Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

الكشف عن doi: 10.3791/54715 Published: October 19, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وطفيلي، المثقبيات البروسية، هو العامل المسبب للأمراض التي تصيب الإنسان (عبر المثقبية البروسية الغامبية والمثقبية البروسية الروديسية) والحيوانات (عبر المثقبية البروسية البروسية) في جميع أنحاء أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. وينتقل المرض إلى المضيف الثدييات عن طريق اللعاب من ناقلات ذبابة التسي تسي. كل من الإنسان وداء المثقبيات الأفريقي الحيوانية تسبب عبئا اقتصاديا كبيرا في المناطق الموبوءة، وقليلة الأدوية المتاحة أو في مجال التنمية لعلاج إما المرض. فهم آليات التهرب المناعة أمر بالغ الأهمية لتطوير عقاقير لداء المثقبيات. تباين الأنتيجين للكثيفة، سطح البديل البروتين السكري (VSG) معطف الذي يغطي الطفيلي هو إحدى الوسائل الرئيسية التي T. البروسية يتهرب استجابة الأجسام المضادة الثدييات. وجود ما يقرب من 2000 أنواع من الجينات VSG في الجينوم المثقية، ولكن كتب واحد فقط في أي وقت من الأوقات من أحد ~ 15 مورينداتاهيتيانونيمواقع سيون. "التبديل" من VSG أعرب يمكن أن يحدث إما عن طريق نسخ الجين VSG في الموقع التعبير النشط، أو عن طريق تفعيل النسخي من موقع تعبير صامت سابقا (إعادة النظر في 1).

على الرغم من الكثير من العمل وقد كرس لفهم الاختلاف الأنتيجين في T. البروسية، والعوامل التي تؤثر على تردد التبديل لا تزال غير مفهومة. تعرقلت الدراسات حتى الآن من حقيقة أنه في حين أن يحدث التحول عشوائيا في المختبر، ترددات التحول منخفضة جدا، بناء على أمر من 1 في حوالي 10 6 خلايا 2. وهذا يجعل من الصعب قياس ما إذا كان إعطاء زيادة عامل أو تنخفض وتيرة التحول، منذ التحول من الصعب كشف في المقام الأول. قبل عام 2009، كانت طرق لعزل المحولات في عدد معين من السكان طويلة وكثيفة العمالة. هذه الركض المثقبيات من خلال الفئران تحصين ضد VSG المهيمن ومن ثم حصاد الخلايا شملتفي اليوم التالي أو عد مئات من الخلايا المناعي 4،5. وتعتمد استراتيجية أخرى في الاختيار لمقاومة المخدرات لعزل المحولات 6. لأن المثقبيات الأفريقي نمت في المختبر يتم عادة تتكون من عدد كبير من السكان معربا عن البديل رئيسي واحد، ويبلغ عدد سكانها أقل بكثير من المحولات التعبير عن المتغيرات بديلة، نشير إلى البديل الرئيسي في هذه الورقة باعتبارها المهيمنة، بدءا VSG. في القيام بذلك، ونحن في أي وسيلة ترغب في الإيحاء بأن هذا البديل الرئيسي لديه لياقة بدنية أكبر من المتغيرات الأخرى في عدد السكان.

نحن هنا تصف طريقة التي يمكن قياس موثوق عدد المثقبيات تعبر عن VSG غير المهيمن في عدد معين من السكان في 3-4 ساعة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لعند واحد يريد التأكد ما إذا كان التلاعب الجيني معين أو العلاج من تعاطي المخدرات يزيد من عدد الخلايا تحولت في عدد السكان. بدلا من تخليص السكان من الخلايا معربا عن افعلminant، بدءا VSG من خلال العقاقير أو عن طريق المناعية، يتم التخلص من هذه الخلايا عن طريق طلاء لهم أولا مع حبات مغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة ضد VSG المهيمن ومن ثم عزلهم على عمود المغناطيسي. السكان تحولت بعد ذلك جمع في التدفق من خلال وملطخة مرة أخرى مع fluorophore المسمى الأجسام المضادة لمكافحة VSG لتحديد الملوثات. ويتحقق الكمي من خلال إضافة عدد محدد من الخرز العد المطلقة على كل عينة بحيث نسبة من الخرز إلى خلايا يمكن تحديد وتستخدم لتحديد عدد من المحولات في عدد السكان 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، فمن الضروري للحفاظ على الخلايا على الجليد. وينبغي أيضا أن تستخدم وسائل الإعلام في جميع أنحاء الباردة.

حصاد 1. عينة

  1. تنمو معلن 427 المثقبيات سلالة الدم إلى كثافة ،5-1٬000٬000 / مل. فمن الأفضل أن تبدأ الثقافات مع عدد قليل من الطفيليات. تدور باستمرار 50 × 10 6 خلايا / عينة لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. تأكد من ترك 1 × 10 6 خلايا في الثقافة في وقت لاحق استخدام عناصر التحكم كما الإيجابية والسلبية الأضداد.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها على المثقبيات معزولة من دم الحيوانات (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  2. ماصة أو صب من أكثر من طاف (ترك حوالي 750 ميكرولتر). نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  3. تدور الخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج في microcentrifuge وإزالة طاف.

2. وضع العلامات المغناطيسي

  1. Resuspend الخلايا في 150 مستنبت ميكرولتر (HMI-9 وايمصل عشر مثلا) + الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة.
    ملاحظة: يرصد-VSG مكافحة الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 01:50. من المهم أن استخدام الأجسام المضادة الأولية لمكافحة VSG التي لم يتم المسمى مع fluorophore.
  2. خلايا دوامة باستخدام دوامة محول-60 بسرعة 6-8 في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يغسل مع 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل.
  3. تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج ونضح طاف. تغسل مع 1 مل HMI-9 مع المصل وتدور على النحو الوارد أعلاه. نضح طاف. بيليه resuspend في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل.
  4. إضافة 110 ميكرولتر من خلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MSC) ميكروبيدات. استخدام لمكافحة فأر، المضادة للأرنب، أو حبات مكافحة البيوتين بما يتناسب مع الأجسام المضادة لمكافحة VSG الأساسي. اخلط جيدا. خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. بينما الخلايا vortexing ل، مجموعة واحدة المغناطيسي تنشيط فصل العمود / عينة على المغناطيس الانفصال. يجب التأكد من أن إعادةceptacle (نستخدم أنبوب الطرد المركزي 15 مل) تحت العمود لجمع التدفق من خلال. إعداد جهاز في غرفة باردة.
  6. إضافة 2 مل من HMI-9 مع المصل إلى العمود الوزراء. بعد فتيلة مكان أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحت العمود لجمع التدفق من خلال من كل عينة.
  7. بعد حضانة 10 دقيقة في الخطوة 2.4، إضافة 800-1،000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. تغسل مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وتكرار ترك 100 ميكرولتر من طاف.
  8. نفض الغبار أنبوب الطرد المركزي بقوة وفحص أنبوب للتأكد من أن بيليه هو معلق تماما. إضافة 1 مل من HMI-9 مع المصل وماصة صعودا وهبوطا للتأكد من أن الخلايا معلق أيضا.

3. الفصل المغناطيسي

  1. ضمان تستعد الأعمدة كما هو موضح أعلاه. تطبيق الخلايا إلى العمود. جمع التدفق من خلال بخلايا معربا عن VS غير المهيمنج 1 مل من المتوسط ​​+ المثقبيات وعادة ما يستغرق 6-7 دقيقة لتدفق من خلال العمود.
  2. غسل 2X مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وجمع التدفق عن طريق الأنبوب نفسه كما في الخطوة 3.1.
  3. الفجوة التدفق من خلال (3 مل) في اثنين من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
    ملاحظة: هذه يمكن أن تكون مجتمعة في وقت لاحق أو نصف يمكن استخدامها لعزل الحمض النووي الريبي، الخ
  4. إزالة عمود من المغناطيس. إضافة 3 مل من HMI-9 مع المصل إلى عمود وعمود يغرق في أنبوب 15 مل الطرد المركزي للحصول على خلايا التي تعبر عن الانطلاق، المهيمن VSG. إزالة 300 ميكرولتر من المواد مزال لتحليلها لاحقا. تبقى هذه الخلايا على الجليد.
  5. لاستخدامها بوصفها إيجابية ومراقبة سلبية، واتخاذ ما يقرب من 1 مليون خلية من ثقافة ابتداء من خلايا سيطرة متزايدة على 37 درجة مئوية (التي لا يتوقع أن التبديل في كثير من الأحيان) وماصة لهم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    ملاحظة: سوف تكون ملطخة الخلايا السيطرة الإيجابية مع الأجسام المضادة المسمى fluorophore في الخطوة 4.1. سلبي الخلايا السيطرة ريمافي غير ملوثين خلال الفترة المتبقية من البروتوكول.
  6. عينات تدور التدفق من خلال وإيجابية العينة الضابطة الأجسام المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف.
    ملاحظة: آخر قسامة 300 ميكرولتر من خلايا مزال يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إيجابية لمكافحة VSG تلطيخ.

4. تلطيخ في التعرف على الملوثات والتي تتيح أفضل طريقة

  1. عينات التدفق من خلال و resuspend والخلايا السيطرة الإيجابية في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + الابتدائي، وصفت fluorophore، الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة.
    ملاحظة: يرصد المسمى مكافحة VSG الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 1: 1000. وصفت fluorophore، ويمكن مكافحة VSG يكون من المصدر نفسه والأضداد توضيحها في الفصل بالاعمال step.There يجب أن يكون 3 مل من عينة التدفق من خلال في اثنين من أنابيب microcentrifuge التالية خطوة 3.5.
  2. لتحليل كل من التدفق من خلال التدفق الخلوي، والجمع بين الكريات في أنابيب microcentrifuge اثنين حين إعادة سوس-بانتظار العينات في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + مكافحة VSG الأجسام المضادة. اخلط جيدا.
  3. خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم.
  4. غسل الخلايا مع 1 مل من HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف. خلال هذه تدور الماضي، وتدور أسفل-عينات مزال من الخطوة 3.4 وعينة السيطرة السلبية.
  5. و resuspend كل التدفق من خلال عينات مزال في: 148.5 ميكرولتر HMI-9 مع المصل، 25 ميكرولتر الخرز العد المطلق و 1.5 ميكرولتر التأيد Propidium تلطيخ حل (175 ميكرولتر المجموع). و resuspend العينات الإيجابية والسلبية مراقبة الأجسام المضادة في 175 ميكرولتر HMI-9 مع المصل. تأكد من تسجيل عدد من الخرز العد المطلقة / 25 ميكرولتر من أجل الكثير معين المستخدمة.
  6. تشغيل جميع العينات من خلال قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات. الخلايا الميتة وصمة عار كما PI - VSG +. المحولات وصمة عار كما PI - VSG - 8.
  7. حساب تبديل الترددات باستخدام التدفق الخلوي البيانات.
    ملاحظة: للحصول على إرشادات حول كيفية حساب الترددات التحول، يرجى الرجوع إلى ملف إضافي التدفق الخلوي Calculations.docx والجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم استخدام أسلوب الموصوفة هنا لإثبات أن فواصل المزدوج حبلا داخل الموقع التعبير VSG زيادة عدد المحولات في عدد سكانها 8. هنا، وتبين لنا نتائج ممثل من سكان المثقبيات التي تم بفعل مماثل لتوليد مزدوج الجديلة في موقع التعبير. قارنا هذه المثقبيات إلى تلك التي لم يحملوا على توليد مزدوج الجديلة. ويبين الشكل 1 تدفق التمثيلي الخلوي المؤامرات من خلايا الامم المتحدة والتي يسببها والتي يسببها التي تم جمعها في التدفق من خلال المغناطيسي خلية تنشيط العمود الفرز. لهذه التجربة خاصة أن VSG بدءا المهيمن VSG2. وتظهر لوحات اليسار مباشرة من الشكل 1A إلى الأمام والجانب مبعثر، والذي يسمح البوابات التي يمكن استخلاصها حول الخرز العد المطلقة والخلايا التي تظهر إلى الأمام والجانب مبعثر التوقيع الذي هو سمة من الخلايا الحية. لاحظ أنه يمكن البواباتيمكن استخلاصها لتشمل المزيد من الخلايا وذلك لأن الخلايا الميتة يمكن القضاء عليها مع PI تلطيخ. ومع ذلك، يجب أن تظل البوابة الشيء نفسه بالنسبة لجميع العينات. لوحات الأيمن من الشكل 1A تظهر فقط تلك الخلايا التي تقع ضمن بوابة "لايف" على لوحات الأيسر. الخلايا التي صمة عار إيجابيا لPI (Q1 و Q2) هي الخلايا الميتة. الخلايا التي صمة عار إيجابيا لVSG المهيمن وسلبا لPI في Q3 والملوثات. الخلايا التي صمة عار سلبا على حد سواء PI وVSG المهيمن في Q4 هي الخلايا الحية التي تحولت. يمكن للمرء أن يلاحظ أن نسبة الملوثات في Q3 أقل عن تلك الخلايا حيث تم يسببها كسر مزدوج الجديلة. ومع ذلك، فإن النسب في Q3 لا يمكن أن تستخدم لتتعرف ما إذا كانت هناك المزيد من المحولات في عدد معين من السكان. ما هي الا من خلال مقارنة نسبة عدد الخلايا في Q4 لعدد من الخرز التي تم جمعها يمكن للمرء أن حساب الترددات التبديل. ويبين الجدول 1 الأرقام التي تم الحصول عليها من فلوقطع الخلوي ث وطريقة لحساب المحولات في المئة في هؤلاء السكان. وقد أجريت هذه الحسابات في 3 عينات بيولوجية للحصول على ترددات التحول لوحظ ظهور في الشكل 1B. مستوى التحول العشوائية في المختبر منخفضة جدا، كما يحسب هنا بمعدل 9.53 × 10 -5، بينما الأمر الذي أدى إلى نتائج كسر في 1-6 × 10 -3 الخلايا التي تحولت إلى VSG غير المهيمن.

شكل 1
الشكل 1. عزل النوعي والكمي للسكان المثقبيات مبدلة. (A) التدفق الخلوي تظهر أجزاء من المثقبيات في جزء التدفق من خلال اتباع مجموعة من غير المحولات-على المغناطيسي خلية تنشيط العمود الفرز. تتم مقارنة مجموعة من الخلايا مع I-SCEI مزدوج الجديلة التي يسببها لمجموعة من الخلايا دون الف يسببهاحزب العدالة والتنمية. (ب) المحسوبة تبديل الترددات للخلايا التي لديها أو لم يسببها مع I-SCEI كسر المزدوج تقطعت بهم السبل. الرقم على مؤامرة يمثل نتائج الذيل اثنين، اختبار T أونبايريد. أشرطة الخطأ تمثل SD. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1. حسابات التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 1
الجدول 1. حساب ترددات التبديل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وفيما يتعلق تقنية تجريبية، وأهم عنصر من البروتوكول هو الحفاظ على جميع العينات البرد. المثقبيات استيعاب بسرعة كبيرة الأجسام المضادة بد أن سطحها ولكن هذه العملية هو الحركة التي تعتمد، ولا تؤثر على فحص طالما يتم الاحتفاظ الخلايا في 4 درجات مئوية. وينبغي دائما أن تبقى جميع العينات على الجليد، وينبغي أن يتم pipetting لبسرعة للحد من التعرض إلى 25 ° C بيئة المختبر. يجب أن تكون باردة HMI-9 مع المصل متوفر في بداية التجربة ويجب أن تبقى على الجليد طوال الوقت. ويجب أن يتم بمعزل عن المثقبيات عن طريق تشغيل بينهم أكثر من العمود في غرفة باردة، لأنه يأخذ 5-7 دقيقة لتشغيل عينة 1 مل من خلال العمود. إذا كان هناك مزيد من العينات من وحدات الفصل المغناطيسي المتاحة، والعزلة المغناطيسي يمكن القيام به في تسلسل، طالما يتم الاحتفاظ العينات لا يتم فصل بنشاط على الجليد.

ومن الأهمية بمكان أيضا أن العينات تكون جيدا بالعربية مختلطةثالثا غسل الماضي بعد الحضانة مع ميكروبيدات وقبل العزلة على مغناطيس. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق عبها العدواني للأنبوب الطرد المركزي أو vortexing لضوء. لا بيليه أو كتل من الخلايا يجب أن تكون واضحة قبل إضافة العينة إلى عمود الفصل، والتي يمكن التحقق من خلال النظر في مستوى المجهر الضوئي. إذا كتل موجودة، ومستوى التلوث في العينة التدفق من خلال الخلايا معربا عن VSG المهيمن عادة ما يكون أعلى بكثير مما هو مطلوب. عند تنفيذ العملية الحسابية لعدد من المحولات في العينة في نهاية البروتوكول، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار ما إذا كان استخدام كافة التدفق من خلال لتحليل تدفق cytometric، أو ما إذا كان يستخدم نصف. إذا تم استخدام نصف فقط، يجب أن تضاعف إجمالي عدد المحولات تحسب بنسبة 2.

عند إزالة طاف خلال خطوات غسل، فإنه ليس من الضروري ماصة من كل قطرة الماضي، وعادة 15-25 ميكرولتر همغادر المحيطة بيليه من الخلايا. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا خلال المراحل النهائية من تلطيخ والغسيل، لأنه في هذه المرحلة نادرا ما ينظر إلى الكريات في عينات التدفق من خلال لأن هناك عدد قليل جدا من تحول الخلايا.

بينما عادة ما يتم تنفيذ وصمة عار مكافحة VSG النهائية مع النقى المسمى fluorophore مكافحة VSG الأجسام المضادة، وهي أول وصمة عار مكافحة VSG قبل العزلة المغناطيسية يمكن القيام به مع الأجسام المضادة النقي أو المصل. وقد استخدمنا أيضا طاف مفاعل حيوي مشتق من الهجينة معربا عن أضداد VSG. بغض النظر، والمواد المستخدمة لوصمة عار الأولية يجب أن تكون معاير لضمان فصل جيد من الخلايا التي تفعل أو لا تعبر عن السائد، VSG البدء.

ومن المعتاد بالنسبة للسكان من الخلايا في التدفق من خلال أن تكون ملوثة بخلايا معربا عن VSG المهيمن. في حين أن هذا التلوث يجب أن يكون الحد الأدنى، في تجربتنا أنه من النادر للسكان أن يكون خاليا تماما من الخلايا التعبيرجي في VSG المهيمن. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الخلايا التي مرت على إجراء العزل لا وصمة عار كما الزاهية مع مكافحة VSG الأجسام المضادة لتلك التي لم تكن من خلال هذا الإجراء. نحن نفترض أن شيئين يمكن أن تفسر هذا الاختلاف. الأول هو أن الغزل المثقبيات يؤدي إلى سفك VSG، وهناك العديد من يدور يشارك في إجراء العزل. ومن المتوقع هذا للتقليل من شدة إشارة لوصمة عار مكافحة VSG النهائية. والثاني هو أن الخطوة الأولى من البروتوكول ينطوي تلطيخ مع الأجسام المضادة لمكافحة VSG الأساسي. إذا كان الحواتم معترف بها من قبل الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الخطوة الأولى هي نفس أو تسد الحواتم معترف بها من قبل الأجسام المضادة في وصمة عار النهائية، يتوقع المرء من شدة إشارة إلى أن تكون أقل مما لو استخدمت الأجسام المضادة واحد فقط. لهذا السبب من المهم أن يعاير الأجسام المضادة التي يتم استخدامها في الخطوة النهائية، بحيث الإشارة من خلية الملون بشكل إيجابي هو ما يقرب من اثنينأوامر من حجم أعلى من خلية ملطخة سلبا. بهذه الطريقة، حتى لو انخفضت كثافة إشارة من خلية تلطيخ إيجابيا في الخلايا التي خضعت لإجراء العزل، وهذه الخلايا إيجابية ستظل فصل جيد من الخلايا سلبية على مؤامرة التدفق الخلوي. إذا كان يتم استخدامها لصناعة السيارات في التعويض، ينبغي إعداد عينات السيطرة وصمة عار واحدة. متاحة للشراء من منشأة الأجسام المضادة سلون مركز التذكاري للسرطان monocolonal الأجسام المضادة التي كنا قد ولدت. لقد كان لدينا أفضل نجاح باستخدام الخالي من الملصقات وحيدة النسيلة مفتش الأضداد. وقد قمنا بتنفيذ بروتوكول مع الأجسام المضادة VSG بولكلونل، ولكن يمكن أن الأجسام المضادة تعترف أحيانا VSGs البعض يفضل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ذلك. هوية VSG يمكن تحديد كدنا] تسلسل VSG الناتجة عن التضخيم من متواليات المحفوظة في VSG 3'UTR وزعيم تقسم. والأجسام المضادة خاص يمكن اختبارها للخصوصية في السابق معزولة تحولوقد تم تحديد الخلايا الذي هو هوية VSG كما هو موضح فقط.

بروتوكول المعروضة هنا لديها عدد من المزايا. ويمكن استخدامه على حد سواء لعزل المحولات لتحليلها لاحقا وتحديد عدد من المحولات في عدد معين من السكان. فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لعزل متغير معين من الفائدة، طالما تتوفر لهذا البديل الأجسام المضادة. ومن الممكن أيضا لتنفيذ هذا البروتوكول باستخدام المثقبيات معزولة عن الحيوانات، شريطة أن خلايا الدم الحمراء وخرج باستخدام الخرز مكافحة Ter119 المغلفة المغناطيسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نحن لم اختبار الحد الأدنى لعدد من المثقبيات مطلوب، ولكن نحن نفذت بنجاح بروتوكول باستخدام 2،5-10٬000٬000 المثقبيات من 250 ميكرولتر من الدم. وأخيرا، فإن بروتوكول يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تحليل التذبذب للحصول على وتيرة التحول في عدد معين من السكان.

الإجراء العزلة هو F جداأست، مع 3-4 ساعة من البداية الى النهاية وفقا لعدد من العينات، وبالتالي هو أكثر فعالية من الأساليب السابقة التي تتطلب تحصين مسبق من الفئران أو السلالات المتخصصة التي تحتوي على علامات مقاومة المخدرات. يقتصر أسلوب من حقيقة أن الأجسام المضادة ضد VSG بدءا مطلوبة، ولكن. وبدون هذه الكواشف، قد يكون أسلوب بديل مثل VSG وما يليها اختيار الأنسب لقياس الذي يجري أعرب VSGs في عدد معين من السكان 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونود أن نعترف جورج الصليب للحصول على المشورة العامة في الأحياء المثقبيات. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس الحملة العالمية للتعليم منحة لDS، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (DGE-1325261) لMRM والمعاهد الوطنية للصحة / NIAID (منحة # AI085973) إلى FNP. نشكر Galadriel الكوخ، مينر للاستخدام من سلالة يحتوي على موقع الجين والاعتراف I-SCEI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
unlabeled anti-VSG antibody n/a n/a VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody n/a n/a VSG antibody is made in house
HMI-9 media n/a n/a HMI-9 is made in house
Propidium Iodide BD Pharmingen 556463
CountBright absolute counting beads Thermofisher Scientific C36950
LD columns Miltenyi Biotech 130-042-901
MACS magnet Miltenyi Biotech 130-042-303
MACS magnetic separator Miltenyi Biotech 130-042-302
vortex adapter-60 ThermoFisher scientific AM10014
flow cytometer Coulter n/a
flow cytometer analysis software FloJo n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195, (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92, (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80, (1), 65-75 (1996).
  4. Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99, (Pt 1), 67-75 (1989).
  5. Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82, (1), 63-80 (1981).
  6. Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84, (2), 189-201 (1997).
  7. Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6, (7), e161 (2008).
  8. Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459, (7244), 278-281 (2009).
  9. Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131, (3), 505-515 (2007).
  10. Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347, (6229), 1470-1473 (2015).
الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulz, D., Mugnier, M. R., Boothroyd, C. E., Papavasiliou, F. N. Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54715, doi:10.3791/54715 (2016).More

Schulz, D., Mugnier, M. R., Boothroyd, C. E., Papavasiliou, F. N. Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54715, doi:10.3791/54715 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter