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Developmental Biology

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/54598
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Introduction

Diagnóstico pré-natal é uma importante ferramenta clínica para avaliar doenças genéticas (ou seja, aberrações cromossômicas, doenças monogenéticos ou poligenéticos / multifactorial) e malformações congênitas (hérnia diafragmática congênita ou seja, lesões pulmonares císticas, onfalocele, gastrosquise). As células do líquido amniótico (AF) são simples de se obter a partir de procedimentos de rotina programadas durante o segundo trimestre de gravidez (ou seja, a amniocentese e amnioreduction) ou cesarianas 1, 2. A disponibilidade de células pré-natais de FA a partir de pacientes ou de neonatais proporciona a possibilidade de utilizar esta fonte para a medicina regenerativa, e vários investigadores investigaram a possibilidade de tratar diferentes doenças ou danos de tecidos utilizando uma população de células estaminais isolado a partir de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. A possibilidade de obter facilmente células AF de pacientes doentes, em uma janela de tempo em que a doença é muitas vezes parado, abre o caminho para a idéia de usar esta fonte de células para fins de reprogramação. Na verdade,-tronco pluripotentes induzidas (iPS células) derivadas de células AF poderia ser diferenciadas em células de interesse para testes in vitro de droga ou de abordagens de engenharia de tecidos, a fim de preparar uma terapia adequada e específica no paciente antes do parto. Muitos estudos já demonstraram a capacidade das células AF de ser reprogramado e diferenciadas em uma ampla gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Desde a descoberta por Takahashi e Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas através da expressão forçada de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4), os progressos têm sido feitos no campo da reprogramação. Considerando os diferentes métodos, pode-se distinguir entre as abordagens virais e não virais. A primeira espera que o uso de vectores virais (retrovírus e lentivírus), que têm alta eficiência, mas geralmente incompleta silenciamento do transgene retroviral, tanto com a consequência de uma linha de células parcialmente reprogramados e o risco deinserção mutagênese 29, 30, 31. O método não-viral utiliza diferentes estratégias: isto é, plasmídeos, vectores, ARNm, proteína, transposões. A derivação de células iPS livres de sequências transgênicas visa contornar os efeitos potencialmente prejudiciais de expressão do transgene gotejante e mutagénese de inserção. Entre todos os mencionados estratégias não-virais acima, a piggyBac (PB) sistema de transposão / transposase requer apenas as repetições terminais invertidas flanqueiam um transgene e a expressão transiente da enzima transposase para catalisar a inserção ou excisão eventos 32. A vantagem na utilização de transposões sobre outros métodos para a geração de células IPS é a possibilidade de obtenção de células iPS livre do vector com uma abordagem de vector não virai, que mostra a mesma eficiência de vectores retrovirais. Isto é possível por excisão-traço inferior da codificação de transposão integrada para a reprogramming factores na sequência de uma nova expressão transitória da transposase nas células iPS 33. Dado que o OP é eficaz em diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, é mais adequado para uma abordagem clínica no que diz respeito aos vectores virais, e permite a produção de células iPS livre de xeno contrariamente aos protocolos de produção virais correntes que usam xenobióticos condições, este sistema é usado para obter as células iPS a partir AF murino.

Aqui propomos um protocolo detalhado seguintes trabalhos já publicados para mostrar a produção de clones iPS pluripotentes a partir de células AF rato (células iPS-AF) 38.

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Protocol

Todos os procedimentos estavam de acordo com a lei italiana. amostras murino AF foram colhidas a partir de ratos grávidas em 13,5 dias post coitum (DPC) de camundongos C57BL / 6-Tg camundongos (UBC-GFP) 30Scha / J chamada GFP.

Produção 1. Transposon

NOTA: Os vectores de expressão transposões foram gerados utilizando procedimentos de clonagem padrão. O DNA de plasmídeo para a transfecção de células de rato AF foi preparado utilizando-se kits comerciais.

  1. Misturar 10 ng de ADN de plasmídeo com 50 uL de bactérias DH5a num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar o tubo de microcentrifugadora em gelo durante 20 min.
  2. O choque térmico a 42 ° C durante 40 seg.
  3. Coloque tubo de microcentrifugadora em gelo durante 2 min.
  4. Adicionar 250 ul de caldo pré-aquecido (37 ° C) caldo lisogenia (LB). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min.
  5. Espalhe 30 ul de cada transformação em placas LB com 0,1 mg / ml de ampicilina. Permitir que as placas para secar e incubar invertida a 37 ° C OVernight.
  6. No dia seguinte, na parte da tarde, escolher 3 colónias, usando estéreis 200 dicas ul, de cada transformação e transferir para 0,1 mg / ml de LB amp.
  7. Agitar bactérias (300 rpm) durante a noite a 37 ° C.
  8. Para a purificação do plasmídeo usar kits comerciais. plasmídeos de Stock a -20 ° C.

2. embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEF) Cultura

  1. Revestimento das placas de 6 poços com 0,1% de gelatina
    1. revestir placas sob o capô adição de 1 ml de solução estéril de gelatina a 0,1% a cada um dos seis poços. Deixe a gelatina polimerizar na incubadora (37 ° C) durante 1 h.
    2. Descartar o excesso, e secar as placas durante 1 hr.
    3. Use parafilme para vedar e armazenar as placas à temperatura ambiente.
  2. Inactivação de MEF com mitomicina C
    1. Descongelar um frasco de 4 x 10 6 células MEF usando um banho de 37 ° C.
    2. Semente MEF na capa em uma placa de Petri (150 mm) com meio MEF.
    3. Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
    4. (CUIDADO) Adicionar mitomicina C (5 mg / mL) quando as células estão confluentes.
    5. Colocar as células em uma incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) durante 3 h.
    6. Remova o meio de células com mitomicina C. Lavar três vezes com solução salina de tampão fosfato 1x (PBS).
    7. Adicionar 2 ml de tripsina as células e colocar em comerciais a 37 ° C incubadora durante 5 min. Depois, adicione 18 ml de meio de bloqueio para parar a reacção de tripsina.
    8. Contar as células utilizando uma câmara de Burker de acordo com o protocolo do fabricante.
    9. células centrifugar a 145 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante.
    10. Semente 60.000 células / cm 2 de MEF inactivado em placas revestidas com gelatina a 0,1%.
    11. Cultivar as células durante 24 h a 37 ° C e CO2 a 5%, antes da semeadura AF e / ou células IPS-AF.

3. Rato AF isolamento de células

  1. Configurar acasalamentos cronometrados e verificar plu vaginalgs após 24 h de co-habitação.
  2. Observe até 13,5 dpc e sacrificar barragem grávida por deslocamento cervical.
  3. Limpar a parede abdominal do animal, por meio de 70% de etanol.
  4. Com uma tesoura, realizar uma laparotomia mediana incisão do comprimento da parede abdominal para ter acesso para a cavidade abdominal.
  5. Expor o útero usando uma pinça. Remover o útero com uma tesoura e transferir para um prato de 100 milímetros de Petri estéril cheio com PBS 1x colocadas em gelo.
  6. Use uma lupa para recolher o AF em aumento de 10x.
  7. Segure o útero com uma pinça e retire a parede uterina com uma tesoura. Tenha cuidado para evitar qualquer dano às membranas fetais e consequente fuga de líquido amniótico.
  8. Recolha fetos em uma placa de Petri 100 milímetros preenchido com estéril 1x PBS e colocar no gelo.
  9. Segure a placenta de um feto com uma pinça fina ponto e lugar em um 100 milímetros placa de Petri limpa.
  10. Retire o saco vitelino usando uma pinça de ponta fina.
  11. Após a recolha de AF, lavar cada feto com PBS estéril 1x suplementado com 1% de soro fetal de bovino (FBS) e recolher nas tubo de 15 ml contendo o AF.
  12. Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante sob o capô e semear as células AF peletizadas.

Cultura de Células 4. Rato AF

  1. Semeadura de células de camundongo AF
    1. Um dia antes da semeadura, preparar uma solução a 0,1% placa de 6 poços revestidos com gelatina com MEF tratado com mitomicina C.
    2. Após a coleta AF, semear as células obtidas a partir de uma amniocentese (cerca de 1 x 10 7 células obtidas a partir de 6 fetos) sobre o MEF mitoticamente inactivados utilizando meio de cultura AF.
    3. Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2, mudando o meio todos os outros dias.
    4. Após 7 dias de cultura, transcélulas fect AF seguintes o procedimento descrito abaixo.

5. A transfecção, geração de células iPS-AF e Cultura

NOTA: As células de ratinho AF foram transfectadas com o plasmídeo transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, em conjunto com um plasmídeo de expressão de transposase (mPBase) e com o transactivador de tetraciclina reversa plasmídeo transposão (PB-CAG-rtTA). Todos os plasmídeos foram fornecidas pelo professor Andras Nagy 33.

  1. Misturar 1 ug de PB-tetO2-IRES-OKMS com 0,5 ug de mPBase e 0,5 ^ g de OP-CAG-rtTA (ADN total: 2? G) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Dilui-se o ADN a 100 uL de meio isento de soro (Dulbecco Modified Eagle Médium - DMEM).
  3. Adiciona-se 8 mL de reagente de transfecção (por exemplo, FuGENE) (na proporção de ADN de plasmídeo: O agente de transfecção de 2 ug (ADN) para o agente de transfecção de 8 uL) contendo o ADN em 1,5 mL tubo de microcentrífuga.
  4. Incubar mistura reagente / transfecção de DNA durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  5. Adicionar gota a gota 100 uL da mistura de reagentes de transfecção / ADN por poço para uma placa de 6 poços com células AF rato e distribuir por uma agitação suave, com um volume final de 2 mL / poço. Deixe por 24 h.
  6. No dia seguinte, induzirem a expressão de factores do Yamanaka (Oct4, KLF4, cMyc, Sox2), alimentando as células com meio fresco IPS-AF suplementado com 1,5 ug / ml de doxiciclina (2 mL de meio para cada poço).
  7. Alimentar as células a cada dia, sem passagem, por meio fresco contendo DOX (manter as células em meios suplementados com doxiciclina até que ponto 5.13).
  8. Observar células no prazo de 24 h para a expressão mCherry e diariamente para a formação de colónias (colônias aparecem normalmente entre 20 e 30 dias após a transfecção).
  9. Um dia antes da colheita de colónia, preparar uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com MEF tratado com mitomicina C.
  10. Escolha colónias individuais em 50 ul de volume de Utilizanga 200 uL pipeta, e transferi-los sequencialmente para uma placa de 96 poços, em poços individuais.
  11. No dia seguinte, dissociar cada colónia em células isoladas através da adição de 50 ul de tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  12. Pipeta cima e para baixo para desagregar a colônia.
  13. Transferir 50 uL da tripsina contendo a colónia dissociada em um novo bem com MEF inactivada numa gelatina 0,1% revestidos de 96 poços da placa cheia com 100 uL de meio de IPS-AF fresco suplementado com doxiciclina.
  14. Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas em um poço de uma placa de 24 poços.
  15. Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas 1: 2 a dois poços, uma com a doxiciclina e o outro sem doxiciclina, para verificar se colónias aparecem também na condição sem doxiciclina.
  16. Continuar a manter clones iPS-AF, doxiciclina independente, em MEF inativada no meio iPS-AF.
  17. Células a 37 ° C e 5% de CO 2, CH cultivaranging média diária.

6. Coloração de Fosfatase Alcalina

  1. Realização da coloração da fosfatase alcalina seguindo o protocolo do fabricante, sempre que haja o aparecimento de células IPS-AF independentes doxiciclina.

7. imunofluorescência

  1. Sempre que haja o aparecimento de doxiciclina células independentes IPS-AF, sementes 150.000 células / cm2 em um poço de uma placa de 24 poços com MEF inactivado, e crescer as células durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. (CUIDADO) Fixar as células por adição de 300 ul por poço de 4% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min à temperatura ambiente.
  3. Adicionar 300 uL de 0,1% de NP-40 para permeabilizar as células.
  4. Lavar as células com 300 uL de 0,1% de PBS-Tween 20.
  5. Adicionar 300 ul de tampão de bloqueio (soro de cavalo a 10% em 1x PBS) durante 1 h à temperatura ambiente.
  6. Utilize os seguintes anticorpos primários: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), KLF4 (1:80), NANOG (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 com 1% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,3 M de glicina em 0,1% PBS-Tween-20. Dilui-se todos os outros anticorpos com soro de cavalo a 10% em PBS 1x.
  7. Incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C.
  8. Lavar com 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20.
  9. Use os anticorpos secundários diluídos em soro de cavalo a 10% em PBS 1x: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratinho (1: 200), IgG de galinha anti-cabra Alexa594-conjugado (1: 200), Alexa594-conjugado de galinha anti-IgG de coelho (1: 200), Alexa568 de cabra conjugado com anti-rato de IgM (1: 200). Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
  10. Enxágüe com 1x PBS.
  11. núcleos mancha com solução de Hoechst (1: 10.000) em 1x PBS.

8. In Vitro Cell Differentiation

  1. Para formar pendurados gota corpos embrióides (EBS), cultivar gotas individuais (2.000 células / 20 ul) sobre a tampa da placa de Petri, utilizando o meio de diferenciação.
  2. Incubar os pratos a 37 ° Ce 5% de CO 2 durante 4 dias.
  3. Transferir EBs em 100 mm pratos de grau bacteriana na cultura em suspensão durante 3 dias em meio de diferenciação.
  4. EBs prato em 24 poços, placas revestidas com matriz de membrana basal (diluído 1:10 em DMEM) durante mais 14 dias.
  5. Para as análises de imunofluorescência, usam anticorpos primários: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37.

9. Formação In Vivo teratoma

  1. Injectar 100 ul de 1x PBS contendo 1 x 10 6 células IPS-AF no músculo do membro posterior de RAG2 - / - yc - / - ratos.
  2. Sacrificar os ratos por deslocamento cervical 6 semanas após a injeção de células.
  3. Retirar as massas tumorais, que se distinguem pelo seu tamanho, a partir do membro posterior de ratinhos para as análises seguintes.
  4. Cortar 7-10 uM secções transversais de espessura de tumor isopentano-congelado utilizando um criostato.
  5. Para Hematoxilina umd Eosina (HE) Stain:
    1. Mancha com HE para avaliar a composição do tecido do tumor, seguindo o protocolo do fabricante.
  6. Para Stain imunoperoxidase:
    1. Fix secções teratoma com PFA a 4% durante 15 min à temperatura ambiente.
    2. Permeabilizar com 0,1% de Triton X-100.
  7. Incubar com os anticorpos seguintes: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) e αSMA (1: 100) diluída em BSA a 1% em PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) ou durante a noite a 4 ° C (para os outros anticorpos).
  8. peroxidase de bloco utilizando metanol a 100% durante 20 min.
  9. Incubar durante 45 min a 37 ° C com anticorpo secundário conjugado com HRP (1: 150) anti-rato.
  10. Enxágüe com 1x PBS.
  11. Incubar com peroxidase de substrato (HRP) (Ver Materiais Tabela) durante 5 min.
  12. Lavar com água da torneira durante 5 min.
  13. Mancha com Hematoxilina QS para 9 seg.
  14. Lavar com água da torneira.
    15. 10. A extracção de ARN a partir de células

    1. Usar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

    11. A extracção de ARN a partir de teratoma

    1. Homogeneizar o teratoma usando um pilão e nitrogênio argamassa e líquidos para evitar o descongelamento da amostra.
    2. Pesar 25 mg de tecido.
    3. Adicionar 1 ml de reagente comercial para extração de RNA e 200 mL de clorofórmio.
    4. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    5. Centrifuga-se a 13000 xg e 4 ° C durante 15 min.
    6. Transferir o sobrenadante clarificado para um tubo novo.
    7. Para purificar o ARN utilizar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo do fabricante.

    12. Transcrição Reversa-polimerase Análise Chain Reaction

    1. Sintetizar a primeira cadeia de ADNc utilizando uma transcriptase reversa para a transcrição inversa (RT) -polimerase reacção em cadeia (PCR) e o oligo acor (dT)Ding com o protocolo do fabricante, para se obter 50 ng / uL de ADNc. Dilui-se com ADNc de água isenta de RNase na concentração de 10 ng / mL.
    2. Realizar RT-PCR utilizando a polimerase de ADN de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando 1 ng / uL de ADNc.

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Representative Results

Para avaliar a capacidade de reprogramação, as células do rato AF foram coletados de fetos de ratos GFP. As células foram transfectadas com o plasmídeo circular transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, que expressa os factores Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4) ligadas à proteína fluorescente mCherry de uma forma indutível doxiciclina, tetraciclina e transactivador reverso (PB- CAG-rtTA) os plasmídeos juntamente com o plasmídeo de expressão de transposase (mPBase). Células de ratinho transfectadas com FA foram Oct4, KLF4, cMyc Sox2 e após 1 semana de expansão in vitro sobre uma camada alimentadora de MEF. Para a expressão dos factores exógenos, doxiciclina foi adicionado um dia após a transfecção numa concentração de 1,5 ug / mL, como anteriormente descrito 39. A expressão do mCherry era visível depois de 24 h desde a adição de doxiciclina, indicando a transfecção. As primeiras colônias com morfologia ES-like apareceu 20 dias depois de doxindução ycycline e foram colhidos 30 dias após a transfecção. Estas colónias foram semeadas em camadas alimentadoras de fibroblastos inactivadas. Depois da colheita, os clones sobreviventes foram mantidas em meio suplementado com doxiciclina durante algumas passagens até Verificou-se que a doxiciclina independente em cavidades replicadas 33.

clones rato iPS-AF foram avaliados para diferentes parâmetros: expressão mCherry, coloração fosfatase alcalina, a expressão da proteína dos marcadores de pluripotência Oct4, Sox2, KLF4, NANOG e SSEA1, expressão de genes de pluripotência exógenos e endógenos (Oct4, KLF4, cMyc e Sox2) , in vitro (EBS) e in vivo (ensaio de teratoma) diferenciação. Eles cumpriram todos os critérios avaliados para validar a sua pluripotência, como resumidos na Figura 1.

figura 1
Figura 1: Reprogramação de rato AF GFP + células. (A) Doxiciclina colónias independentes de IPS-AF células GFP + foram negativos para a expressão de mCherry e positivo para a coloração da fosfatase alcalina (ALP). Barras de escala = 250 uM e 100 uM. (B) Imagens representativas de células iPS-AF independente de doxiciclina estáveis GFP + expressando Oct4, Sox2, Nanog, KLF4 e SSEA1. Barra de escala = 100 pm. (C) Análise de RT-PCR para a expressão de exógenos (iniciadores baseados em vectores, TG) e endógena (Oct4, KLF4, cMyc e Sox2) genes. Beta-2-microglobulina (B2M) foi considerado como um gene de manutenção. As linhas celulares foram reprogramadas crescidas na presença (+) ou ausência (-) (96 hr) de doxiciclina. R1 células ES foram utilizadas como um controlo. (Painel de PCR tem sido modificado a partir do Bertin et al 38. (D) a aparência bruta de teratoma obtido 6 semanas após a injeção de iPS-AF células GFP + nos membros posteriores de RAG2 - / - yc - / - mouse. (E) a histologia Teratoma e imunocoloração confirmou a diferenciação das células em todas as três camadas germinativas (ectoderma, mesoderme e endoderme). αfetoprotein (AFP, endoderme), αsmooth actina de músculo (αSMA, mesoderme) e β3 tubulina (Tubb3, ectoderma) foram detectados em massas tumorais. Barra de escala = 100 pm. (F) Análise RT-PCR da EBS e teratoma (Te). C +, controlo positivo; NTC, controle não-modelo. Vimentina (Vim, mesoderme), αfetoprotein (AFP, endoderme) e β3 tubulina (Tubb3, ectoderma). (Painel de PCR foi modificado a partir da referência 38). Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

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Discussion

O método escolhido para se obter a indução de pluripotência é relevante para segurança clínica célula no que diz respeito ao transplante a longo prazo. Hoje em dia, existem vários métodos adequados para a reprogramação. Entre os métodos de não-integrativos, a viral (SeV) Sendai vector é um vírus de ARN que pode produzir grandes quantidades de proteína, sem integração no núcleo das células infectadas e 40 podia ser uma estratégia para a obtenção de células iPS. vectores SeV poderia ser um candidato atraente para a geração de células iPS translacional-grade, mas apresenta algumas deficiências. A replicase virai é sensível à natureza das sequências transgénicas. Uma vez que os vectores SeV constitutivamente replicar, eles podem ser difíceis de eliminar as células hospedeiras, mesmo se diferentes estratégias são usados para melhorar este aspecto 41, 42. Ele requer tratamento especial, como uma cabine de segurança biológica de nível 2. Lá eué apenas um fornecedor comercial disponível. Há uma corrente de falta de SEV-grau clínico para a reprogramação e há altos custos de produção de células iPS.

Devido a estes aspectos, o sistema transposon pode ser considerada uma abordagem melhor no que diz respeito aos vetores SEV, e aqui nós estabelecemos que este sistema é um método adequado para reprogramação de células AF rato com várias vantagens. Ele permite a produção de células iPS xenofree contrários aos protocolos de produção virais atuais que usam condições xenobióticos. Não tem nenhuma barreira das espécies aparente e tem uma capacidade de carga maior do transgene vírus. Ele permite a entrega simples e segura de transposões de plasmídeos através da utilização do método de transfecção de células padrão, que pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório equipado com uma câmara de segurança biológica Nível 1. Transposase re-expressão permite a remoção de elementos PB com conseqüente geração de células de rato e iPS humanas sem pegada, como demonstrado em vários ceLL linhas 32, 34, 35. Diferentes estudos mostraram que os sistemas de transposões exibir uma frequência mais baixa na segmentação perto de genes relacionados com o cancro e menos preconceito na segmentação genes ativos em comparação com vetores virais baseados em 43, 44, 45, 46, 47. A reprogramação baseado em transposões depende do método de entrega escolhido e isto é uma limitação em virtude da resistência ou toxicidade relacionada com métodos de transfecção de ADN (lipofecção, electroporação ou Nucleofection). Aqui utilizou-se uma formulação não-lipossomal concebido para transfectar ADN que funcionou bem com células de rato AF. Se outras células são empregados, os testes serão necessários para usar o melhor método de entrega, em termos de eficiência elevada e baixa toxicidade. Sumariamente, o método transposão PB é considerado para ser um segurod baixo custo, mas com uma eficiência menor em comparação com os vectores SEV.

Em relação ao procedimento para obter as células do rato AF, é fundamental ter ratos fêmea grávida disponível. Como tal, é necessária a criação de um número adequado de acasalamentos (pelo menos seis fêmeas com duas fêmeas para cada macho).

Mais experimentos poderiam ser realizados especificamente sobre células AF humanos para produzir células iPS de fetos saudáveis ​​e doentes. Considerando a ampla gama de doenças congênitas que podem ser detectados através do diagnóstico pré-natal, células obtidas a partir do AF durante a gestação representa a melhor fonte para obter células iPS tanto para estudar a doença 48 e também para o planejamento de uma abordagem da medicina regenerativa em caso de defeitos de tecidos tais como cardíaco ou do músculo esquelético 49, 50.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes  BD Falcon 351029 For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol  Sigma M6250 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM  Thermo Fisher Scientific A21043 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG  Thermo Fisher Scientific A21468 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A21442 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG  Thermo Fisher Scientific A11005 Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit  Sigma 85L1 Alkaline Phosphatase  staining
Ampicillin Sigma A0166 For bacterial selection
Bovine Serum Albumin  Sigma A7906 BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
Chloroform Sigma C2432 For RNA extraction
DH5α cells Thermo Fisher Scientific 18265-017 Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965039 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline  Sigma D9891 For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)  Sarstedt  72.706 For PB production 
ES FBS  Thermo Fisher Scientific 10439024 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS  Thermo Fisher Scientific 10270106 For MEF medium
Fine point forceps F.S.T Dumont #5  AF isolation
Gelatin J.T.Baker 131 Used 0.1%, diluted in PBS 1x
Glycine Bio-Rad 161-0718 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QS Vector Laboratories H3404 Nuclei detection
HE  Bio-Optica 04-061010 Histological analysis of teratoma
Hoechst  Thermo Fisher Scientific H3570 Nuclei detection
Horse Serum  Thermo Fisher Scientific 16050-122 For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG SantaCruz sc2005 Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED  Vector Laboratories SK4805 Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G) Terumo SS+01H25161 Amniocentesis procedure
Klf4  SantaCruz sc-20691 Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox) Sigma L3022 For bacterial growth
LIF  Sigma L5158 For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel  BD 354234 For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
Methanol Sigma 32213 Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plate BD Falcon 353047 For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plate BD Falcon 353046 For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog  ReproCELL RCAB0002P-F Rabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids  Sigma M7145 For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat Serum Vector Laboratories S2000 For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40 Sigma 12087-87-0 For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4 SantaCruz sc-5279 Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT)  Thermo Fisher Scientific 18418012 For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution) Sigma 441244 PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10x Thermo Fisher Scientific 14200-067 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063 For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm) BD Falcon 353025 For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory - PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep Kit Qiagen 12663 For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid  Provided by professor Andras Nagy laboratory - rtTA
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74134 For RNA extraction
Sox2  SantaCruz sc-17320 Goat polyclonal IgG
SSEA1  Abcam ab16285 Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase  Thermo Fisher Scientific 18064-014 For RT-PCR
T  Abcam ab20680 Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific 10342020 PCR
Trypsin  Thermo Fisher Scientific 25300-054 Cell culture passaging
Triton X-100 Bio-Rad 161-047 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596-026 For RNA extraction
Tubb3   Promega  G712A Mouse monoclonal IgG1
TWEEN-20 Sigma P1379 For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp    R&D Systems MAB1368 Mouse Monoclonal IgG1
αSMA  Abcam ab7817 Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD) Promega  E2311 For AF cells transfection
Stereomicroscope Nikon SM2645 To perform amniocentesis 
200 μl tips Sarstedt  70.760012 To pick bacteria colonies
Scissor F.S.T 14094-11 stainless 25U To perform amniocentesis 
Ethanol Sigma 2860 To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm)  BD Falcon 353025 For MEF expansion
Mitomycin C Sigma M4287-2MG For MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plate BD Falcon 353071 For iPS-AF culture

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References

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A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon
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Bertin, E., Piccoli, M., Franzin, C., Nagy, A., Mileikovsky, M., De Coppi, P., Pozzobon, M. The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System. J. Vis. Exp. (120), e54598, doi:10.3791/54598 (2017).

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