Summary
Studi di morfogenesi neuronale utilizzando Drosophila larvale arborizzazione dendritiche (bis) i neuroni beneficiano di visualizzazione situ delle proteine neuronali e epidermiche mediante immunofluorescenza. Descriviamo una procedura che migliora l'analisi di immunofluorescenza di DA neuroni e cellule epidermiche circostanti, rimuovendo il tessuto muscolare dalla parete del corpo larvale.
Abstract
Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila sono un modello popolare per lo studio dei meccanismi di morfogenesi neuronale. Da neuroni sviluppano in comunicazione con le cellule epidermiche che innervano e quindi le loro prestazioni di analisi da in situ visualizzazione di entrambe le proteine neuronally e epidermally espresse mediante immunofluorescenza. I metodi tradizionali di preparazione di filetti larvale per esperimenti di immunofluorescenza lasciano intatto il tessuto muscolare che copre la maggior parte della parete del corpo, che presenta diverse sfide per l'imaging neuronale e epidermiche proteine. Qui si descrive un metodo per la rimozione di tessuto muscolare dalla Drosophila filetti larvale. Questo protocollo permette l'imaging di proteine che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale rumore, e facilita l'utilizzo della microscopia super-risoluzione per studiare da sviluppo neurone.
Introduction
Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila forniscono un modello valido per lo studio dello sviluppo neuronale a causa della loro riconducibilità alla manipolazione genetica e la facilità con cui possono essere esposte. Questi neuroni sensoriali sono state fondamentali per l'identificazione di numerosi sentieri che controllano dendrite morfogenesi 1-3.
Quattro classi di Da neuroni (classe I - IV) innervare l'epidermide larvali. Questi neuroni si trovano tra la membrana basale e l'epidermide, con i loro dendriti formazione di matrici sostanzialmente bidimensionali 4,5. Dei quattro classi, la classe IV DA neuroni hanno le pergole più altamente ramificata e, come i neuroni sensoriali di altri animali, l'elaborazione di questi pergole richiede fattori intrinseci come pure spunti da tessuti vicini, in particolare l'epidermide, per il loro sviluppo 6-9 .
Gli studi per determinare come tale neuronale e infatti extra-neuronaleors controllare beneficio morfogenesi dei dendriti dalla capacità di rilevare l'espressione della proteina in situ mediante immunofluorescenza. La cuticola esterno della larva è impenetrabile agli anticorpi, ma questo impedimento è facilmente superabile dalla preparazione di filetti larvale attraverso metodi dissezione consolidati 10,11. Tuttavia, il tessuto muscolare parete del corpo che si trova appena interno alla membrana basale presenta varie sfide verso visualizzazione DA neuroni e cellule epidermiche. Innanzitutto, il tessuto muscolare, quali linee maggior parte della parete del corpo, oscura notevolmente segnali fluorescenti provenienti da tessuto neuronale o epidermico. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore nel campione. Secondo, molte proteine rilevanti possono essere espressi nel tessuto muscolare e nei neuroni o dell'epidermide. Questo segnale di fluorescenza muscolare derivato probabilmente ancora rilevamento oscura di un segnale di fluorescenza dal neurone o epidermide. Infine, i progressi nelle tecnologie di microscopia nol'imaging permesso w di campioni con risoluzione sub-diffrazione e può essere particolarmente utile nel discernere la localizzazione delle proteine che vengono espresse in neuroni e cellule epidermiche circostanti 12,13. Tuttavia, l'imaging via super-risoluzione benefici microscopia da un forte rapporto segnale-rumore e la vicinanza del campione al vetrino. Oltre a ridurre il rapporto segnale rumore, la parete del corpo larvali distanze muscolari DA neuroni dal vetrino, limitando così la risoluzione dell'immagine migliorata che può essere ottenuto con metodi di microscopia super-risoluzione. Oltre le sfide per l'analisi di immunofluorescenza, tessuto muscolare presenta una barriera alla registrazione elettrofisiologica da neuroni sensoriali nella parete del corpo larvale. La sua rimozione beneficia pertanto manipolazione neurofisiologica dei neuroni sensoriali 14.
Qui un metodo per la rimozione manuale di Drosophila tessuto muscolare larvale è descritto. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo permits immagini immunofluorescenza di proteine che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale-rumore per la visualizzazione di classe IV DA neuroni, e consente l'utilizzo della microscopia super-risoluzione per discriminare meglio relazioni spaziali di proteine e strutture cellulari in DA neuroni e l'epidermide.
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Protocol
Nota: La procedura per la rimozione muscolare (Figura 1) è una modifica di metodi precedentemente descritti per la preparazione di filetti larvale. Le fasi che precedono e seguono la rimozione del muscolo sono descritti brevemente e si rinvia al precedente lavoro 10, 11 per una descrizione più dettagliata.
1. Dissect Larva a Saline freddo
- Preparare una diluizione di lavoro di freddo HL3.1 salina 15 o Ca 2+ freddo -free HL3.1 salina 11 (Tabella 1). Posizionare la larva in un elastomero siliconico piatto con sufficiente soluzione salina fredda per coprire il fondo del piatto.
NOTA: Si veda la discussione per quanto riguarda la scelta di soluzione salina.
| 1x HL3.1 salina (pH 7,2) |
| 5 mM HEPES |
| 70 mM NaCl |
| 1,5 mm CaCl 2 (omettere per Ca 2+ salina-free) |
| 4 mM MgCl 2 |
| 10 mM NaHCO 3 |
| 5 mM trealosio |
| 115 mm di saccarosio |
| Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C |
| imita Composizione insetti emolinfa: Nota |
Tabella 1. Composizione del freddo Saline.
- Posizionare la larva con il lato ventrale. La superficie ventrale della larva può essere identificato dalle cinture dentical addominali e dal lato dorsale dai tubi tracheali larvali primarie in esecuzione da anteriore a posteriore. Allungare la larva in direzione antero-posteriore e il pin la testa e la coda a unelastomero di silicone dissezione piatto con perni di insetti. Utilizzare forbici dissezione fini per tagliare lungo la linea mediana ventrale, cominciando ad un'estremità e procedendo verso l'altro.
NOTA: Questo orientamento conserva il cluster dorsale comunemente studiate di DA neuroni. - Dopo la larva è tagliato aperto, appuntare i quattro angoli al piatto dissezione come se l'apertura di un libro. Utilizzare pinze per afferrare e rimuovere gli organi interni, tra cui il sistema nervoso centrale, intestino, e la trachea. Regolare i perni di insetti in modo che il filetto è tesa, ma non al massimo allungato.
NOTA: I muscoli sono ancorati alla parete del corpo ai confini dei singoli settori. Sebbene muscoli coprono la maggior parte della parete del corpo, sono assenti in una stretta regione vicino alla linea mediana dorsale.
Rimozione 2. muscolare
- Individuare la linea mediana dorsale della larva, dove il tessuto muscolare è assente. Posizionare una singola pinza polo tale da poter essere inserito sotto il tessuto muscolare nella piatta orientamento possibile.
- A partire dalinea mediana dorsale, vicino al confine anteriore del segmento, far scorrere con attenzione la pinza polo tra il muscolo e dell'epidermide, avendo cura di minimizzare il contatto tra le pinze e dell'epidermide.
- Estrarre la pinza verso l'alto per rompere l'attacco del muscolo alla parete del corpo in un punto di ancoraggio. Ripetere questo processo per il restante emi-segmento (s) di interesse.
NOTA: Questo protocollo ottimizza preservazione posteriore di ciascun campo dendrite da neurone. Per preservare la parte anteriore del campo dendrite, è preferibile inserire il polo pinza alla estremità posteriore di ciascun segmento. - Riadattare perni insetti tale che il filetto larvale è massimamente stirato in tutte le direzioni.
- Fissare il filetto mentre è ancora bloccato al piatto dissezione con freddo, preparati al momento formaldeide 4% in PBS per 25 min.
- Lavare 5 volte in PBS.
- Utilizzare pinze per estrarre delicatamente via il tessuto muscolare dai punti di ancoraggio restanti, avendo cura di ridurre al minimo contact con l'epidermide.
- Sblocca e rimuovere il filetto dal piatto dissezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eseguire tutte le successive di lavaggio, il blocco, e passi immunofluorescenza, come descritto in precedenza 11.
3. Montare il larvale Filetto
- Prima rimuovere la testa e la coda con le forbici dissezione sottili al fine di rendere il campione più piatta possibile. Montare il filetto su un vetrino in antifade di montaggio con la superficie interna del raccordo di fronte al vetrino.
- Posizionare un vetrino da microscopio sul vetrino e premere delicatamente per disperdere la soluzione di montaggio. Capovolgere il vetrino da microscopio sopra e sigillare il vetrino sul vetrino utilizzando smalto. Diapositive possono essere conservati a -20 ° C per almeno un mese.
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Representative Results
Dimostriamo l'utilità della procedura di rimozione del muscolo per migliorare rapporto segnale-rumore in esperimenti di immunofluorescenza di co-visualizzare le proteine di derivazione settate Coracle (Cora) e dischi-grandi dimensioni (DLG) insieme con classe IV DA neuroni marcati con il marcatore di membrana CD4- tdTomato.
Cora è stato utilizzato in precedenza per identificare tratti dove DA dendriti dei neuroni sono racchiusi da cellule epidermiche ed è uno dei molti fattori epidermici identificati che sono stati studiati in collaborazione con la morfogenesi e la funzione di da Neuron dendriti 4,6-9,16. Immunocolorazione con anti-DsRed per rilevare i neuroni (rosso) e di anticorpi anti-Cora (verde) è stata eseguita su filetti larvale con muscolare rimosso (muscolo-off) e con il muscolo intatto (muscolo-on). Per ciascuna condizione, il campo dendrite posteriore della classe IV da neurone è stato ripreso con un microscopio confocale a scansione laser. Le immagini sono state ottenute utilizzando idparametri di imaging entical per entrambe le condizioni. Abbiamo inoltre ripreso muscolo-on filetti con una maggiore potenza del laser per compensare le interferenze dal tessuto muscolare.
In campioni di muscolo-off, Cora potrebbe essere chiaramente individuato ai confini delle cellule epidermiche, nei tratti intermittenti lungo dendriti classe IV da neurone, e delinea il soma classe IV da neurone (Figura 2C). Al contrario, la sua localizzazione a questi domini era largamente oscurato nel muscolo-su campioni, anche quando è stata aumentata potenza del laser (Figura 2A-2B). Nel muscolo-su campioni, Cora è stato principalmente visualizzata nel muscolo, trachea, e alla giunzione neuromuscolare (NMJ), che diventano separato dalla parete del corpo come risultato della procedura di rimozione muscolare. Il segnale di fluorescenza che emana da questi tessuti oscurato la maggior parte del Cora che localizza a epidermica bordi delle celle e di dendrite tratti, tranne che per la stretta striscia di corpo wall nei pressi della linea mediana dorsale, dove il muscolo è assente. Cora che delinea la classe IV da neurone soma non è stato visualizzato nel muscolo-su campioni (Figura 2A-2B). La visualizzazione delle proteine espresse epidermally che hanno anche l'espressione muscolare di alta, come Dlg, è particolarmente problematico. In campioni di muscolo-on, la distribuzione delle Dlg nell'epidermide quasi completamente oscurata per fluorescenza dal muscolo e NMJ (Figura 2D). Dopo la rimozione del muscolo, Dlg è prontamente rilevata ai confini delle cellule epidermiche, a tratti intermittenti lungo dendriti da neurone, e delinea il soma classe IV da neurone (Figura 2E). Così, la rimozione del muscolo permette la visualizzazione delle proteine epidermally e neuronally espresse altrimenti oscurate da muscoli e dei relativi tessuti.
Inoltre, è stato osservato che l'intensità di fluorescenza del marcatore da neurone classe IV appariva ridotta nel muscolo-on filettirispetto ai filetti muscolo-off quando i parametri di imaging si sono svolte costante tra le due preparazioni del campione (Figura 2A, 2C). Con l'aumento della potenza del laser, l'intensità di fluorescenza apparente del marcatore classe IV da neurone potrebbe essere abbinato ai campioni del muscolo-off, ma il rumore di fondo è stato aumentato (Figura 2B, 2C). Pertanto, la rimozione muscolare migliora il rapporto segnale rumore nei nostri campioni.
Infine, abbiamo testato se i miglioramenti ottenuti rimuovendo il tessuto muscolare potrebbe essere applicata all'imaging di classe IV DA neuroni con risoluzione sub-diffrazione. Per fare questo, 3D microscopia illuminazione strutturata (SIM) per immagini è stata eseguita, che raggiunge circa 120 nm risoluzione laterale 13. Come con l'imaging confocale, abbiamo confrontato i filetti muscolo-on e muscolo-off immunostained per Cora e la classe IV DA neuroni, prima in condizioni di imaging identiche e poi, dopo l'ottimizzazione potenza del laser, esposizionitempo ure, e l'elaborazione di immagini per campioni di muscolo-on. Analogamente alla microscopia confocale, è stato osservato un segnale sostanzialmente ridotto di rumore nel muscolo-on rispetto ai filetti muscolo-off (Figura 3A-3C). Inoltre, ricostruzione delle immagini è apparso più nitida nei campioni di muscolo-off. Rispetto al muscolo-su campioni, meno artefatti apparenti sono state osservate e Cora tratti dendritiche erano più prontamente risolti (Figura 3B, 3C). Le membrane Dendrite potrebbe essere misurata a circa 114 nm di larghezza in filetti muscolo-off, ma sembrava essere 272 nm di larghezza nel muscolo-on filetti (figura 3D, 3E). Così, il nostro protocollo permette l'applicazione della microscopia super-risoluzione per la visualizzazione di classe IV DA neuroni.
Figura 1. Panoramica della procedura di rimozione del muscolo. Una larva è sezionato e appuntato ad un siliconeelastomero dissezione piatto. Per rimuovere il tessuto muscolare, un rebbio pinza viene inserito tra lo strato muscolare e epidermico cellule, partendo dalla linea mediana dorsale prossimità di una parete segmento (2.2). La pinza è tirato verso l'alto per rompere l'attaccamento tra il muscolo e il corpo a parete (2.3). Questo si ripete per segmenti di interesse e quindi la larva è fissata in formaldeide (2.5). Dopo la fissazione, pinze sono utilizzati per separare il tessuto muscolare residua dalla parete del corpo (2,7-2,8) La cuticola larvale e dell'epidermide sono raffigurati in arancione, classe IV DA neuroni in verde, e muscoli in rosso. Inserti in (2.2) e (2.7) rappresentano viste in sezione trasversale di un singolo larvale emi-segmento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rimozione muscolareMigliora confocale Imaging di neuroni DA e l'epidermide immunofluorescenza di Cora. (Verde, AC) o Dlg (verde, DE) è stato rilevato con il tessuto muscolare (A, B, D) e senza tessuto muscolare (C, E). Classe IV DA neuroni sono stati etichettati con il driver GAL4 '477 per esprimere UAS-CD4: tdTomato e rilevati con un anticorpo anti-DsRed (rosso). Campioni di muscolo-on e muscolo-off etichettati per Cora sono stati ripreso con un microscopio confocale in condizioni identiche (A, C) e quindi con una maggiore potenza del laser per compensare le interferenze muscolare (B). campioni di muscolo-on e muscolo-off etichettati per Dlg sono stati ripresi in condizioni ottimizzate singolarmente. Tutte le immagini sono confocale Z-proiezioni. La parte centrale (verde) e inferiore (rosso) pannelli mostrano singoli canali; i pannelli superiori sono i canali unite. Il confine del tessuto muscolare (linee tratteggiate), la classe IVda neurone soma (frecce ciano), Cora e Dlg Dendrite tratti (frecce bianche), i confini delle cellule epidermiche (frecce magenta), NMJ (frecce gialle), e trachea (frecce arancioni) sono indicati. Barra di scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. muscolare rimozione Consente Super-risoluzione di Imaging di DA neuroni e cellule epidermiche. Rilevamento immunofluorescenza di Cora (verde) della classe IV DA neuroni con muscolare intatto (A, B) e dopo la rimozione del muscolo (C). Classe IV DA neuroni sono stati etichettati come in Figura 2 campioni di muscolo-on e muscolo-off sono stati ripresi con un microscopio illuminazione strutturata prima in condizioni identiche (A, C).; il campione di muscolo-onin (A) è stata poi ri-ripreso con tempi maggiore potenza laser e di esposizione per compensare interferenze muscolare (B). Tutte le immagini sono Z-proiezioni. I pannelli centrale (verde) e inferiore (rosso) di CA mostrano singoli canali. Il pannello superiore di AC è una fusione. confini delle cellule epidermiche (frecce magenta), tratti dendriti Cora (frecce bianche), e un artefatto ricostruzione dell'immagine (punta di freccia gialla) sono indicati. Insets nei pannelli inferiori di B e C corrispondono a D ed E, rispettivamente. La larghezza apparente della membrana dendrite è mostrato nel muscolo-on (D) e (E) campioni muscolo-off. Scala bar = 3 micron (AC) e 0,5 micron (D, E). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui un protocollo è descritto per la rimozione manuale del tessuto muscolare da Drosophila filetti larvale. Questo protocollo modifica precedentemente descritto tecniche di dissezione larvali 10,11. Dopo la larva è sezionato in un piatto elastomero siliconico, la linea mediana dorsale si trova. Una singola pinza polo, nella sua più piatto possibile orientamento, è attentamente inserito tra il tessuto muscolare e l'epidermide, vicino alla linea mediana dorsale. Le pinze sono delicatamente tirati verso l'alto per il tessuto muscolare separati da un punto di ancoraggio in ogni segmento larvale di interesse. Il filetto larvale viene poi fissato in formaldeide freddo dopo che pinze sono reimpiegati per tirare fuori il muscolo dai punti di ancoraggio restanti.
