasfezione. Queste colonie sono state seminate su strati di alimentazione fibroblasti inattivati. Dopo la raccolta, i cloni sopravvissuti sono stati mantenuti in media integrato con doxiciclina per alcuni passaggi fino trovato per essere doxiciclina indipendenti in pozzi replicati 33.

cloni mouse iPS-AF sono stati valutati per diversi parametri: espressione mCherry, alcalina colorazione fosfatasi, espressione proteica dei marcatori pluripotenza Oct4, Sox2, Klf4, Nanog e SSEA1, espressione dei geni pluripotenza esogeni ed endogeni (Oct4, Klf4, cMyc e Sox2) , in vitro (EBS) e in vivo (saggio teratoma) differenziazione. Essi rispondevano a tutti i criteri valutati per convalidare la loro pluripotenza, come riassunto nella figura 1.

Figura 1
Figura 1: La riprogrammazione di topo AF GFP + cellule. (A) Doxiciclina colonie indipendenti di GFP cellule iPS-AF + erano negativi per l'espressione di mCherry e positivo per la colorazione fosfatasi alcalina (ALP). Barre di scala = 250 micron e 100 micron. (B) Immagini rappresentative della cella stabili iPS-AF doxiciclina indipendente GFP + esprimono Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 e SSEA1. Barra di scala = 100 micron. (C) analisi RT-PCR per l'espressione di esogena (primer basati su vettori, Tg) e endogena (Oct4, Klf4, cMyc e Sox2) geni. Beta-2-microglobulina (B2M) è stato considerato come un gene housekeeping. linee cellulari riprogrammate sono state coltivate in presenza (+) o in assenza (-) (96 hr) di doxiciclina. cellule ES R1 sono stati usati come controllo. (Pannello PCR è stato modificato da Bertin et al. 38 (D) apparizione lordo del teratoma ottenuto 6 settimane dopo l'iniezione di GFP cellule iPS-AF + nelle arti posteriori di Rag2 - / - γc - / - mouse. (E) l'istologia teratoma e immunostaining confermato differenziazione cellulare in tutti e tre i foglietti embrionali (ectoderma, mesoderma ed endoderma). αfetoprotein (Afp, endoderma), αsmooth actina muscolare (αSMA, mesoderma), e β3 tubulina (Tubb3, ectoderma) sono stati rilevati in masse tumorali. Barra di scala = 100 micron. (F) RT-PCR di EB e teratoma (Te). C +, controllo positivo; NTC, il controllo non-modello. Vimentina (Vim, mesoderma), αfetoprotein (Afp, endoderma) e β3 tubulina (Tubb3, ectoderma). (Pannello PCR è stato modificato dal riferimento 38). Clicca qui per vedere una versione più grande di Thè figura.

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Discussion

Il metodo scelto per ottenere l'induzione di pluripotenza è rilevante per la sicurezza clinica cellule rispetto al trapianto di lungo termine. Oggi, ci sono diversi metodi adatti per la riprogrammazione. Tra i metodi non-integrative, il virale (SeV) vettore Sendai è un virus a RNA in grado di produrre grandi quantità di proteine senza integrare nel nucleo delle cellule infette 40 e potrebbe essere una strategia per ottenere cellule iPS. vettori SEV potrebbe essere un candidato per la generazione di cellule iPS traslazionale qualità, ma presenta alcuni inconvenienti. Il replicasi virale è sensibile alla natura delle sequenze transgeniche. Poiché vettori Sev costitutivamente replicano, essi possono essere difficili da eliminare dalle cellule ospiti, anche se diverse strategie sono utilizzati per migliorare questo aspetto 41, 42. Esso richiede un trattamento speciale, come ad esempio una cappa di sicurezza biologica di livello 2. ci hos solo un fornitore commerciale disponibile. Vi è una mancanza di corrente clinico-grade SeV per la riprogrammazione e ci sono alti costi di produzione delle cellule iPS.

Grazie a questi aspetti, il sistema trasposone può essere considerato un approccio migliore rispetto a vettori Sev, e qui si stabilisce che questo sistema è un metodo adatto per la riprogrammazione delle cellule AF topo con diversi vantaggi. Esso consente la produzione di cellule iPS xenofree contrarie ai protocolli di produzione virale in corso che utilizzano condizioni xenobiotici. Non ha barriera di specie apparente e ha una capacità di carico più grande di transgene virus. Permette consegna semplice e sicura dei trasposoni plasmide attraverso l'uso del metodo di trasfezione cellulare standard, che può essere facilmente eseguita in ogni laboratorio dotato di una cappa di sicurezza biologica Livello 1. Trasposasi ri-espressione permette la rimozione di elementi PB con conseguente generazione di cellule di topo e umane iPS senza impronta, come dimostrato in vari cell linee 32, 34, 35. Diversi studi hanno dimostrato che i sistemi di trasposoni mostrano una frequenza più bassa in termini di orientamento nei pressi di geni connessi con il cancro e meno pregiudizi in termini di orientamento geni attivi rispetto ai vettori virali a base 43, 44, 45, 46, 47. La riprogrammazione basato su trasposoni dipende dal metodo di spedizione scelto, e questo è un limite dovuto alla resistenza o tossicità relativa a metodi di trasfezione del DNA (lipofezione, elettroporazione o nucleofection). Qui abbiamo usato una formulazione liposomiale non progettato per trasfezione del DNA che ha funzionato bene con le cellule AF mouse. Se vengono impiegate altre celle, test sarà necessario utilizzare il metodo di distribuzione in termini di elevata efficienza e bassa tossicità. Sommariamente, il metodo trasposone PB è considerato una cassaforted basso costo, ma con una minore efficienza rispetto ai vettori Sev.

Per quanto riguarda la procedura per ottenere cellule AF del mouse, è fondamentale disporre di gravidanza topi di sesso femminile a disposizione. Come tale, è necessario impostare un numero adeguato di accoppiamenti (almeno sei femmine con due femmine per maschio).

Ulteriori esperimenti potrebbero essere eseguiti specificamente sulle cellule AF umani per produrre cellule iPS da feti sani e malati. Considerando la vasta gamma di malattie congenite che possono essere rilevati attraverso la diagnosi prenatale, cellule ottenute dalla AF durante la gestazione rappresentano la migliore fonte per derivare cellule iPS sia per lo studio della malattia 48 e anche per la pianificazione di un approccio di medicina rigenerativa in caso di difetti del tessuto quali cardiaca o muscolo scheletrico 49, 50.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 120 cellule del liquido amniotico cellule staminali pluripotenti indotte piggyBac trasposoni medicina rigenerativa la riprogrammazione mouse.
La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni
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Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

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