Introduction
Prenatal tanı genetik hastalıkların (örneğin kromozomal anormallikler, monogenetik veya çok faktörlü / polijenetik hastalıklar) ve konjenital anomali (yani konjenital diyafragma hernisi, kistik akciğer lezyonları, ekzomfalos, Gastroşizis) değerlendirmek için önemli bir klinik araçtır. Amniyotik sıvı (AF) hücreleri gebeliğin ikinci üç aylık döneminde rutin planlanan prosedürlerden elde etmek kolay (yani amniyosentez ve amniyoredüksiyon yapıldığında) ya da sezaryen bölümler 1, 2. Prenatal veya neonatal hastalarda AF hücrelerinin mevcudiyeti rejeneratif tıp için bu kaynak kullanma imkanı sağlar, ve birkaç araştırmacı AF 3, 4, 5, 6 izole bir kök hücre popülasyonu kullanarak farklı doku hasarları veya hastalıkları tedavi imkanı araştırıldı, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Kolayca Hastalık genellikle hareketsiz olduğu bir zaman penceresinde, hastalıklı hastaların AF hücreleri elde etme ihtimali, yeniden programlama amacıyla bu hücre kaynağı kullanma düşüncesine yol açar. Gerçekten de, AF hücrelerinden türetilen uyarılmış pluripotent kök (IPS) hücreleri doğum öncesi uygun bir hastaya özgü tedavi hazırlamak amacıyla, in vitro ilaç testleri için veya doku mühendisliği yaklaşımlar ilgi hücrelerinde ayırt edilebilir. Birçok çalışma, daha önce AF hücrelerinin yeteneği hücre tipleri 13, 14, 15, 16, 17 <geniş bir aralığı içine yeniden programlanması ve ayırt edilmesi göstermiştir/ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.
Dört transkripsiyon faktörleri (Oct4, Sox2, Myc'nin ve Klf4) zorla ifade ile Takahashi ve reprogrammed somatik hücre Yamanaka 28 ile keşfinden bu yana, ilerleme yeniden programlama alanında yapılmıştır. farklı yöntemler göz önüne alındığında, biz viral ve viral olmayan yaklaşımlar ayırt edebilirsiniz. İlk kısmen yeniden programlanan hücre hattının sonucu ve risk hem de yüksek verim ama retroviral transgen genellikle eksik susturulması, sahip viral vektörler (retrovirüsler ve lentiviruses), kullanımını bekliyoraraya sokma mutajenez 29, 30, 31. Yani plazmidler, vektörler, mRNA, protein, transpozonlar: viral olmayan yöntem farklı stratejiler kullanır. Transgenik dizilerin ücretsiz iPS hücrelerinin türetilmesi sızdıran transgen ifade ve girmeyle mutagenez potansiyel zararlı etkileri engelleyecek amaçlamaktadır. Yukarıda açıklanan tüm viral olmayan stratejiler arasında, piggyBac (PB) transpozon / transposase sistemi ekleme veya eksizyon olayları 32 katalize bir transgen ve transposase enzimin geçici ifadesini yan sadece ters terminali tekrarlar gerektirir. iPS hücresi üretimi için diğer yöntemlere göre transpozonlar kullanılarak avantajı retroviral vektörler aynı etkinliğini gösteren bir viral olmayan vektör yaklaşımla vektörü içermeyen iPS hücrelerini elde etme imkanı vardır. Bu reprogr için entegre transposon kodlama iz az eksizyon ile mümkündüriPS hücrelerinin 33 transpozazın yeni, geçici ifade, aşağıdaki faktörler amming. PB farklı hücre tipleri, 34, 35, 36, 37 etkili olduğu göz önüne alındığında, viral vektörler ile ilgili klinik yaklaşımın için daha uygundur, ve ksenobiyotik kullanarak mevcut virüs üretim protokolleri aksine kseno içermeyen iPS hücrelerinin üretimi sağlar Koşullar, bu sistem, kemirgen AF iPS hücreleri elde etmek için kullanılır.
Burada fare AF hücrelerinin (iPS-AF hücreleri) 38 dan pluripotent iPS klonların üretimini göstermek için zaten yayınlanmış çalışmaları takip ayrıntılı bir protokol öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler İtalyan yasalarına göre idi. Murin AF örnekleri GFP adı C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J fareleri 13.5 gün sonra coitum (DPC) gebe farelerin hasat edilmiştir.
1. Transpozon Üretimi
Not: Transposon sentezleme vektörleri standart klonlama prosedürleri kullanılarak elde edilmiştir. Fare AF hücreleri transfeksiyon için plazmid DNA, ticari kitler kullanılarak hazırlandı.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DH5α bakteri 50 ul plasmid DNA, 10 ng karıştırın. 20 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü inkübe edin.
- 40 sn için 42 ° C sıcaklıkta ısı şoku.
- 2 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C) lizojeni etsuyu (LB) suyu 250 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de (300 rpm) çalkalayın.
- 0.1 mg / ml ampisilin ile LB levhaları üzerine her dönüşüm için 30 ul yayıldı. Plakalar kuru ve 37 ° C ov de ters inkübe izinernight.
- Ertesi gün, öğleden sonra, her dönüşümden, steril 200 ul ipuçlarını kullanarak, 3 koloniler almak ve 0.1 mg / ml LB amp üzerine aktarın.
- gece boyunca 37 ° C'de (300 rpm) bakteri çalkalayın.
- Plazmid Saflaştırma için, ticari kitler kullanın. -20 ° C'de Hazır plazmid.
2. Fare Embriyonik fibroblast (MEF) Kültür
- % 0.1 jelatin ile 6 oyuklu plakaların kaplanması
- Altı gözeneğin her steril% 0.1 jelatin 1 ml ilave başlık altında Coat plakalar. jelatin 1 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C) polimerize olsun.
- aşırı atın ve 1 saat süre ile plakaları kurutunuz.
- oda sıcaklığında saklamak plakaları mühür ve parafilm kullanın.
- Mitomisin C ile MEF inaktivasyonu
- 37 ° C banyo kullanılarak 4 x 10 6 MEF hücreleri şişe çözülme.
- MEF ortamı ile bir Petri kabı (150 mm) başlık MEF tohumu.
- 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin.
- (DİKKAT) hücreler konfluent mitomisin C (5 mg / ml) ekleyin.
- Bir inkübatör içine yerleştirin hücreleri (37 ° C ve% 5 CO2) 3 saat karıştırıldı.
- mitomisin C yıkama hücreleri ile 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez orta çıkarın.
- 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine ticari tripsin ve yeri hücre 2 ml ilave edilir. Sonra, tripsin reaksiyonu durdurmak için kesme aracının 18 ilave edin.
- üreticinin protokolüne göre bir Bürker odası kullanarak hücreleri sayın.
- 5 dakika boyunca 145 x g'de santrifüje hücreleri. süpernatant atın.
- Tohum 60.000 hücre /% 0.1 jelatin kaplı plakalar üzerinde inaktive EMB cm2.
- AF ve / veya iPS AF hücreleri tohumlamadan önce 37 ° C'de 24 saat% 5 CO2 hücreleri geliştirin.
3. Fare AF Hücre İzolasyonu
- zamanlanmış çiftleşmesi kurmak ve vajinal PLU kontroleş yuva 24 saat sonra GS.
- 13.5 DPC kadar gözlemleyin ve servikal dislokasyon yoluyla hamile baraj kurban.
- % 70 etanol kullanılarak hayvanın karın duvarı temizleyin.
- makas kullanarak, karın boşluğuna erişebilmek için karın duvarının uzunluğu incising orta hat laparotomi gerçekleştirin.
- forseps kullanarak rahim Açığa. 1x PBS buz üzerine yerleştirildi steril dolu bir 100 mm Petri kabı içine makas ve transfer kullanarak rahim kaldırmak.
- 10X büyütmede AF toplamak için Stereomikroskopta kullanın.
- forseps ile rahim tutun ve makas ile rahim duvarına çıkarın. Fetal membranlar ve buna bağlı olarak amniotik sıvı sızıntısını önlemek için dikkatli olun.
- Steril 1X PBS ile doldurulmuş bir 100 mm Petri kabı içine fetusu toplayın ve buz üzerine yerleştirin.
- Temiz bir 100 mm Petri kabı ince bir nokta forseps ve yer ile bir fetus plasenta kavrayın.
- ince nokta forseps kullanarak kesesi sarısı çıkarın.
- AF toplandıktan sonra,% 1 fetal inek serumu (FBS) ile takviye edilmiş, steril 1 x PBS ile her fetus yıkayın ve 15 ml AF içeren konik tüp toplar.
- 5 dakika boyunca 145 xg'de Santrifüj AF. kaputun altında Süpernatantı ve pelet AF hücreleri tohum.
4. Fare AF Hücre Kültürü
- Fare AF Hücrelerinin tohumlama
- Bir gün önce, ekim için, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması.
- AF toplandıktan sonra, AF kültür ortamı kullanılarak (yaklaşık 1 x 10 7 hücre 6 fetusa elde edilen) mitotik inaktive MEF üzerine bir amniyosentez elde edilen hücreler tohum.
- Her gün ortam değiştirilerek, 37 ° C ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin.
- 7 günlük bir kültürden, trans sonraAşağıda tarif edilen prosedür takip fect AF hücreleri.
5. Transfeksiyon iPS-AF Hücre Üretimi ve Kültür
Not: Fare AF hücreleri (PB-CAG-rtTA) transpozon plazmid transposaz sentezleme plasmidi (mPBase) ile birlikte ters tetrasiklin transaktivatör ile, PB-tetO2-IRES-OKMS transpozon plasmidi ile transfekte edilmiştir. Bütün plasmidler Profesör Andras Nagy 33 tarafından temin edilmiştir.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde: (2 ug toplam DNA), 0.5 mPBase ug ve 0.5 PB-CAG-rtTA ug PB-tetO2-IRES-OKMS 1 ug karıştırın.
- serumsuz ortam ile 100 uL (- DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) DNA seyreltilir.
- (Plazmid DNA oranında 8 uL transfeksiyon ajanı 2 ug (DNA) transfeksiyon maddesi) (örneğin, Fugene) transfeksiyon reaktifi 8 uL ekleyin 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ihtiva eden DNA'ya.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı inkübe edin.
- / Oyuk 2 mL'lik bir son hacme sahip fare AF hücreleri, 6 gözlü bir levhaya oyuk başına transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı, 100 uL damla damla eklenir ve yavaşça döndürülerek dağıtın. 24 saat boyunca bekletin.
- Ertesi gün, doksisiklin 1.5 ug / mL (her bir oyuk için ortam, 2 mL) ile desteklenmiş taze iPS AF ortamı hücreleri beslenmesiyle Yamanaka en faktörleri (Oct4, Klf4 Myc'nin, Sox2) ekspresyonunu indükler.
- Taze Ortodoks içeren ortam (nokta 5.13 kadar doksisiklin ile desteklenmiş medya hücreleri korumak) ile, geçit olmadan, her gün hücreleri beslemek.
- MCherry ifade 24 saat içinde ve günlük koloni oluşumu (koloniler tipik transfeksiyon sonra 20 ile 30 gün arasında görünür) hücreleri gözlemleyin.
- Bir gün kolonisi seçmek önce, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile 96 oyuklu bir doku kültür plakası hazırlanır.
- hacim usin 50 uL tek koloniler seçinga 200 uL pipetle ve tek tek oyuklara bir 96-çukurlu plaka sırayla transfer edin.
- Sonraki gün, ticari bir tripsin 50 ul ekleyerek tek hücre içine her koloni ayırmak ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
- koloni parçalara ayırma aşağı yukarı pipet ve.
- doksisiklin ile desteklenmiş taze iPS AF ortamın 100 uL dolu 96 oyuklu bir plaka kaplama% 0.1 jelatin ile etkisizleştirilmiş MEF ile yeni bir kuyuya ayrışmış koloniyi içeren tripsin başına 50 uL.
- Hücreler 60-70% konfluansa ulaştığında, 24 oyuklu plaka iyi ayrıldı.
- koloniler doksisiklin olmadan durumda da görünüp görünmediğini doğrulamak için iki kuyu, doksisiklin olmadan doksisiklin ile diğeri, 2: Hücreler% 60-70 izdiham ulaştığınızda, 1 ayrıldı.
- IPS-AF ortamında inaktive MEF üzerinde, doksisiklin bağımsız iPS-AF klonlar, korumaya devam ediyor.
- CH, 37 ° C ve% 5 CO2, hücreleri yetiştirmekgünlük orta Anging.
6. Alkalin Fosfataz Boyama
- doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğunda imalatçının protokolü takip alkalin fosfataz boyama gerçekleştirin.
7. İmmünofloresan
- Doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğu zaman, inaktive MEF ile 24 oyuklu plaka iyi 150.000 hücre / cm2, tohum ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 48 saat süre ile hücre büyür.
- (DİKKAT), oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) oyuk başına 300 ul ilave edilerek hücreler sabitleyin.
- % 0.1 NP-40 permeabilize hücrelerin 300 ul ekle.
- % 0.1, PBS-Tween 20 300 ul hücreleri durulayın.
- Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici tampon (1 x PBS içinde% 10 at serumu) 300 ul ekle.
- (1:10 Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog: Aşağıdaki primer antikorlar kullanın0) ve SSEA1 (1:80). % 1 sığır serum albümini (BSA),% 10 normal keçi serumu ile SSEA1 seyreltilir, 0.3 M glisin,% 0.1 PBS-Tween-20. 1 x PBS içinde% 10 at serumu ile diğer tüm antikorlar seyreltilir.
- 4 ° C'de bir gece antikorlar inkübe edin.
- % 0.1 PBS-Tween-20 300 ul ile durulayın.
- 1 x PBS içinde% 10 at serumu içinde seyreltilmiş sekonder antikor kullanarak: Alexa594 konjüge edilmiş keçi anti-fare IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş tavuk anti-keçi IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş, tavuk anti-tavşan IgG (1: 200), Alexa568-konjuge keçi anti-fare IgM (1: 200). Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
- 1x PBS ile durulayın.
- 1x PBS: Hoechst çözeltisi (10.000 1) ile Leke çekirdekleri.
Vitro Hücre Farklılaşma 8.
- asılı damla embriyoid organları (EBS) oluşturmak için, farklılaşma ortamı kullanılarak, Petri kapağı üzerine (2.000 hücre / 20 ul) tek damla yetiştirmek.
- 37 ° C'de inkübe edin yemekler4 gün boyunca% 5 CO2.
- farklılaşma ortamında 3 gün süspansiyon kültüründe 100 mm bakteriyel dereceli tabaklara EBS aktarın.
- Başka bir 14 gün boyunca (DMEM içinde 1:10 oranında seyreltilmiş) bazal membran matris ile kaplanmış 24 oyuklu plakalarda ve plaka EBS.
- T (1: 100), αfp (1: 200) ile Tubb3 (1: 500) 37 immünofloresan analiz için, birincil antikorlar kullanır.
9. Vivo teratom oluşumu
- / - - Γc - / - farelerde Rag2 ve hindlimb kas içine 1 x 10 6 iPS-AF hücreleri içeren 1x PBS 100 ul enjekte edilir.
- 6 hafta Hücre enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon ile fareler kurban.
- Aşağıdaki analizler için farelerin hindlimb itibaren, kendi boyutuna göre ayırt tümör kitleleri, çıkarın.
- Bir Kriyostat kullanarak izopentan dondurulmuş tümör 7-10 mikron kalınlığında enine kesitler halinde kesilmiştir.
- Hematoksilen And Eozin (HE) Leke:
- Üreticinin protokolü takip edilerek, tümör dokusu yapısını değerlendirmek, HE ile leke.
- Immunoperoksidaz Leke için:
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile teratom bölümleri sabitleyin.
- % 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği.
- Aşağıdaki antikorlar ile inkübe: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) ile αSMA (1: 100), 1 x PBS içinde% 1 BSA içinde seyreltilmiştir. 1 (Tubb3 için), 37 ° C de saat ya da gece boyunca 4 ° C 'de (diğer antikorlar için) inkübe edin.
- 20 dakika% 100 metanol kullanılarak blok peroksidaz.
- 37 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe HRP ile konjüge edilmiş (1: 150), ikincil antikor anti-fare.
- 1x PBS ile durulayın.
- 5 dakika boyunca peroksidaz (HRP) alt-tabaka (Malzeme Tablosu) kuluçkalayın.
- 5 dakika boyunca musluk suyu ile durulayın.
- 9 saniye Hematoksilen QS ile Leke.
- musluk suyuyla durulayın. Hücreler 10. RNA Ekstraksiyonu
- İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanarak.
- örnek çözdürme önlemek için bir havan ve sıvı azot kullanılarak teratom homojenize edilir.
- Dokunun 25 mg tartılır.
- RNA ekstraksiyonu için ticari reaktif 1 mL kloroform 200 uL ekleyin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 13.000 x g'de santrifüj ve 15 dakika boyunca 4 ° C.
- yeni bir tüpe süpernatant aktarın.
- RNA, imalatçının protokolüne göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanmak saflaştırmak için.
- Ters transkripsiyon (RT) -polymerase zincir reaksiyonu (PCR) ve oligo (dT) edi bir ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal cDNA sentezlemeüreticinin protokolüne Ding, 50 ng / cDNA uL elde edildi. 10 ng / ml arasında bir konsantrasyonda RNaz içermeyen su ile cDNA seyreltilir.
- RT-PCR 1 ng kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak DNA polimeraz kullanılarak gerçekleştirmek / cDNA uL.
Teratom 11. RNA Ekstraksiyon
12. Ters Transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu Analizi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
reprogramming kapasitesini değerlendirmek, fare AF hücreleri GFP farelerin fetusa toplanmıştır. Hücreler PB- (a doksisiklin indüklenebilir bir şekilde MCherry fluoresan proteine bağlanmış Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2 Myc'nin ve Klf4) ifade dairesel transpozon plazmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfekte ve tetrasiklin transaktivatör tersine edildi CAG-rtTA) transposaz ifade plazmidi (mPBase) ile birlikte plazmidler. Fare AF hücreleri MEF besleyici tabakası üzerinde in vitro büyütme ile 1 hafta sonra Oct4, Klf4 c-myc ve Sox2 ile transfekte edilmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi 39 ekzojen faktörler ekspresyonu için, doksisiklin, 1.5 ug / ml bir konsantrasyonda transfeksiyon gün sonra ilave edildi. mCherry sentezleme transfeksiyonu gösteren doksisiklin ek 24 saat sonra, görünür. bir ES-benzeri morfolojisi ile ilk koloniler 20 gün DOX sonra ortayaycycline indüksiyon ve 30 days sonrası transfeksiyon aldı. Bu koloniler inaktif fibroblast besleyici katmanlar üzerinde ekilmiştir. Toplandıktan sonra Çoğaltılmış kuyular 33 bağımsız doksisiklin olarak bulana kadar, hayatta kalan klonlar bazı pasajlar için doksisiklin ile desteklenen ortamda muhafaza edilmiştir.
Fare iPS AF klonlar için farklı parametreler değerlendirilmiştir: MCherry ekspresyonunu, alkalin fosfataz boyama, Pluripotency belirteçlerinin Oct4, Sox2 Klf4 Nanog ve SSEA1, eksojen ve endojen pluripotense genleri (Oct4, Klf4 Myc'nin ve Sox2) ekspresyonu ve protein ifadesini in vitro (EBS) ve in vivo (teratom tahlili) farklılaşmasında. Şekil 1'de özetlendiği gibi Onlar, kendi pluripotensini doğrulamak için değerlendirilen tüm kriterleri yerine getirdi.
Şekil 1: fare AF GFP + hücrelerinin yeniden programlanması. IPS AF GFP + hücreler (A), Doksisiklin, bağımsız koloniler alkalin fosfataz (ALP) boyama mCherry ekspresyonu için negatif ve pozitif idi. Ölçek çubukları = 250 mm ve 100 mm. (B) Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 ve SSEA1 ifade istikrarlı doksisiklin bağımsız iPS-AF GFP + hücre Temsilcisi görüntüler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (C), eksojen (vektör tabanlı primerler, Tg) ve endojen (Oct4, Klf4 Myc'nin ve Sox2) genlerin ekspresyonu için RT-PCR analizi. Beta-2-mikroglobulin (B2M) bir ev bakıcısı geni olarak kabul edildi. Yeniden programlanması hücre çizgileri varlığında (+) ya da yokluğunda yetiştirildi (-) (96 saat) doksisiklin. R1, ES hücreleri, kontrol olarak kullanılmıştır. (PCR paneli Bertin ve ark değiştirildi. 38 (D) 6 hafta Rag2 arka ayakları iPS AF GFP + hücrelerin enjeksiyonundan sonra elde edilen teratom genel görünümünden - / - γc - / - fare. Her üç germ (ektoderm, mezoderm ve endoderm) içine (E) Teratoma histoloji ve immün teyit hücre farklılaşması. αfetoprotein (AFP, endoderm), αsmooth kas aktini (αSMA, mezoderm) ve p3 tubulin (Tubb3, ektoderm) tümör kitleleri saptandı. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (F) EBS ve teratom (TE) RT-PCR analizi. C +, pozitif kontrol; NTC olmayan şablon kontrolü. Vimentin (Vim, mezoderm), αfetoprotein (AFP, endoderm) ve β3 tubulin (Tubb3, ektoderm). (PCR paneli referansı 38 modifiye edilmiştir). Th büyük halini görmek için buraya tıklayınızrakamdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
pluripotensin indüksiyon elde etmek için seçilen yöntem, uzun vadeli transplantasyonu ile ilgili hücre, klinik güvenliği için geçerlidir. Günümüzde, yeniden programlama için uygun çeşitli yöntemler vardır. Bütünleştirici olmayan yöntemler arasında, Sendai viral (SeV) vektörü bulaşmış hücreler 40 çekirdeği içine entegre olmayan proteinin büyük miktarlarda üretmek ve iPS hücreleri elde etmek için bir strateji olabilir bir RNA virüsüdür. SeV vektörleri öteleme dereceli iPS hücrelerinin üretimi için cazip bir aday olabilir, ancak bazı eksiklikleri sunar. viral replikaz transgenik sekanslarının doğası, karşı duyarlıdır. SeV vektörleri kurucu çoğaltmak için, farklı stratejiler bu yönü 41, 42 geliştirmek için kullanılsa bile, konakçı hücrelerden ortadan kaldırmak için zor olabilir. Böyle bir Düzey 2 biyolojik güvenlik kabini olarak özel işlem gerektirir. Orada benSadece bir ticari satıcı mevcut s. yeniden programlama için klinik dereceli Sev güncel bir eksikliği var ve iPS hücresi üretiminin yüksek maliyeti vardır.
Nedeniyle bu yönlerine, transpozon sistemi SeV vektörleri ile ilgili daha iyi bir yaklaşım olarak kabul edilir ve burada bu sistem çeşitli avantajlar fare AF hücrelerinin yeniden programlanması için uygun bir yöntem olduğunu belirlemek mümkündür. Bu ksenobiyotik koşulları kullanarak mevcut virüs üretim protokolleri aksine xenofree iPS hücrelerinin üretilmesini sağlar. Hiçbir belirgin tür engel vardır ve virüslerin daha büyük bir transgen kargo kapasitesine sahiptir. Kolayca Seviye 1 biyolojik güvenlik kabini ile donatılmış her laboratuvarda yapılabilir standart hücre transfeksiyon yöntemi kullanılarak yoluyla plazmid transpozonlar basit ve güvenli teslimat sağlar. Çeşitli ce gösterildiği gibi transposase yeniden ifadesi, ayak izi ücretsiz fare ve insan iPS hücrelerinin sonucu nesil ile PB elemanlarının kaldırılmasını izinLL hatları 32, 34, 35. Farklı çalışmalar transpozon sistemi kanser ile ilişkili genler ve viral bazlı vektörler, 43, 44, 45, 46, 47 ile karşılaştırıldığında, aktif genlerin hedef olarak daha az eğilim yakınındaki hedefleme düşük bir frekans görüntüler gösterdi. transpozonlar göre yeniden programlanması seçilen ilâç verme yöntemine bağlıdır ve bu durum, DNA transfeksiyon yöntemleri (lipofeksiyon, elektroporasyon ve nucleofection) ilişkili direnç veya toksisite kısıtlamasıdır. Burada fare AF hücreleri ile çalıştı DNA transferinde için tasarlanmış olmayan bir lipozomal formülasyon kullanılır. diğer hücreler kullanıldığı takdirde, testler yüksek verim ve düşük toksisite açısından en iyi dağıtım yöntemi kullanmak gerekli olacaktır. Özet olarak, PB transpozon yöntemi güvenli bir olduğu düşünülmektedird düşük maliyetli ama SeV vektörleri ile karşılaştırıldığında daha düşük bir verimlilikle.
Fare AF hücreleri elde etmek prosedürü ile ilgili olarak, hamile dişi fareler kullanılabilir olması için çok önemlidir. Bunun gibi, çiftleşmelerin yeterli sayıda (erkek başına iki kadın ile en az altı kadın) kurmak için gereklidir.
Daha deneyler sağlıklı ve hastalıklı fetusa iPS hücrelerini üretmek için insan AF hücreleri üzerinde özel olarak yapılabildi. Gebelik sırasında AF elde edilen konjenital prenatal tanı ile tespit edilebilir hastalıklar, hücrelerin geniş dikkate alındığında ve ayrıca doku defektlerinin durumunda rejeneratif tıp yaklaşımı planlaması için hastalığın 48 okuyan hem iPS hücrelerini elde etmek iyi kaynak temsil örneğin kardiyak ya da iskelet kası 49, 50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
| DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
| Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
| Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
| Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
| LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
| Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
| Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
| MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
| MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
| Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
| Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x |
| Penicillin - Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
| Petri Dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
| PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
| Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
| Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1x |
| αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
| αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
| Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
| Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
| 200 μl tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
| Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
| Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
| Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
| Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
| MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |
References
- You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
- Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
- Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
- Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
- Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
- Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
- Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
- Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
- Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
- Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
- Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
- Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
- Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
- Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
- Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
- Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
- Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
- Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
- Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
- Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
- Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
- Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
- Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
- Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
- Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
- Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
- Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
- Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
- Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
- Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
- Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
- Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
- Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).