Mentre si è tentati di eseguire la totalità del muscolo rimozione procedura di post-fissazione, troviamo che muscolo allungato, una volta fissato, resta appiattito e strettamente apposto per l'epidermide, anche dopo il distacco da un punto di ancoraggio, il renderingdifficile manipolare senza danneggiare il tessuto sottostante. tessuto muscolare Inoltre, nella nostra esperienza, fisso è fragile e facilmente lacrime, impedendone la rimozione completa dalla parete del corpo. Al contrario, quando il muscolo è staccato da un punto di ancoraggio prima del fissaggio, si contrarrà verso il punto di ancoraggio rimanente durante la fissazione, lasciando mozziconi di tessuto che può essere facilmente afferrato dalla pinza e tirato dalla parete del corpo larvale.
Per preservare meglio campioni, notevole attenzione deve essere presa per minimizzare il contatto tra le pinze e l'epidermide durante la procedura di rimozione muscolare. Come risultato, il protocollo può aggiungere alcuni minuti per tecniche di dissezione precedentemente descritte 10,11. Per evitare la degradazione dei tessuti, il numero di larve che vengono sezionati prima del fissaggio deve essere limitato in modo che il tempo trascorso è non più di 25 minuti. Inoltre, si consiglia di testare più coppie di pinze - pinze dello stesso model può variare notevolmente in forma e nitidezza - e regolando la misura in cui filetti sono allungati prima della rimozione muscolare al fine di migliorare la conservazione dei tessuti e la velocità dissezione.
Infine, si consiglia di sperimentare con l'uso di Ca2 + -free salina HL3.1 contro salina HL3.1 standard durante la dissezione larvale. In assenza di calcio, contrazioni muscolari larvali sono notevolmente ridotte. Così, filetti larvale può essere più facile da manipolare quando sezionato in Ca 2+ -free HL3.1 salina. Tuttavia, troviamo che la contrazione muscolare crea spazio tra il muscolo e l'epidermide e questo può facilitare l'inserimento di pinze tra questi tessuti riducendo al minimo il rischio di danni all'epidermide. Come risultato, HL3.1 standard può essere preferibile per preservare l'integrità dell'epidermide e DA neuroni. Si ottiene buoni risultati con soluzione salina e la scelta è lasciata all'utente.
Mentre i nostri aumenti di protocollola durata e la complessità delle tecniche di dissezione precedentemente descritte 10,11, offre diversi miglioramenti che sono utili per l'imaging neuroni sensoriali larvali e cellule epidermiche. In primo luogo, permette l'imaging di proteine neuronally e epidermally espresse che sono altrimenti celate da tessuto muscolare. In secondo luogo, migliora il segnale di fluorescenza di rumore. Infine, consente di utilizzare la microscopia super-risoluzione per la discriminazione superiore di proteine relazioni spaziali in DA neuroni e l'epidermide. La qualità delle immagini migliorata che osserviamo dopo la rimozione muscolare è probabilmente il risultato di un ridotto assorbimento di fotoni e disperdendo così come la distanza ridotta tra il campione e il coprioggetto. Sebbene non dimostrato qui, rimozione muscolare probabile migliora anche l'accesso anticorpo per l'epidermide e DA neuroni, migliorando la qualità di immunofluorescenza. Greater anticorpo accessibilità può essere particolarmente utile per i protocolli immunofluorescenza eseguiti in Absence di un tessuto offerente 4 permeabilizzante.
I miglioramenti ottenuti con l'uso di questo protocollo sono suscettibili di beneficiare studi dei fattori neuronali e epidermiche che regolano la morfogenesi dei dendriti dei neuroni sensoriali. Inoltre, la rimozione del muscolo ha già facilitato studio elettrofisiologico dei neuroni sensoriali nella parete del corpo larvale e una versione modificata di questo protocollo può essere utile per i futuri studi che impiegano la manipolazione neurofisiologica dei neuroni sensoriali larvali. Infine, una versione modificata di questo protocollo può essere utile nei confronti di altre applicazioni come ad esempio l'isolamento dei singoli neuroni DA per l'espressione genica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Gary Laevsky per le discussioni utili su microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 di ERG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
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