Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

Prænatal diagnose er et vigtigt klinisk redskab til at vurdere genetiske sygdomme (dvs. kromosomafvigelser, monogenetic eller polygenetic / multifaktoriel sygdomme) og medfødte misdannelser (dvs. medfødt diafragma brok, cystisk lungelæsioner, exomphalos, gastroschise). Fostervand (AF) celler er enkle at få fra rutinemæssigt planlagte procedurer i andet trimester af graviditeten (dvs. fostervandsprøve og amnioreduction) eller kejsersnit 1, 2. Tilgængeligheden af AF-celler fra prænatal eller neonatale patienter giver mulighed for at anvende denne kilde til regenerativ medicin, og flere forskere undersøgt muligheden for at behandle forskellige vævsskader eller sygdomme ved anvendelse af en stamcelle population isoleret fra AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Muligheden for nemt at få AF celler fra syge patienter, i et tidsvindue, hvor sygdommen er ofte stationær, baner vejen for tanken om at bruge denne celle kilde til omprogrammering formål. Faktisk kunne induceret pluripotente stamceller (IPS) celler afledt fra AF-celler differentieres i cellerne af interesse for in vitro-test af lægemidler eller væv tekniske tiltag, for at forberede en passende patient-specifik terapi før fødslen. Mange undersøgelser har allerede demonstreret evne AF celler, der skal omprogrammeres, og differentieret i en lang række celletyper 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Siden opdagelsen af Takahashi og Yamanaka 28 omprogrammerede somatiske celler gennem den tvungne udtryk for fire transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, cMyc og Klf4), er der gjort fremskridt med hensyn til omprogrammering. I betragtning af de forskellige metoder, kan vi skelne mellem virale og ikke-virale fremgangsmåder. Den første forventer brugen af ​​virale vektorer (retrovirus og lentivira), som har høj effektivitet men normalt ufuldstændig inaktivering af den retrovirale transgen, med både en følge af en delvis omprogrammeret cellelinie og risikoen forinsertionsmutagenese 29, 30, 31. Den ikke-viral metode anvender forskellige strategier: dvs. plasmider, vektorer, mRNA, protein transposoner. Udledningen af ​​iPS celler fri af transgene sekvenser har til formål at omgå de potentielt skadelige virkninger af utætte transgen ekspression og insertionsmutagenese. Blandt alle de ovennævnte ikke-virale strategier, den PiggyBac (PB) transposon / transposase systemet tager de inverterede terminale gentagelser flankerer et transgen og forbigående ekspression af transposasen enzymet at katalysere insertion eller excision events 32. Fordelen ved anvendelse transposoner i forhold til andre fremgangsmåder til iPS celle generation er muligheden for at opnå vektor-fri iPS-celler med en ikke-viral vektor tilgang, der viser den samme effektivitet af retrovirale vektorer. Dette er muligt ved spor-mindre udskæring af det integrerede transposon koder for reprogramming faktorer efter en ny kortvarig ekspression af transposasen i iPS celler 33. Eftersom PB er effektive i forskellige celletyper 34, 35, 36, 37, er mere egnet til en klinisk tilgang til virale vektorer, og muliggør fremstillingen af xeno-fri iPS celler strid med de gældende virusproduktion protokoller, der bruger xenobiotikum betingelser er dette system anvendes til at opnå iPS celler fra murine aF.

Her foreslår vi en detaljeret protokol efter allerede offentliggjorte arbejde for at vise produktionen af pluripotente iPS kloner fra muse AF celler (iPS-AF celler) 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer var i overensstemmelse med italiensk lovgivning. Murin AF prøver blev høstet fra gravide mus ved 13,5 dage efter coitum (DPC) fra C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J-mus kaldet GFP.

1. Transposon Produktion

BEMÆRK: Transposon ekspressionsvektorer blev frembragt under anvendelse af standard kloningsprocedurer. Plasmid-DNA'et for muse AF celler transfektion blev fremstillet under anvendelse af kommercielle kit.

  1. Bland 10 ng plasmid-DNA med 50 pi DH5a bakterier i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Inkubér mikrocentrifugerør på is i 20 minutter.
  2. Varmechok ved 42 ° C i 40 sek.
  3. Placer mikrocentrifugerør på is i 2 min.
  4. Tilsættes 250 pi foropvarmet (37 ° C) lysogeni bouillon (LB) bouillon. Ryst (300 rpm) ved 37 ° C i 30 minutter.
  5. Spred 30 pi af hver transformation på LB-plader med 0,1 mg / ml ampicillin. Tillad plader tørre og inkuberes inverteret ved 37 ° C overnight.
  6. Den næste dag, om eftermiddagen, pick 3 kolonier, hjælp sterile 200 gi tips, fra hver transformation og overførsel til 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Ryst (300 rpm) bakterier natten over ved 37 ° C.
  8. For plasmid oprensning anvende kommercielle kit. Stock plasmider ved -20 ° C.

2. Mouse Embryonale fibroblast (MEF) Kultur

  1. Overtrækning af plader med 6 brønde med 0,1% gelatine
    1. Coat plader under kølerhjelmen tilføje 1 ml steril 0,1% gelatine til hver af de seks brønde. Lad gelatinen polymerisere på inkubatoren (37 ° C) i 1 time.
    2. Kassér overskydende, og tør pladerne i 1 time.
    3. Brug parafilm at forsegle og opbevare plader ved stuetemperatur.
  2. Inaktivering af MEF med Mitomycin C
    1. Optø et hætteglas på 4 x 10 6 MEF celler under anvendelse af en 37 ° C bad.
    2. Seed MEF i hætten på en petriskål (150 mm) med MEF medium.
    3. Dyrk celler ved 37 ° C og 5% CO2.
    4. (PAS) Tilføj mitomycin C (5 mg / ml), når cellerne er sammenflydende.
    5. Placer celler i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 3 timer.
    6. Fjern medium med mitomycin C. Vask cellerne tre gange med 1x phosphatbuffer saltvand (PBS).
    7. Tilsæt 2 ml af kommercielle trypsin og placere celler i 37 ° C inkubator i 5 minutter. Efter tilsættes 18 ml blokerende medium for at standse trypsin reaktionen.
    8. Tæl cellerne under anvendelse af en Burker-kammer ifølge producentens protokol.
    9. Centrifuger cellerne ved 145 x g i 5 min. Supernatanten kasseres.
    10. Seed 60.000 celler / cm2 af inaktiveret MEF på 0,1% gelatineovertrukne plader.
    11. Dyrk celler i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2, før såning AF og / eller iPS-AF-celler.

3. Mus AF Cell Isolation

  1. Opsæt timede parringer og kontrollere vaginal plugs efter 24 timer af bofællesskab.
  2. Overhold indtil 13,5 dpc og ofre gravid dæmning gennem cervikal dislokation.
  3. Rengør bugvæggen af ​​dyret ved hjælp af 70% ethanol.
  4. Med en saks, udføre en midtlinie laparotomi indskæring længden af ​​bugvæggen for at få adgang ind i bughulen.
  5. Udsætte livmoderen ved hjælp af pincet. Fjerne livmoderen med en saks og overførsel til en 100 mm petriskål fyldt med sterilt 1x PBS anbragt på is.
  6. Brug et stereomikroskop at indsamle AF ved 10X forstørrelse.
  7. Hold livmoderen med en pincet og fjern livmodervæggen med en saks. Vær omhyggelig med at undgå skader på fosterhinderne og deraf følgende fostervand lækage.
  8. Saml fostre ind i en 100 mm petriskål fyldt med sterilt 1x PBS og placere på is.
  9. Tag fat i placenta af ét foster med en fin spids pincet og sted i en ren 100 mm petriskål.
  10. Fjern blommesækken bruge fin spids pincet.
  11. Efter AF indsamling, vask hver foster med sterilt 1x PBS suppleret med 1% føtalt bovint serum (FBS) og anbring i de 15 ml konisk rør indeholdende AF.
  12. Centrifuge AF ved 145 xg i 5 min. Fjern supernatanten under kølerhjelmen og frø de pelleterede AF celler.

4. Mouse AF Cellekultur

  1. Såning af Mouse AF Cells
    1. En dag forud for såning, forberede en gelatineovertrukket plade med 6 brønde 0,1% med mitomycin C-behandlede MEF.
    2. Efter AF indsamling, frø cellerne opnået fra en fostervandsprøve (ca. 1 x 10 7 celler opnået fra 6 fostre) på mitotisk inaktiverede MEF hjælp AF dyrkningsmedium.
    3. Dyrk celler ved 37 ° C og 5% CO2, ændre medium hver anden dag.
    4. Efter 7 dages dyrkning, transfect AF celler efter den nedenfor beskrevne procedure.

5. Transfektion IPS-AF Cell Generation og Kultur

BEMÆRK: Mouse AF-celler blev transficeret med PB-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid, sammen med en transposase ekspressionsplasmid (mPBase) og med den omvendte tetracyclintransaktivatoren (PB-CAG-rtTA) transposon plasmid. Alle plasmider blev leveret af professor Andras Nagy 33.

  1. Bland 1 ug PB-tetO2-IRES-OKMS med 0,5 ug mPBase og 0,5 ug PB-CAG-rtTA (Total DNA: 2 ug) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Fortynd DNA til 100 pi med serum-frit medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium - DMEM).
  3. Tilsæt 8 pi af transfektionsreagens (f.eks Fugene) (i forholdet plasmid-DNA: transfektion agent af 2 ug (DNA) til 8 pi transfektion agent) i 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende DNA.
  4. Inkuber transfektionsreagens / DNA-blandingen i 15 minutter ved stuetemperatur.
  5. Tilsæt dråbevis 100 pi af transfektionsreagens / DNA-blandingen per brønd til en 6-brønds plade med muse AF celler og distribuere under svag omrystning, med et slutvolumen på 2 ml / brønd. Lad i 24 timer.
  6. Dagen efter, inducerer ekspressionen af ​​Yamanaka s faktorer (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) ved fodring af cellerne med friske iPS-AF-medium suppleret med 1,5 ug / ml doxycyclin (2 ml medier til hver brønd).
  7. Feed celler hver dag, uden passage, med frisk dox-holdigt medium (opretholde celler i medium suppleret med doxycyclin indtil punkt 5.13).
  8. Observere celler inden for 24 timer for mCherry ekspression og dagligt i kolonidannelse (kolonier vises typisk mellem 20 og 30 dage efter transfektion).
  9. En dag før koloni plukning, fremstille en 96-brønds vævsdyrkningsplade med mitomycin C-behandlede MEF.
  10. Pick enkelte kolonier i 50 uL volumen usinga 200 pi pipette og overføre dem sekventielt i en 96-brønds plade i individuelle brønde.
  11. Dagen efter, dissociere hver koloni i enkelte celler ved at tilsætte 50 pi af den kommercielle trypsin og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
  12. Pipette op og ned for at opdele kolonien.
  13. Overførsel 50 pi af trypsin indeholdende den dissocierede koloni til en ny brønd med inaktiveret MEF på en gelatine 0,1% overtrukket 96 brønds-plade fyldt med 100 pi frisk iPS-AF-medium suppleret med doxycyclin.
  14. Når cellerne når 60-70% konfluens, opdeles i en brønd i en plade med 24 brønde.
  15. Når cellerne når 60-70% konfluens, delt 1: 2 til to brønde, én med doxycyclin og den anden uden doxycyclin, at kontrollere, om kolonier vises også i tilstand uden doxycyclin.
  16. Fortsæt med at opretholde iPS-AF-kloner, doxycyclin uafhængig, om inaktiveret MEF i iPS-AF medium.
  17. Dyrk celler ved 37 ° C og 5% CO2, chAnging medium dagligt.

6. alkalisk phosphatase Staining

  1. Udføre alkalisk phosphatase-farvning efter fabrikantens protokol, når der er fremkomsten af ​​doxycyclin uafhængige iPS-AF-celler.

7. Immunofluorescens

  1. Når der er fremkomsten af doxycyclin uafhængige iPS-AF-celler, frø 150.000 celler / cm2 på en brønd i en 24-brønds plade med inaktiveret MEF, og vokser cellerne i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. (ADVARSEL) fikseres cellerne ved tilsætning af 300 pi pr brønd af 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Der tilsættes 300 pi 0,1% NP-40 til permeabilisere celler.
  4. Skyl celler med 300 pi 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Der tilsættes 300 pi af blokerende buffer (10% hesteserum i 1 x PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
  6. Brug følgende primære antistoffer: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), NANOG (1:100) og SSEA1 (1:80). Fortynd SSEA1 med 1% bovint serumalbumin (BSA), 10% normalt gedeserum, 0,3 M glycin i 0,1% PBS-Tween-20. Fortynd alle andre antistoffer med 10% hesteserum i 1 x PBS.
  7. Inkuber antistoffer natten over ved 4 ° C.
  8. Skyl med 300 pi 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Brug de sekundære antistoffer fortyndet i 10% hesteserum i 1 x PBS: Alexa594-konjugeret gede-anti-muse-IgG (1: 200), Alexa594-konjugeret kylling anti-gede-IgG (1: 200), Alexa594-konjugeret kylling anti-kanin IgG (1: 200), Alexa568-konjugeret gede-anti-muse-IgM (1: 200). Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
  10. Skyl med 1x PBS.
  11. Stain kerner med Hoechst opløsning (1: 10.000) i 1x PBS.

8. In vitro Cell Differentiering

  1. Til dannelse hængende dråbe embryoide legemer (EBS), dyrke enkelt dråber (2.000 celler / 20 pi) på låget af petriskåle ved hjælp af differentiering medium.
  2. Inkubér skålene ved 37 ° Cog 5% CO2 i 4 dage.
  3. Overfør EB'er i 100 mm bakteriel-grade retter i suspensionskultur i 3 dage i differentiering medium.
  4. Plate EB'er i 24-brønds-plader coatet med basalmembranmatrix (fortyndet 1:10 i DMEM) i yderligere 14 dage.
  5. For immunfluorescens analyser, bruge primære antistoffer: T (1: 100), αfp (1: 200) og Tubb3 (1: 500) 37.

9. In vivo Teratom Formation

  1. Injicer 100 pi 1x PBS indeholdende 1 x 10 6 iPS-AF-celler ind i musklen af bagbenet af rag2 - / - yc - / - mus.
  2. Sacrifice mus gennem cervikal dislokation 6 uger efter celleinjektion.
  3. Fjern tumormasser, der adskiller sig ved deres størrelse, fra bagbenet af mus i de følgende analyser.
  4. Skær 7-10 um tykke tværgående sektioner af isopentan-frosne tumor under anvendelse af en kryostat.
  5. For Hæmatoxylin end Eosin (HE) Stain:
    1. Pletten med HE for at evaluere tumorvævet sammensætning, efter fabrikantens protokol.
  6. For immunoperoxydase Stain:
    1. Fix teratoma sektioner med 4% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur.
    2. Permeabilisere med 0,1% Triton X-100.
  7. Inkuber med følgende antistoffer: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) og αSMA (1: 100) fortyndet i 1% BSA i 1 x PBS. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C (for Tubb3) eller natten over ved 4 ° C (for de andre antistoffer).
  8. Blok peroxidase anvendelse af 100% methanol i 20 minutter.
  9. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C med sekundært antistof anti-mus HRP-konjugeret (1: 150).
  10. Skyl med 1x PBS.
  11. Der inkuberes med peroxidase (HRP) substrat (se Materialer tabel) i 5 minutter.
  12. Skyl med postevand i 5 minutter.
  13. Farv med hæmatoxylin QS for 9 sek.
  14. Skyl med postevand.
    15. 10. RNA-ekstraktion fra celler

    1. Brug et kommercielt RNA-ekstraktion kit ifølge producentens anbefalede protokol.

    11. RNA ekstraktion fra Teratom

    1. Homogenisere teratom anvendelse af en støder og morter og flydende nitrogen for at undgå optøning af prøven.
    2. Afvej 25 mg væv.
    3. Tilsæt 1 ml af kommerciel reagens til RNA-ekstraktion og 200 uL chloroform.
    4. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
    5. Der centrifugeres ved 13.000 xg og 4 ° C i 15 min.
    6. Overfør den klarede supernatant til et nyt rør.
    7. For at oprense RNA bruge et kommercielt RNA-ekstraktion kit ifølge producentens protokol.

    12. Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction Analyse

    1. Syntetisere første-streng cDNA under anvendelse af en revers transkriptase til revers transkription (RT) -polymerase (PCR) og oligo (dT) according med producentens protokol, for at opnå 50 ng / pi cDNA. Fortynd cDNA med RNase-frit vand ved en koncentration på 10 ng / pl.
    2. Udfør RT-PCR under anvendelse af DNA-polymerasen ifølge fabrikantens protokol, udnytte 1 ng / pi cDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at evaluere kapaciteten af ​​omprogrammering blev muse AF cellerne opsamlet fra fostre af GFP-mus. Celler blev transficeret med den cirkulære transposon plasmid PB-tetO2-IRES-OKMS, som udtrykker de Yamanaka faktorer (Oct4, Sox2, cMyc og Klf4) i tilknytning til mCherry fluorescerende protein i en doxycyclin-inducerbar måde, og revers tetracyclin transaktivator (PB- CAG-rtTA) plasmider sammen med transposasen ekspressionsplasmidet (mPBase). Muse AF-celler blev transficeret med Oct4, Klf4, cMyc og Sox2 efter 1 uges in vitro ekspansion over et MEF fødelag. Til ekspression af de exogene faktorer ikke var doxycyclin tilsat dagen efter transfektion ved en koncentration på 1,5 ug / ml, som tidligere beskrevet 39. Ekspressionen af ​​mCherry var synlig efter 24 timer fra doxycyclin tilsætning, hvilket indikerer transfektion. De første kolonier med en ES-lignende morfologi optrådte 20 dage efter doxycycline induktion og blev plukket 30 dage efter transfektion. Disse kolonier blev podet på inaktiverede fibroblast fødelag. Efter plukning, blev overlevende kloner opretholdt i medium suppleret med doxycyclin for nogle passager, indtil fundet at være doxycyclin uafhængig i replikerede brønde 33.

Mus iPS-AF-kloner blev evalueret for forskellige parametre: mCherry udtryk, alkalisk phosphatase farvning, protein ekspression af pluripotens markører Oct4, Sox2, Klf4, NANOG og SSEA1, udtryk af eksogene og endogene pluripotens gener (Oct4, Klf4, cMyc og Sox2) , in vitro (EB'er) og in vivo (teratom assay) differentiering. De opfyldte alle kriterier evalueret for at validere deres pluripotens, som opsummeret i figur 1.

figur 1
Figur 1: Omprogrammering af muse AF GFP + -celler. (A) doxycyclin uafhængige kolonier af iPS-AF GFP + -celler var negative for ekspressionen af mCherry og positive for alkalisk phosphatase (ALP) farvning. Skalapanelerne = 250 um og 100 um. (B) Repræsentative billeder af stabile doxycyclin-uafhængige iPS-AF GFP + celle udtrykker Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 og SSEA1. Scale bar = 100 um. (C) RT-PCR-analyse for ekspression af exogent (vektorbaserede primere, Tg) og endogene (Oct4, Klf4, cMyc og Sox2) gener. Beta-2-mikroglobulin (B2M) blev betragtet som en husholdning gen. Omprogrammeres cellelinier blev dyrket i nærvær (+) eller fravær (-) (96 timer) af doxycyclin. R1 ES-celler blev anvendt som kontrol. (PCR-panel er blevet ændret fra Bertin et al. 38 (D) Gross udseende teratom opnået 6 uger efter injektionen af iPS-AF GFP + -celler i bagbenene af rag2 - / - yc - / - mus. (E) Teratom histologi og immunfarvning bekræftet celle differentiering til alle tre kimlag (ektoderm, mesoderm og endoderm). αfetoprotein (AFP, endoderm), blev αsmooth muskel actin (αSMA, mesoderm), og β3 tubulin (Tubb3, ektoderm) påvist i tumor masserne. Scale bar = 100 um. (F) RT-PCR-analyse af EB'er og teratom (Te). C +, positiv kontrol; NTC, ikke-template-kontrol. Vimentin (Vim, mesoderm), αfetoprotein (AFP, endoderm) og β3 tubulin (Tubb3, ektoderm). (PCR-panel har været ændret siden henvisning 38). Klik her for at se en større udgave af ther figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den valgte at opnå induktion af pluripotens metode er relevant for celle kliniske sikkerhed med hensyn til lang sigt transplantation. I dag er der flere metoder er egnede til omprogrammering. Blandt de ikke-integrative metoder, Sendai viral (SeV) vektor er et RNA-virus, der kan producere store mængder protein uden integration i kernen i de inficerede celler 40 og kunne være en strategi til opnåelse iPS-celler. SeV vektorer kunne være en attraktiv kandidat til generering af translationel-grade iPS celler, men det giver nogle mangler. Den virale replikase er følsom for arten af ​​de transgene sekvenser. Eftersom SeV-vektorer konstitutivt replikere, kan de være vanskelige at fjerne fra værtscellerne, selv om forskellige strategier anvendes til at forbedre dette aspekt 41, 42. Det kræver speciel håndtering, såsom en niveau 2 biologisk sikkerhedsskab. Der is kun én kommerciel leverandør rådighed. Der er en aktuel mangel på klinisk kvalitet SeV for omprogrammering, og der er høje omkostninger ved iPS celle produktion.

På grund af disse aspekter, kan transposonet systemet betragtes som en bedre tilgang til SeV vektorer, og her er vi fastslå, at dette system er en egnet metode til at omprogrammere muse AF celler med forskellige fordele. Det giver mulighed for produktion af xenofree iPS celler i strid med de nuværende virale produktions- protokoller, der bruger miljøfremmede betingelser. Det har ingen tilsyneladende arter barriere og har et transgen lastekapacitet større end vira. Det giver mulighed for enkel og sikker levering af plasmid transposoner gennem brug af standard celletransfektion metode, som let kan udføres i alle laboratorier udstyret med en niveau 1 biologisk sikkerhedsskab. Transposasen re-udtryk tillader fjernelse af PB elementer med deraf følgende generation af fodaftryk-fri mus og menneskelige iPS celler, som påvist i forskellige cell linjer 32, 34, 35. Forskellige undersøgelser har vist, at transposonet systemer udviser en lavere frekvens i målretning nær kræftrelaterede gener og mindre skævhed i målretning aktive gener sammenlignet med virale vektorer 43, 44, 45, 46, 47. Omprogrammering baseret på transposoner afhænger af den valgte leveringsmetode, og dette er en begrænsning på grund af resistens eller toksicitet relateret til DNA-transfektion metoder (lipofektion, elektroporation eller nucleofection). Her anvendte vi en ikke-liposomal formulering udformet til at transficere DNA, som fungerede godt med muse AF celler. Hvis andre celler er ansat, vil tests være nødvendigt at anvende den bedste leveringsmetode i form af høj effektivitet og lav toksicitet. Summarisk, er PB transposon metode anses for at være sikker end lave omkostninger, men med en lavere effektivitet sammenlignet med SeV-vektorer.

Hvad angår proceduren for at opnå muse AF celler, er det vigtigt at have drægtige mus rådighed. Som sådan er det nødvendigt at oprette et tilstrækkeligt antal parringer (mindst seks kvinder med to hunner pr mandlig).

kunne udføres flere forsøg specifikt på humane AF celler til at producere iPS celler fra raske og syge fostre. I betragtning af den brede vifte af medfødte sygdomme, som kan detekteres gennem prænatal diagnose, celler opnået fra AF under svangerskabet repræsenterer den bedste kilde til at udlede iPS-celler til både at studere sygdommen 48 og også for at planlægge en regenerativ medicin fremgangsmåde i tilfælde af vævsdefekter såsom hjerte- eller skeletmuskulaturen 49, 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Tags

Developmental Biology fostervand celler inducerede pluripotente stamceller PiggyBac transposon regenerativ medicin omprogrammering mus.
Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter