Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Miljöföroreningar, särskilt de av nanopartikeln (NP) intervall (1-20 nm i diameter), har varit kopplade till fetma och andra neurodegenerativa sjukdomar på grund av förmågan att passera blod-hjärnbarriären 1-3. Förhöjda exponering för föroreningar kan framkalla inflammation i det centrala nervsystemet, inklusive hypotalamus en. En möjlig mekanism i vilken detta sker kan ske genom nanopartiklar inducerad aktivering av mikroglia (hjärnimmunceller) 4. Tidigare studier har använt in vivo modeller för att studera effekterna av NPS om hjärnans hälsa som är tidskrävande, dyrt, och inte direkt svara på frågan om hur NP påverka mikroglia. Mikroglia spelar en mångfasetterad roll i det centrala nervsystemet, inklusive underhåll av hjärnan mikro och kommunicerar med omgivande nervceller via frisättning av utsöndrade faktorer och cytokiner. Beroende på stimuli, kan mikroglia aktiveras till en M1 pro-inflammatoriska eller en M2 anti-inflammatoriskt tillstånd. Till exempel, M1 aktiverade mikroglia frisätta proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), medan M2 aktiverade mikroglia frisättning antiinflammatoriska cytokiner inkluderande interleukin-4 (IL-4). För att validera vår surrogat in vitro biosensor för bestämning av neuro av luftföroreningar, mätte vi microglial svar på 20 nm silvernanopartiklar (AgNPs). Målet med denna artikel är att beskriva hur ett in vitro microglial cellinje kan användas som en surrogatmarkör biosensor för att testa mus microglial svar på NP och hur microglial aktivering påverkar hypotalamus celler. Den långsiktiga avsedd tillämpning av denna validerad modell är att testa effekterna av verkliga föroreningar på hjärnans hälsa och neurodegenerativa sjukdomar. Vi tillhandahåller en detaljerad beskrivning av en analys in vitro 96-brunnsformat för mätning microglial aktivering och hypotalamus cellöverlevnad efter exponeringen av mic roglial konditionerade mediet.
Microglial aktivering bestämdes efter AgNP exponering med användning av en TNF-α enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA). För att bestämma effekten av aktiverat mikroglia på hypotalamiska celler, de AgNPs avlägsnas från microglial supernatanten (konditionerat medium) med användning av en filtreringsanordning. Filtreringsanordningen behåller cytokiner samtidigt utesluta AgNPs baserat på storlek. I korthet sattes supernatanten från mikroglia som behandlats med eller utan AgNPs uppsamlades, sattes till filtren, och centrifugerades vid 14000 x g i 15 min. Vi kunde sedan bestämma påverkan av mikroglia utsöndrade cytokiner på hypotalamus cellviabilitet. Celltoxicitet efter exponering för konditionerat medium (innehållande cytokiner) bestämdes via en resazurin baserad analys som tidigare beskrivits 5,6. Metaboliskt aktiva celler reducerar resazurin och producera en fluorescerande signal som är proportionell mot antalet viabla celler 7.
nt "> Det finns flera fördelar med att använda denna teknik framför andra (t.ex. co-kultur, trans-och uppställningar, eller in vivo). Vår modell ger möjlighet att direkt aktivera mikroglia och avgöra om utsöndrade faktorer är giftiga för nervceller 8 . Den nuvarande protokollet använder odödlig BV2 mikroglia stimuleras med nanopartiklar 20 nm i diameter, och odödlig murina hypotalamus celler (betecknade mHypo-A1 / 2) 9 för bestämning av efterföljande svar. Även om detta protokoll har optimerats för dessa särskilda villkor, metoderna kan vara ändrats för att användas i andra modeller av microglial celldöd, eller med andra celltyper, inklusive primär mikroglia och nervceller.Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Cells/Reagents | |||
Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
Equipment | |||
96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |