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Developmental Biology

3 डी छवियों के तेजी से अधिग्रहण का उपयोग उच्च संकल्प episcopic माइक्रोस्कोपी

doi: 10.3791/54625 Published: November 21, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

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सभी पशु उपयोगों के बोस्टन बच्चों के अस्पताल में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. नमूना तैयार

  1. समय पर संभोग
    1. एक C57BL6 जंगली प्रकार पुरुष और एक महिला एक ही पिंजरे में एक साथ रखें।
    2. एक संभोग प्लग के गठन जल्दी अगली सुबह के लिए जाँच करें। संभोग प्लग (उर्फ, योनि या शयन प्लग) एक कठोर पतला बयान कि ब्लॉक योनि है।
    3. भ्रूण दिन 0.5 (E0.5) के रूप में प्लग तिथि निर्धारित करें।
  2. माउस भ्रूण का अलगाव
    1. सीओ 2 asphyxiation द्वारा गर्भवती महिलाओं euthanize।
    2. एक शोषक पैड पर लापरवाह चूहों रखो और पेट क्षेत्र स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ।
    3. त्वचा लिफ्ट और दुम पेट क्षेत्र शल्य कैंची का उपयोग करने पर एक प्रारंभिक 5 मिमी चीरा बनाते हैं। कट और पूरी तरह से आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए पेट की त्वचा को हटाने
    4. VA के पास कटजीना पूरे गर्भाशय हटा दें।
    5. गर्भाशय सींग के साथ आरोपण साइटों के बीच कट। प्रत्येक खंड या conceptus केवल एक भ्रूण के अंदर होनी चाहिए।
    6. 1x ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में गर्भाशय खंडों रखें।
  3. भ्रूण विच्छेदन
    1. एक स्टिरियोस्कोप के तहत ठंडा पीबीएस के साथ एक अलग डिश में प्रत्येक conceptus रखें।
    2. गर्भाशय के ऊतकों, नाल और फिर भ्रूण झिल्ली क्रमिक रूप से ठीक विदारक संदंश का उपयोग निकालें।
    3. 1x बर्फ के ठंडे पीबीएस एक बड़ी हस्तांतरण पिपेट का उपयोग के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को विच्छेदित भ्रूण स्थानांतरण। अप ऊतकों को नुकसान को कम करने के संदंश के साथ सीधे भ्रूण उठा बचें।
  4. फिक्सेशन
    1. लगानेवाला के कम से कम 10 नमूना संस्करणों के साथ अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% तटस्थ बफर formalin समाधान में विच्छेदित भ्रूण को ठीक करें।
  5. pretreatment
    1. क्लियरिंग समाधान तैयार: 4एम यूरिया, 10% ग्लिसरॉल, 4% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) दोहरा आसुत जल में।
    2. क्लियरिंग समाधान के साथ लगानेवाला बदलें।
    3. 2 सप्ताह - धीरे 1 के लिए कमरे के तापमान पर एक घुमाव पर नमूना बारी बारी से। दूसरे और तीसरे दिन एक बार क्लियरिंग समाधान विनिमय। नमूना धीरे-धीरे स्पष्ट और पारदर्शी हो जाता है।
    4. 10% formalin के साथ क्लियरिंग समाधान की जगह और 2 दिनों के लिए एक घुमाव पर छोड़ दें।
  6. निर्जलीकरण
    1. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार 1x पीबीएस के साथ pretreated नमूने धो लें।
    2. एक सज्जन घुमाव पर कमरे के तापमान पर एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला में नमूने निर्जलीकरण। E15.5 भ्रूण के लिए, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% और 100% इथेनॉल, 2 घंटा हर कदम सहित एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला का उपयोग करें। पुराने भ्रूण के लिए, ऊष्मायन समय बढ़ाया जा करने की जरूरत है।
  7. धुंधला हो जाना
    1. धुंधला समाधान तैयार: Eosin Y Disodium नमक और 0.02 की 0.1375 ग्राम जोड़नेAcridine नारंगी हेमी (जस्ता क्लोराइड) 100% इथेनॉल के 50 मिलीलीटर के लिए नमक की 75 ग्राम। 2 घंटे के लिए हिलाओ। एक फिल्टर पेपर के साथ फ़िल्टर। कमरे के तापमान पर स्टोर और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा प्रकाश से बचें।
    2. 1 घंटे के लिए धुंधला समाधान करने के लिए नमूना स्थानांतरण।
    3. ताजा धुंधला समाधान और दाग रात भर साथ बदलें।
  8. घुसपैठ
    1. घुसपैठ समाधान तैयार: जेबी -4 एम्बेडिंग किट का समाधान एक की 100 मिलीलीटर, उत्प्रेरक सी के 1.25 जी, Eosin Y disodium नमक की 0.275 जी और acridine नारंगी हेमी (जस्ता क्लोराइड) नमक की 0.055 जी गठबंधन। (200 आरपीएम) 2 घंटे के लिए एक बर्फ बाल्टी में मिश्रण करने के लिए हिलाओ, और फिर फिल्टर पेपर के साथ फिल्टर।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर घुसपैठ समाधान स्टोर और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा प्रकाश से बचें।
    3. भ्रूण स्थानांतरण समाधान घुसपैठ करने के लिए: धुंधला समाधान (1: 1), और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर कम से कम 3 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. भ्रूण स्थानांतरण समाधान घुसपैठ करने के लिए और 3 घंटे के लिए सेतेएक ठंडे कमरे में एक घुमाव पर आर।
    5. घुसपैठ समाधान हर दिन एक बार बदलें, और तीन दिन के लिए एक सौम्य घुमाव पर एक ठंडे कमरे में छोड़ दें।

2. एम्बेडिंग

  1. बर्फ पर समाधान बी और घुसपैठ समाधान रखें।
  2. तुरंत embedding से पहले एम्बेडिंग समाधान करें (समाधान बी और घुसपैठ समाधान के 1:25)।
  3. ओरिएंट एक embedding मोल्ड में नमूना है, तो embedding मोल्ड में ठंड एम्बेडिंग समाधान धीरे डालना। री-उन्मुख एक पिन के साथ अगर जरूरत है।
  4. जांच करने के लिए एम्बेडिंग समाधान जम जाता है कि क्या एक पिन का प्रयोग करें। नमूना ब्लॉक के बाहर धक्का, और यह ट्रिम अगर जरूरत है।
  5. एक क्रॉस उन्मुखीकरण प्राप्त करने के लिए अलग फफूंदी का उपयोग नमूना ब्लॉक को नई दिशा।
  6. embedding मोल्ड के शीर्ष पर एक ब्लॉक धारक रखो। धीरे मोल्ड में एम्बेडिंग समाधान डालो जब तक ढालना और ब्लॉक धारक समाधान embedding द्वारा डूबे हुए हैं।
  7. एक माध्यमिक कंटेनर में नमूना रखें और इसे छोड़ देंएक धूआं हुड में 4 घंटा - 3 के लिए बर्फ पर।
  8. दुकान एक 4 डिग्री सेल्सियस में जम नमूनों।
  9. दूर छील embedding ढालना। परोक्ष रोशनी के साथ stereomicroscope के तहत ब्लॉक डाल ब्लॉक में नमूना की स्थिति का निरीक्षण किया। ब्लॉक चेहरे पर, नमूना के आसपास निशान ग्रिड लाइन।
  10. सामग्री embedding संदर्भ के रूप में चिह्नित ग्रिड लाइन का उपयोग करने का उपयोग राशि निकालने के लिए ब्लॉक ट्रिम।

3. छवि अधिग्रहण

  1. microtome करने के लिए नमूना ब्लॉक दबाना और एक ताजा कटौती की सतह प्राप्त करते हैं। खंड मोटाई सेट (जैसे, e9.5-10.5, 1.5 माइक्रोन; e11.5-12.5, 2.0 माइक्रोन; e13.5-15.5, 2.5 माइक्रोन; e16.5-बड़े, 3 माइक्रोन)। microtome के घर की स्थिति पर नमूना / ब्लॉक रखें।
  2. क्षैतिज नमूना की सतह ब्लॉक का सामना करना पड़ स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप माउंट।
  3. कंप्यूटर और माइक्रोस्कोप चालू करें, और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं।
  4. कल्पना और ब्लॉक सामना करने के लिए ध्यान केंद्रित प्रकाशिकीइमेजिंग सॉफ्टवेयर की 'लाइव देखें "मोड के तहत।
  5. माइक्रोस्कोप और microtome संरेखित अगर जरूरत इसलिए है कि ब्लॉक चेहरे दृश्यदर्शी के केंद्र में है।
  6. ज़ूम समायोजित इतना है कि पूरे ब्लॉक वाली चेहरा दृश्यदर्शी के भीतर है।
  7. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) फिल्टर (उत्तेजना 470 ± 20 एनएम, dichroic 495 एनएम, उत्सर्जन 525 ± 25 एनएम) का चयन करें और यदि आवश्यक हो तो refocus।
  8. उपाय और जोखिम समय मैन्युअल रूप से सेट (जैसे, 80 - 400 से मिनी सेकंड)।
  9. प्रत्येक ताजा कटौती के बाद ब्लॉक चेहरे की छवियों के अधिग्रहण और यदि संभव हो तो स्वचालित रूप से छवियों को बचाने के।
  10. संकल्प, खंड मोटाई और जूम सहित रिकार्ड महत्वपूर्ण पैरामीटर।
  11. पूरे नमूना, निर्यात परिष्करण और जेपीईजी प्रारूप करने के लिए सभी छवि फ़ाइलों को परिवर्तित करने के बाद यदि आवश्यक हो तो।
  12. एक इमेजिंग संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सभी मूल छवियों पलटना, और चमक और विपरीत समायोजित करें।
  13. एक अलग फ़ोल्डर में सभी प्रसंस्कृत छवियों को बचाओ।

4. 3 डीदृश्य

  1. निर्देश के बाद एक 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर करने के लिए सभी प्रसंस्कृत छवियों को अपलोड करें।
  2. इनपुट संकल्प और इस खंड मोटाई बड़ा डेटा (यानी, voxel आकार) के लिए सभी छवियों को बदलने और 3 डी फ़ाइल को बचाने के लिए।
  3. स्वचालित मोड का उपयोग कर सभी छवियों को संरेखित। मैन्युअल व्यक्तिगत छवियों को समायोजित अगर जरूरत है।
  4. एक नया फ़ाइल नाम के लिए गठबंधन छवि को बचाओ।
  5. 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग नमूना के morphometric सुविधाओं का विश्लेषण।

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Representative Results

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हम E9.5 और E13.5 8 के बीच माउस भ्रूण की उच्च गुणवत्ता HREM छवियों की सूचना है। देर मंचन भ्रूण की छवि गुणवत्ता, हालांकि, काफी फ्लोरोसेंट रंजक eosin के सीमित ऊतक प्रवेश की वजह से समझौता किया है। धुंधला दक्षता बढ़ाने के लिए, हम कई तरीकों pretreatment कि फ्लोरोसेंट इमेजिंग से 11 संगत कर रहे हैं परीक्षण किया है। विशेष रूप से, E15.5 माउस भ्रूण के साथ या तो SCA / ई ए 2 12 या पूरे शरीर घन 13 इलाज किया गया। हम यह भी सरलीकृत सूत्र, क्लियरिंग समाधान (4 एम यूरिया, 10% ग्लिसरॉल और 4% सोडियम dodecyl सल्फेट) का परीक्षण किया है। सभी pretreatment तरीकों धुंधला दक्षता में वृद्धि हुई। भ्रूण क्लियरिंग समाधान के साथ इलाज के 1 हफ्ते के बाद पारदर्शी हो गया। कोई स्पष्ट ऊतकों को नुकसान उपचार के बाद पता चला था। pretreated भ्रूण embedde होने से पहले निर्जलीकरण, धुंधला और घुसपैठ सहित कदम के माध्यम से प्रोसेस किया गयाप्लास्टिक एम्बेडिंग मीडिया में डी। HREM छवियों के रूप में धारा 3 (छवि अधिग्रहण) में ऊपर वर्णित है और एक 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शित एम्बेडेड नमूना से हासिल किया गया। E15.5 भ्रूण के पूरे माउंट सतह देखने का एक उदाहरण मूंछ पैड और विकासशील बालों के रोम (चित्रा 1) सहित त्वचा की विस्तृत रूपात्मक सुविधाओं का प्रदर्शन किया। आभासी अनुभाग देखने का संकल्प ऊतकीय खंड (चित्रा 2) के बराबर था।

आकृति 1
चित्रा 1:। E15.5 भ्रूण की 3 डी भूतल देखें यह त्वचा की विस्तृत रूपात्मक सुविधाओं से पता चलता। विकासशील बालों के रोम (छोटे सफेद डॉट्स) स्पष्ट कर रहे हैं, छवि के उच्च संकल्प का प्रदर्शन है। एक बड़ा ve देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की rsion।

चित्र 2
चित्रा 2:। E15.5 भ्रूण के midline धारा की आभासी धारा देखें दिल, जिगर, पेट और मूत्राशय सहित आंतरिक संरचना, स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ, हम एक संशोधित प्रोटोकॉल सीरियल HREM छवियों है कि तेजी से 3 डी दृश्य और जटिल संरचनाओं के morphometric विश्लेषण के लिए संगत कर रहे हैं प्राप्त करने के लिए नियमित प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर प्रस्तुत करते हैं। क्योंकि उच्च संकल्प छवियों के बजाय अलग-अलग वर्गों के ब्लॉक चेहरे से सीधे लिया जाता है, ठीक रूपात्मक सुविधाओं संरक्षित कर रहे हैं और तेजी से एक 3 डी दृश्य कार्यक्रम में डिजिटल खंगाला।

3 डी इमेजिंग visualizing और जटिल रूपात्मक सुविधाओं को समझने में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। सबसे 3 डी इमेजिंग तकनीक विशेष उपकरणों 1-4 पर निर्भर करते हैं। इसके विपरीत, EFIC और HREM इमेजिंग केवल एक डिजिटल कैमरा और एक microtome 14 से लैस एक stereomicroscope सहित मानक प्रयोगशाला के उपकरण का उपयोग। माइक्रोस्कोप और microtome के बीच कार्यात्मक युग्मन छवि अधिग्रहण के स्वचालन पूरी छवि अधिग्रहण की प्रक्रिया के स्वचालन के लिए सक्षम बनाता सक्षम बनाता है। हालांकि, हम पता चला है किकार्यात्मक युग्मन अनिवार्य 8 नहीं है। इसके बजाय, हम बस क्षैतिज stereomicroscope माउंट इतना है कि यह आराम रोक स्थिति पर एक मानक microtome के ब्लॉक सामना करने के लिए सीधे चेहरे। इस साधारण सेटअप के प्रमुख सीमा है कि HREM छवियों मैन्युअल लिया जाना है है। हम अनुमान है कि यह औसत पर छवि के अनुसार लगभग 5 सेकंड लेता है। एक और सीमा व्यक्तिगत छवि एक स्थान से दूसरे करने के लिए बदलाव कर सकते हैं, लेकिन यह एक मुद्दा है क्योंकि वे आसानी से 3 डी पुनर्निर्माण के दौरान पुनः संगठित कर रहे हैं नहीं है।

HREM प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, हम E13.5 को E9.5 से माउस भ्रूण की 3 डी छवियों की एक श्रृंखला का विश्लेषण किया है, और एक उपन्यास व्यवस्था है जिसके द्वारा एकान्त भ्रूण गंदा नाला दो अलग संरचनाओं में बदल देती है, बाहर का पाचन तंत्र और कम मूत्र का पर्दाफाश इलाकों 8। देर से की HREM छवियों की गुणवत्ता का मंचन भ्रूण eosin का अकुशल प्रवेश के कारण सीमित है (डेटा) नहीं दिखाया। ऊतक penetr बढ़ाने के लिएE15.5 और E18.5 भ्रूण के व्यावहारिक, हम दो अलग अलग तरीकों pretreatment कि फ्लोरोसेंट इमेजिंग से 11 संगत कर रहे हैं इस्तेमाल किया और एक नया फार्मूला, क्लियरिंग समाधान (4 एम यूरिया, 10% ग्लिसरॉल और 4% एसडीएस) का परीक्षण किया है। इन तरीकों के सभी ऊतक प्रवेश और eosin धुंधला की महत्वपूर्ण सुधार दिखाया है। पहले और pretreatment के बाद एक महत्वपूर्ण विचार है कि नमूना आसमाटिक दबाव की वजह से सूजन या सिकुड़ने त्वचा की संभावना है। आसमाटिक दबाव के अचानक परिवर्तन सीमित करने के लिए इस प्रकार के ऊतकों विरूपण को कम करने, हम समाधान की क्रमिक विनिमय सलाह देते हैं। इसके अलावा, हमने पाया है कि इथेनॉल के शामिल किए जाने में काफी मदद करता है (कदम 1.5.4)। घुसपैठ और एम्बेडिंग चरणों के दौरान, यह प्रकाश से नमूना रखने के लिए और 4 सी में करने के लिए महत्वपूर्ण है।

सामूहिक रूप से, इस प्रोटोकॉल HREM छवियों, जो उच्च संकल्प 3 डी दृश्य और morphometric विश्लेषण के लिए संगत है प्राप्त करने के लिए नियमित प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल दिवाआसानी से किसी भी मानक प्रयोगशाला स्थापित करने में रूपांतरित किया जा LD।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson Laboratory C57BL6
Ethyl Alcohol Pharmco-Aaper 111000200 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin Sigma HT501128-4L
Urea Sigma U5128 Clearing Solution
Glycerol Fisher scientific G33-4 Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate Invitrogen 15525-017 Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt Fisher scientific BP241925 Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt Sigma A6014 Infiltration Solution
Whatman paper GE 3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A Polysciences, Inc. 0226A-800 Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B Polysciences, Inc. 0226B-30 Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst Polysciences, Inc. 02618-12 Infiltration Solution
Embedding Molds Polysciences, Inc. 23185-1 16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds Polysciences, Inc. 18986-1 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences, Inc. 15899
Disposable Graduated Transfer Pipes VWR 414004-014
Petrl Dish VWR 25384-088 Embryo dissection
Forceps Inox Tip  ROBOZ RS-5015 Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep  ROBOZ RS-5153 Embryo dissection
Delicate Operating Scissor  ROBOZ RS-6700 Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes Falcon 352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes Falcon 352098
Ice Bucket Magic Touch Iceware International Corp. R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats VWR 89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats VWR 89106-770
Sodium Chloride MP Biomedicals 102892 PBS Solution
Potassium Chloride Sigma P0662 PBS Solution
Potassium phosphate monobasic Sigma P5405 PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S9390 PBS Solution
Digital Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Microtome Leica RM2265
Illuminator Carl Zeiss HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope Carl Zeiss Axio Zoom.V16
Stereo Microscope Olympus SZX16
Fiber Optic Light Source Leica KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade VWR 95057-832
Single Edge Dispenser Personna 62-0330-0000
ZEN Carl Zeiss pro 2012
Photoshop Adobe CS6 v13.0
Amira 3D Software Visage Imaging 5.4
Computer Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers VWR 40000-304
Standard Hot Plate Stirrer VWR 12365-382
Analytical Balance Mettler Toledo AB54-S

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References

  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
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  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
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3 डी छवियों के तेजी से अधिग्रहण का उपयोग उच्च संकल्प episcopic माइक्रोस्कोपी
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Zhang, H., Huang, J., Liu, X., Zhu, P., Li, Z., Li, X. Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54625, doi:10.3791/54625 (2016).More

Zhang, H., Huang, J., Liu, X., Zhu, P., Li, Z., Li, X. Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54625, doi:10.3791/54625 (2016).

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