Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

التشخيص قبل الولادة هو أداة هامة السريرية لتقييم أمراض وراثية (أي التشوهات الكروموسومية والأمراض monogenetic أو polygenetic / سياقاتها) والتشوهات الخلقية (فتق الحجاب الحاجز الخلقي أي، آفات الرئة الكيسي، فتق سرري، انشقاق البطن الخلقي). السائل الذي يحيط بالجنين (AF) الخلايا هي بسيطة للحصول عليه من إجراءات المقرر بشكل روتيني خلال الثلث الثاني من الحمل (أي بزل السلى وamnioreduction) أو العمليات القيصرية 1 و 2. توافر خلايا AF من المرضى قبل الولادة وحديثي الولادة يوفر إمكانية استخدام هذا المصدر للطب التجديدي، والتحقيق في العديد من الباحثين إمكانية لعلاج الأضرار الأنسجة المختلفة أو الأمراض باستخدام السكان الخلايا الجذعية المعزولة من AF 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12. إمكانية الحصول بسهولة خلايا AF من المرضى المريضة، في إطار الوقت الذي المرض غالبا ما يكون ثابتا، يفتح الطريق أمام فكرة استخدام هذا المصدر خلية لأغراض إعادة برمجة. في الواقع، الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا المشتقة من الخلايا AF يمكن أن تكون متباينة في خلايا الفائدة للفي المختبر لاختبار المخدرات أو نهج هندسة الأنسجة، من أجل إعداد العلاج المناسب المريض محددة قبل الولادة. وقد أظهرت العديد من الدراسات بالفعل قدرة الخلايا AF إلى إعادة برمجة ومتباينة في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 13، 14، 15، 16، 17 </ سوب>، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26، 27.

منذ اكتشاف تاكاهاشي وياماناكا 28 من الخلايا الجسدية إعادة برمجة من خلال التعبير القسري لأربعة عوامل النسخ (Oct4، Sox2، cMyc وKlf4)، أحرز تقدم في مجال إعادة برمجة. النظر في طرق مختلفة، يمكننا أن نميز بين النهج الفيروسية وغير الفيروسية. أول تتوقع استخدام ناقلات فيروسية (الفيروسات القهقرية وlentiviruses)، التي لديها كفاءة عالية ولكن إسكات عادة ناقصة من التحوير فيروسات، مع كل ما يترتب من خط الخلايا المعاد برمجتها جزئيا وخطرالطفرات 29، 30، 31 إقحامي. يستخدم الأسلوب غير الفيروسية استراتيجيات مختلفة: البلازميدات أي ناقلات، مرنا والبروتين والترانسبوزونات. ويهدف اشتقاق خلايا الجذع خالية من متواليات المعدلة وراثيا للالتفاف على الآثار الضارة المحتملة من التعبير التحوير المتسرب والطفرات إقحامي. ومن بين جميع الاستراتيجيات غير الفيروسية المذكورة أعلاه، وPiggyBac (PB) نظام ينقول / ترانسبوزاز يتطلب فقط يكرر محطة مقلوب المرافقة التحوير والتعبير عابرة للانزيم ترانسبوزاز لتحفيز الإدراج أو الختان أحداث 32. ميزة في استخدام الترانسبوزونات على الطرق الأخرى لتوليد خلايا الجذع هي إمكانية الحصول على خلايا الجذع خالية من ناقلات مع نهج ناقلات غير الفيروسية التي تظهر بنفس الكفاءة ناقلات فيروسات. وهذا ممكن عن طريق الاستئصال أقل أثر للترميز ينقول متكامل لreprogramming العوامل التالية تعبير عابر الجديد للترانسبوزاز في خلايا الجذع 33. وبالنظر إلى أن PB غير فعالة في مختلف أنواع الخلايا 34، 35، 36، 37، هو أكثر ملاءمة للنهج السريرية فيما يتعلق النواقل الفيروسية، ويسمح لإنتاج خلايا الجذع خالية من XENO يتعارض مع بروتوكولات إنتاج الفيروسية الحالية التي تستخدم أجنبي بيولوجيا الشروط، يتم استخدام هذا النظام للحصول على خلايا الجذع من الفئران AF.

نحن هنا اقتراح بروتوكول مفصلة بعد العمل التي سبق نشرها لإظهار إنتاج الحيوانات المستنسخة الجذع المحفزة من خلايا AF الماوس (خلايا الجذع-AF) 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات وفقا للقانون الإيطالي. تم حصادها عينات الفئران AF من الفئران الحوامل بنسبة 13.5 في أيام تال للجماع (DPC) من C57BL / 6-TG (UBC-GFP) 30Scha / J الفئران دعا GFP.

الإنتاج 1. ينقول

ملاحظة: تم إنشاؤها ناقلات التعبير ينقول باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية. تم إعداد البلازميد فأرة الحاسوب AF خلايا ترنسفكأيشن باستخدام مجموعات تجارية.

  1. مزيج 10 نانوغرام من البلازميد مع 50 ميكرولتر من البكتيريا DH5α في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. احتضان أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  2. الصدمة الحرارية في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية.
  3. وضع أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  4. إضافة 250 ميكرولتر من قبل تحسنت (37 ° C) مرق استذابة مرق (LB). تهز (300 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. نشر 30 ميكرولتر من كل تحول على لوحات LB مع 0.1 ملغ / مل الأمبيسلين. السماح لوحات لتجف واحتضان مقلوب عند 37 درجة مئوية اوفernight.
  6. في اليوم التالي، في فترة ما بعد الظهر، واختيار 3 المستعمرات، وذلك باستخدام معقم 200 نصائح ميكرولتر من كل تحول ونقل على 0.1 ملغ / مل LB أمبير.
  7. تهز (300 دورة في الدقيقة) البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  8. لتنقية البلازميد استخدام مجموعات تجارية. البلازميدات السهم عند -20 درجة مئوية.

2. الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF) الثقافة

  1. طلاء لوحات 6 بشكل جيد مع 0.1٪ الجيلاتين
    1. لوحات معطف تحت غطاء محرك السيارة بإضافة 1 مل من العقيمة الجيلاتين 0.1٪ إلى كل من الآبار الستة. دع الجيلاتين تتبلمر في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
    2. تجاهل الزائدة، وتجف لوحات لمدة 1 ساعة.
    3. استخدام بارافيلم لاغلاق ووحات تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. تثبيط MEF مع ميتوميسين C
    1. ذوبان الجليد قارورة من 4 × 10 6 خلايا MEF باستخدام C حمام 37 درجة.
    2. البذور MEF في غطاء محرك السيارة على طبق بيتري (150 ملم) مع المتوسط ​​MEF.
    3. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    4. (تنبيه) إضافة ميتوميسين C (5 ملغ / مل) عندما الخلايا متموجة.
    5. مكان الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 3 ساعات.
    6. إزالة المتوسطة مع خلايا ميتوميسين جيم غسل ثلاث مرات مع المياه المالحة عازلة 1X الفوسفات (PBS).
    7. إضافة 2 مل من الخلايا التربسين ومكان التجارية في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد إضافة 18 مل من عرقلة المتوسطة لوقف رد الفعل التربسين.
    8. عد الخلايا باستخدام غرفة burker وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    9. خلايا الطرد المركزي في 145 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
    10. البذور 60000 خلية / سم 2 من المعطل MEF على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحات.
    11. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، قبل البذر AF و / أو خلايا الجذع-AF.

3. ماوس AF عزل الخلايا

  1. إعداد التزاوج في الوقت المناسب وتحقق PLU المهبلع بعد 24 ساعة من شارك في السكن.
  2. بمراعاتها حتى 13.5 DPC والتضحية السد حامل عن طريق خلع عنق الرحم.
  3. تنظيف جدار البطن للحيوان باستخدام الايثانول 70٪.
  4. باستخدام مقص، تنفيذ البطن خط الوسط عمل قطع في طول جدار البطن للوصول إلى تجويف البطن.
  5. فضح الرحم باستخدام ملقط. إزالة الرحم باستخدام مقص ونقل إلى صحن 100 ملم بيتري مليئة العقيمة وضعت برنامج تلفزيوني 1X على الجليد.
  6. استخدام مجهر تشريحي لجمع AF في 10X التكبير.
  7. عقد الرحم مع ملقط وإزالة جدار الرحم مع مقص. كن حذرا لتجنب أي ضرر للأغشية الجنين ويترتب على ذلك تسرب السائل الذي يحيط بالجنين.
  8. جمع الأجنة في صحن 100 ملم بيتري مليئة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X ووضع على الجليد.
  9. فهم المشيمة الجنين واحد مع ملقط غرامة نقطة ومكان في 100 مم طبق بيتري نظيفة.
  10. إزالة الكيس المحي باستخدام ملقط غرامة نقطة.
  11. بعد جمع AF، وغسل كل جنين مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X تستكمل مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) وجمع في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على AF.
  12. الطرد المركزي AF في 145 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف تحت غطاء محرك السيارة والبذور الخلايا AF مكعبات.

زراعة الخلايا 4. ماوس AF

  1. بذر خلايا الفأر AF
    1. قبل يوم واحد من البذر، وإعداد 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحة 6 جيدا مع MEF تعامل C-ميتوميسين.
    2. بعد جمع AF، البذور الخلايا التي تم الحصول عليها من بزل السلى (حوالي 1 × 10 7 خلايا التي تم الحصول عليها من الأجنة 6) على MEF المعطل ميتوتيكلي باستخدام AF مستنبت.
    3. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، وتغيير المتوسط كل يوم.
    4. بعد 7 أيام من الثقافة، عبرخلايا fect AF باتباع الإجراء هو موضح أدناه.

5. ترنسفكأيشن، IPS-AF الجيل خلية والثقافة

و transfected خلايا الفأر AF مع ينقول البلازميد PB-tetO2-IRES-OKMS، جنبا إلى جنب مع البلازميد التعبير ترانسبوزاز (mPBase) ومع transactivator التتراسيكلين العكسية (PB-CAG-rtTA) البلازميد ينقول: ملاحظة. وتم تزويد جميع البلازميدات البروفيسور أندراس ناجي 33.

  1. مزيج 1 ميكروغرام من PB-tetO2-IRES-OKMS مع 0.5 ميكروغرام من mPBase و 0.5 ميكروغرام من PB-CAG-rtTA (عدد الحمض النووي: 2 ميكروغرام) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. تمييع DNA إلى 100 ميكرولتر مع المصل خالية المتوسطة (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة - DMEM).
  3. إضافة 8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن (على سبيل المثال، FUGENE) (في نسبة البلازميد: وكيل ترنسفكأيشن من 2 ميكروغرام (DNA) إلى 8 ميكرولتر وكيل ترنسفكأيشن) في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على الحمض النووي.
  4. احتضان ترنسفكأيشن خليط كاشف / الحمض النووي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة قطرة قطرة 100 ميكرولتر من خليط ترنسفكأيشن الكاشف / الحمض النووي لكل بئر لوحة 6 جيدا مع خلايا AF الماوس وتوزيعها من قبل يحوم طيف، مع الحجم النهائي من 2 مل / جيد. يترك لمدة 24 ساعة.
  6. في اليوم التالي، حمل التعبير عن العوامل ياماناكا في (Oct4، Klf4، cMyc، Sox2) عن طريق تغذية الخلايا مع المتوسط ​​الطازجة IPS-AF تستكمل مع 1.5 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين (2 مل من وسائل الإعلام لكل بئر).
  7. تغذية الخلايا كل يوم، دون مرور، مع المتوسطة التي تحتوي على دوكس جديدة (الحفاظ على خلايا في وسائل الإعلام تستكمل مع الدوكسيسيكلين حتى نقطة 5.13).
  8. مراقبة الخلايا خلال 24 ساعة للتعبير عن mCherry ويوميا لتشكيل مستعمرة (تظهر المستعمرات عادة بين 20 و 30 يوما بعد ترنسفكأيشن).
  9. قبل يوم واحد قطف مستعمرة، وإعداد لوحة 96-جيدا زراعة الأنسجة مع MEF تعامل C-ميتوميسين.
  10. اختيار المستعمرات واحد في 50 ميكرولتر من حجم النقيبالجا 200 ميكرولتر ماصة، ونقلها بالتتابع في لوحة 96-جيدا في الآبار الفردية.
  11. في اليوم التالي، تنأى كل مستعمرة في الخلايا واحد عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من التربسين التجاري واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  12. ماصة صعودا وهبوطا إلى تفصيل مستعمرة.
  13. نقل 50 ميكرولتر من التربسين التي تحتوي على مستعمرة فصلها في بئر جديد مع المعطل MEF على الجيلاتين 0.1٪ المغلفة 96 جيدا لوحة مليئة 100 ميكرولتر من الطازجة المتوسطة الجذع-AF تستكمل مع الدوكسيسيكلين.
  14. عندما تصل خلايا 60-70٪ التقاء، تقسيم في بئر من 24 لوحة جيدا.
  15. عندما تصل خلايا 60-70٪ التقاء، وتقسيم 1: 2 لبئرين، واحدة مع الدوكسيسيكلين والآخر دون الدوكسيسيكلين، للتحقق من ظهور المستعمرات أيضا في حالة دون الدوكسيسيكلين.
  16. الاستمرار في الحفاظ على استنساخ الجذع-AF، الدوكسيسيكلين مستقل، على المعطل MEF في المتوسط ​​IPS-AF.
  17. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية و CO 2، 5٪ الفصلanging المتوسط ​​يوميا.

6. الفوسفاتيز القلوية تلطيخ

  1. أداء القلوية تلطيخ الفوسفاتيز التالية بروتوكول الشركة المصنعة كلما كان هناك ظهور الدوكسيسيكلين خلايا الجذع-AF مستقلة.

7. المناعي

  1. كلما كان هناك ظهور الدوكسيسيكلين خلايا مستقلة IPS-AF، البذور 150000 خلية / سم 2 على بئر من 24 لوحة جيدا مع المعطل MEF، وتنمو الخلايا لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪.
  2. (تنبيه) إصلاح الخلايا بإضافة 300 ميكرولتر لكل بئر من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 300 ميكرولتر من 0.1٪ NP-40 إلى permeabilize الخلايا.
  4. شطف الخلايا مع 300 ميكرولتر من 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين 20.
  5. إضافة 300 ميكرولتر من عازلة تمنع (مصل الحصان 10٪ في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: Oct4 (1:80)، Sox2 (1:80)، Klf4 (1:80)، NANOG (1:100) وSSEA1 (1:80). تمييع SSEA1 مع 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 10٪ العادي مصل الماعز، 0.3 M الجلايسين في 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20. تمييع كل الأضداد الأخرى مع مصل الحصان 10٪ في برنامج تلفزيوني 1X.
  7. احتضان الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. شطف مع 300 ميكرولتر من 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20.
  9. استخدام الأجسام المضادة الثانوية المخفف في مصل الحصان 10٪ في برنامج تلفزيوني 1X: الماعز Alexa594 مترافق المضادة للماوس مفتش (1: 200)، Alexa594 مترافق الدجاج مكافحة الماعز مفتش (1: 200)، Alexa594 مترافق الدجاج المضادة للأرنب مفتش (1: 200)، الماعز Alexa568 مترافق المضادة للماوس الغلوبولين المناعي (1: 200). احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X.
  11. نوى وصمة عار مع حل هويشت (1: 10000) في برنامج تلفزيوني 1X.

8. في المختبر تمايز الخلايا

  1. لتشكيل شنقا انخفاض الهيئات مضغي (EBS)، وزراعة قطرات واحدة (2000 خلية / 20 ميكرولتر) على غطاء من أطباق بتري، وذلك باستخدام وسيلة التمايز.
  2. احتضان الأطباق في 37 ° Cو 5٪ CO 2 لمدة 4 أيام.
  3. نقل EBS إلى 100 ملم أطباق الصف البكتيري في الثقافة تعليق لمدة 3 أيام في المتوسط ​​التمايز.
  4. EBS لوحة في 24 جيدا لوحات المغلفة مع مصفوفة الغشاء القاعدي (مخفف 01:10 في DMEM) لمدة 14 يوما أخرى.
  5. ليحلل المناعي، استخدام الأجسام المضادة الأولية: T (1: 100)، αfp (1: 200) وTubb3 (1: 500) 37.

9. في فيفو مسخي تشكيل

  1. ضخ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 1 × 10 6 خلايا الجذع-AF في العضلات من hindlimb من Rag2 - / - γc - / - الفئران.
  2. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم بعد 6 أسابيع حقن الخلايا.
  3. إزالة ورم الجماهير، تتميز حجمها، من hindlimb من الفئران لالتحليلات التالية.
  4. قطع 7-10 ميكرون المقاطع العرضية سميكة من ورم نظير البنتان المجمدة باستخدام ناظم البرد.
  5. لHaematoxylin لد يوزين (سعادة) وصمة عار:
    1. وصمة عار مع سعادة لتقييم تكوين أنسجة الورم، بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  6. لوصمة عار المناعي:
    1. إصلاح أقسام مسخي مع PFA 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. Permeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة التالية: Tubb3 (1: 100)، αfp (01:50) وαSMA (1: 100) المخفف في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية (لTubb3) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (للأجسام أخرى).
  8. البيروكسيديز كتلة باستخدام الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة.
  9. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس-HRP مترافق (1: 150).
  10. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X.
  11. احتضان مع البيروكسيديز (HRP) الركيزة (انظر الجدول مواد) لمدة 5 دقائق.
  12. شطف مع مياه الصنبور لمدة 5 دقائق.
  13. وصمة عار مع Haematoxylin QS لمدة 9 ثانية.
  14. شطف مع مياه الحنفية.
    15. 10. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا

    1. استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي التجارية وفقا لبروتوكول أوصت الشركة الصانعة.

    11. استخراج الحمض النووي الريبي من ورم مسخي

    1. التجانس مسخي باستخدام مدقة والنيتروجين الهاون وسائل لتجنب ذوبان العينة.
    2. تزن 25 ملغ من الأنسجة.
    3. إضافة 1 مل من كاشف التجاري لاستخراج الحمض النووي الريبي و 200 ميكرولتر من كلوروفورم.
    4. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. نقل طاف مسح لأنبوب جديد.
    7. لتنقية الحمض النووي الريبي استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

    12. عكس النسخ، البلمرة تحليل سلسلة من ردود الفعل

    1. توليف [كدنا أول حبلا باستخدام الناسخ العكسي للالنسخ العكسي (RT) سلسلة -polymerase رد فعل (PCR) وبنسبة ضئيلة (DT) أكوردينغ لبروتوكول الشركة المصنعة، للحصول على 50 نانوغرام / ميكرولتر من [كدنا]. تمييع [كدنا بالماء ريبونوكلياز خالية بتركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. أداء RT-PCR باستخدام البلمرة DNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وذلك باستخدام 1 نانوغرام / ميكرولتر من [كدنا].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتقييم قدرة برمجة، جمعت خلايا فأر AF من أجنة الفئران GFP. و transfected الخلايا مع ينقول بلازميد دائري PB-tetO2-IRES-OKMS، والذي يعبر عن العوامل ياماناكا (Oct4، Sox2، cMyc وKlf4) يرتبط بروتين فلوري mCherry بطريقة الدوكسيسيكلين محرض، وعكس التتراسيكلين transactivator (PB- CAG-rtTA) البلازميدات جنبا إلى جنب مع البلازميد التعبير ترانسبوزاز (mPBase). و transfected خلايا فأر AF مع Oct4، Klf4، cMyc وSox2 بعد 1 أسبوع في المختبر التوسع على طبقة المغذية MEF. للتعبير عن العوامل الخارجية، وأضيف الدوكسيسيكلين بعد يوم من ترنسفكأيشن بتركيز 1.5 ميكروغرام / مل، كما هو موضح سابقا 39. كان التعبير عن mCherry مرئية بعد 24 ساعة من إضافة الدوكسيسيكلين، مشيرا إلى ترنسفكأيشن. أول المستعمرات مع وفاق مثل التشكل ظهرت بعد 20 يوما دوكستم القبض على تحريض ycycline و 30 يوما بعد ترنسفكأيشن. تم المصنف هذه المستعمرات على طبقات الخلايا الليفية المغذية المعطل. بعد حصوله، والحفاظ على الحيوانات المستنسخة على قيد الحياة في المتوسط تستكمل مع الدوكسيسيكلين لبعض الممرات حتى وجدت لتكون الدوكسيسيكلين مستقل في الآبار منسوخة 33.

تم تقييم استنساخ الفئران IPS-AF لمعايير مختلفة: التعبير mCherry، القلوية تلطيخ الفوسفاتيز، والتعبير البروتين من علامات تعدد القدرات Oct4، Sox2، Klf4، NANOG وSSEA1، التعبير عن الجينات تعدد القدرات خارجية وداخلية (Oct4، Klf4، cMyc وSox2) ، في المختبر (EBS) والحية (مسخي مقايسة) التمايز. أنها استوفت جميع معايير تقييم للتحقق من صحة تعدد القدرات الخاصة بهم، كما هي ملخصة في الشكل 1.

شكل 1
الشكل 1: إعادة برمجة الماوس AF GFP + الخلايا. وكانت (A) دوكسي المستعمرات مستقلة من الجذع-AF GFP + الخلايا السلبية للتعبير عن mCherry وإيجابية لتلطيخ الفوسفاتيز القلوية (ALP). الحانات النطاق = 250 ميكرون، و 100 ميكرون. (ب) صور الممثل من الخلايا مستقرة IPS-AF مستقل الدوكسيسيكلين GFP + معربا عن Oct4، Sox2، NANOG، Klf4 وSSEA1. شريط مقياس = 100 ميكرون. (ج) تحليل RT-PCR للتعبير عن الخارجية (الاشعال ناقلات القائم، تيراغرام) والذاتية (Oct4، Klf4، cMyc وSox2) الجينات. اعتبر بيتا 2-المكروغلوبولين (B2M) باسم الجينات التدبير المنزلي. كانت تزرع خطوط الخلايا المعاد برمجتها في وجود (+) أو غياب (-) (96 ساعة) من الدوكسيسيكلين. واستخدمت خلايا R1 ES كمجموعة تحكم. (تم تعديل وحة PCR من بيرتن وآخرون (38). (D) مظهر الإجمالي من مسخي تم الحصول عليها بعد 6 أسابيع من الحقن من الجذع-AF GFP + الخلايا في الأطراف الخلفية من Rag2 - / - γc - / - الماوس. (E) الأنسجة مسخي والمناعية وأكد تمايز الخلايا في جميع طبقات جرثومية ثلاثة (الأديم الظاهر، الأديم المتوسط والأديم الباطن). αfetoprotein (ا ف ب، الأديم)، تم الكشف عن αsmooth العضلات الأكتين (αSMA، الأديم المتوسط)، وβ3 تويولين (Tubb3، الأديم الظاهر) في الجماهير الورم. شريط مقياس = 100 ميكرون. (F) تحليل RT-PCR من EBS ومسخي (تي). C +، مراقبة إيجابية. المجلس الوطني الانتقالي، ومراقبة غير القالب. فيمنتين (فيم، الأديم المتوسط)، αfetoprotein (ا ف ب، الأديم) وβ3 تويولين (Tubb3، الأديم الظاهر). (تم تعديل وحة PCR من مرجع 38). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة اختيار الحصول على تحريض تعدد القدرات هي ذات الصلة لسلامة الخلية السريرية فيما يتعلق زرع المدى الطويل. في الوقت الحاضر، هناك العديد من الطرق المناسبة لإعادة برمجة. ومن بين الأساليب غير التكاملية، والفيروسي (SEV) ناقلات سينداي هو فيروس RNA التي يمكن أن تنتج كميات كبيرة من البروتين دون الاندماج في نواة الخلايا المصابة 40 ويمكن أن يكون استراتيجية للحصول على خلايا الجذع. ناقلات SEV يمكن أن يكون مرشحا جذابا لتوليد خلايا الجذع متعدية الصف، ولكنه يقدم بعض أوجه القصور. والمتنسخة الفيروسية حساسة لطبيعة تسلسل المعدلة وراثيا. منذ ناقلات SEV تكرار جوهري، فإنها يمكن أن يكون من الصعب القضاء عليها من الخلايا المضيفة، حتى في حالة استخدام استراتيجيات مختلفة لتحسين هذا الجانب 41، 42. فإنه يتطلب معالجة خاصة، مثل خزانة السلامة البيولوجية المستوى 2. أنا هنالكق واحدة فقط بائع التجاري المتاحة. هناك النقص الحالي في SEV الصف السريرية لإعادة البرمجة وهناك ارتفاع تكاليف إنتاج خلايا الجذع.

بسبب هذه الجوانب، ويمكن اعتبار نظام ينقول نهج أفضل فيما يتعلق ناقلات SEV، وهنا علينا أن ننشئ أن هذا النظام هو وسيلة مناسبة لإعادة برمجة خلايا AF الفأر مع مزايا مختلفة. وهو يتيح للإنتاج خلايا الجذع xenofree خلافا للبروتوكولات إنتاج الفيروسية الحالية التي تستخدم الظروف أجنبي بيولوجيا. انه ليس لديها الحواجز القائمة بين الأنواع واضح، ولها القدرة على نقل البضائع التحوير أكبر من الفيروسات. لأنها تتيح تسليم بسيطة وآمنة من الترانسبوزونات البلازميد من خلال استخدام الطريقة القياسية خلية ترنسفكأيشن، والتي يمكن أن يؤديها بسهولة في كل مختبر مجهز مع خزانة السلامة البيولوجية المستوى 1. يسمح ترانسبوزاز إعادة التعبير عن إزالة العناصر PB مع ما يستتبع ذلك الجيل من الماوس والجذع الإنسان خلايا خالية من البصمة، كما هو موضح في مختلف مخطوط ليرة لبنانية 32 و 34 و 35. وأظهرت دراسات مختلفة أن الأنظمة ينقول تعرض أدنى تردد في استهداف بالقرب الجينات المرتبطة بالسرطان وأقل تحيزا في استهداف الجينات النشطة مقارنة مع ناقلات القائم الفيروسية 43، 44، 45، 46، 47. إعادة برمجة تستند إلى الترانسبوزونات يعتمد على طريقة تسليم المختار، وهذا هو قيد بسبب المقاومة أو سمية المتصلة بأساليب الحمض النووي ترنسفكأيشن (lipofection، Electroporation للأو nucleofection). نحن هنا استخدام صيغة غير liposomal مصممة ل transfect DNA التي عملت بشكل جيد مع خلايا فأر AF. إذا استخدمت الخلايا الأخرى، واختبارات يكون من الضروري استخدام أفضل طريقة التسليم من حيث كفاءة عالية ومنخفضة السمية. محاكمة، يعتبر طريقة ينقول PB أن يكون آمناد انخفاض التكلفة ولكن بكفاءة أقل مقارنة مع ناقلات SEV.

وفيما يتعلق الإجراء للحصول على خلايا الفأر AF، فمن الأهمية بمكان أن يكون حاملا إناث الفئران المتاحة. على هذا النحو، فمن الضروري إنشاء عدد كاف من التزاوج (لا يقل عن ستة من الإناث مع اثنين من الإناث لكل من الذكور).

يمكن إجراء المزيد من التجارب على وجه التحديد على خلايا AF الإنسان على إنتاج خلايا الجذع من الأجنة السليمة والمريضة. وبالنظر إلى مجموعة واسعة من الأمراض الخلقية التي يمكن الكشف عنها من خلال التشخيص قبل الولادة، والخلايا التي تم الحصول عليها من AF أثناء الحمل يمثل أفضل مصدر لاستخلاص خلايا الجذع لهما يدرسان المرض 48 وأيضا للتخطيط لنهج الطب التجديدي في حالة وجود عيوب الأنسجة مثل القلب أو العضلات والهيكل العظمي 49 و 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 120، الأمنيوسي الخلايا السوائل، والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة، PiggyBac ينقول والطب التجديدي، برمجة، الماوس.
إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin,… More

Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter