Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

איתור של doi: 10.3791/54715 Published: October 19, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הטפיל protozoan, Trypanosoma brucei, הוא סוכן סיבתי של מחלות המשפיעות בני אדם (דרך Trypanosoma brucei gambiense ו Trypanosoma brucei rhodesiense) ובעלי חיים (דרך Trypanosoma brucei brucei) ברחבי אפריקה שמדרום לסהרה. החיידק מועבר המארח יונק דרך הרוק של וקטור זבוב הצה צה. שני האדם מחלת השינה Animal לגרום לנטל כלכלי חמור באזורים אנדמיים, ומעטים סמים זמינים או בפיתוח לטיפול או מחלה. הבנת מנגנוני התחמקות חיסון היא קריטית להתפתחות של תרופות עבור trypanosomiasis. וריאציה אנטיגני של המשטח הצפוף, Variant גליקופרוטאין (VSG) המאפשר לכסות את הטפיל היא אחד האמצעי העיקרי שבאמצעותו ט brucei מתחמקת תגובת הנוגדנים היונקת. כ -2,000 וריאנטים של גן VSG קיימים בגנום trypanosome, אבל רק אחד הוא עבד בכל זמן נתון מאחד ~ 15 הבעהאתרי שיאון. "מיתוג" של VSG הביע יכול להתרחש גם על ידי העתקת גן VSG לתוך אתר הביטוי הפעיל, או על ידי הפעלת תעתיק של אתר ביטוי שותק בעבר (הנסקרת ב 1).

למרות העבודה הרבה הוקדשה וריאציה אנטיגני להבנת בט' brucei, הגורמים המשפיעים מיתוג תדר עדיין הם הבינו היטב. מחקרים שנערכו עד כה כבר הקשה על ידי העובדה כי בעוד מיתוג מתרחש stochastically במבחנה, תדרי מיתוג נמצאים ברמות נמוכות מאוד, בסדר גודל של 1 בסביבות 10 6 תאים 2. זה מקשה למדוד אם עליות גורם כפל או מקטין תדר מיתוג, מאז המיתוג קשה לזהות מלכתחילה. לפני 2009, שיטות לבידוד בוררים באוכלוסיית נתונה היו ממושכות ועבודה אינטנסיבית. passaging אלה כללו trypanosomes באמצעות עכברים שחוסנו נגד VSG הדומיננטי ואז תאי קצירה3 כעבור יום, או לספור מאה תאים על ידי immunofluorescence 4,5. אסטרטגיה נוספת מסתמכת על בחירה עבור עמידות לתרופות לבודדת בוררת 6. בגלל trypanosomes אפריקה לגדל במבחנה הן בדרך כלל מורכבת אוכלוסייה גדולה להביע גרסה אחת גדולה, ואוכלוסייה קטנה בהרבה של בוררים להביע הגירסות חלופיות, אנו מתייחסים הגרסה הגדולה ברחבי נייר זה כמו VSG הדומיננטי, החל. בעשותו כן, אנו בשום פנים ואופן לא רוצה לרמוז גרסה מרכזי זה יש כושר יותר מאשר גרסאות אחרות באוכלוסייה.

כאן אנו מתארים שיטה שיכולה למדוד את מספר מהימן של trypanosomes להביע VSG הלא דומיננטית באוכלוסיה נתונה ב 3 - 4 שעות. שיטה זו שימושית במיוחד עבור כשרוצה לבדוק אם מניפולציה גנטית נתונה או טיפול תרופתי מגדילה את מספר תאי חליפה באוכלוסייה. במקום לפטור את אוכלוסיית התאים המבטאים את המטלותminant, החל VSG באמצעות תרופות או באמצעות אימונולוגית, תאים אלה בוטלו על ידי ציפוי אותם קודם עם חרוזים מגנטיים מצמידים את הנוגדן כנגד VSG הדומיננטי ואז לבודד אותם על עמודה מגנטית. אוכלוסיית החליף אז נאספה את זרימת הדרך ומוכתמת שוב עם נוגדן אנטי VSG שכותרתו fluorophore לזהות מזהמים. כימות מושגת על ידי הוספת מספר מוגדר של חרוזי ספירה מוחלטים לטעום כל כך שהיחס של חרוזי תאים ניתן לקבוע והשתמש לכמת את מספר הבוררים באוכלוסייה 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: לאורך כל ההליך, יש צורך לשמור על תאים על קרח. תקשורת קרה אמורה לשמש גם לאורך כל דרך.

קציר לדוגמא 1.

  1. לגדול trypanosomes הדם זן ליסטר 427 צפיפות של 0.5 - 1 מיליון / מ"ל. עדיף להתחיל תרבויות עם מספר קטן של טפילים. ספין למטה 50 x 10 6 תאים / המדגם עבור 10 דקות ב 1500 x ז. הקפד להשאיר 1 x 10 6 תאים בתרבית לשימוש מאוחר יותר להשתמש שולטת נוגדנים חיוביים ושליליים.
    הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש גם על trypanosomes המבודד דם בעלי חיים (ראה דיון לפרטים נוספים).
  2. פיפטה או לשפוך את רוב supernatant (להשאיר כ -750 μl). מעבירים את התאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
  3. ספין תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ב microcentrifuge ולהסיר supernatant.

2. תיוג מגנטי

  1. Resuspend התאים 150 בינוני תרבות μl (wi HMI-9סרום ה למשל) + נוגדן אנטי VSG העיקרי בבית הדילול המתאים.
    הערה: הנוגדן אנטי VSG נעשה בבית והשתמש בכל דילול של 1:50. חשוב להשתמש נוגדן אנטי VSG ראשית שאינה שכותרתו עם fluorophore.
  2. תאים וורטקס בעזרת מערבולת מתאם-60 במהירות 6 - 8 בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשטוף עם 800 - 1,000 μl קר HMI-9 עם סרום.
  3. ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ו לשאוב supernatant. לשטוף עם 1 מ"ל HMI-9 עם סרום ספין כנ"ל. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 100 μl של HMI-9 עם סרום.
  4. להוסיף 110 μl של תא מגנט מיון מופעל microbeads (MSC). השתמש ועכבר אנטי, ארנבת אנטי, או חרוזים אנטי ביוטין בהתאם נוגדן אנטי VSG העיקרי. לערבב היטב. תאים וורטקס בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. בעוד תאי vortexing, להגדיר עמודה / מדגם הפרדה מגנטי מופעל אחד על מגנט הפרדה. הקפד קיימת מחדשceptacle (אנו משתמשים צינור צנטריפוגות 15 מ"ל) תחת העמודה לאסוף את הזרימה דרך. הגדרת מנגנון בחדר קר.
  6. הוסף 2 מ"ל של HMI-9 עם סרום לעמודה הממשלה. לאחר תחול מקום צינור צנטריפוגות 15 מ"ל תחת העמודה לאסוף זרימה דרך מכל מדגם.
  7. לאחר דגירה 10 דקות בשלב 2.4, להוסיף 800-1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant להסיר נוגדן מאוגד. לשטוף עם 1 מ"ל של HMI-9 עם להשאיר בסרום וחזור 100 μl של supernatant.
  8. פליק צינור צנטריפוגות במרץ חזותי לבדוק את הצינור כדי לוודא כי היא הגלולה resuspended לחלוטין. הוסף 1 מ"ל של HMI-9 עם סרום ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לוודא שתאי הם resuspended היטב.

3. הפרדה מגנטית

  1. ודא שהעמודים דרוך כמתואר לעיל. החל תאים לעמודה. אסוף זרימה דרך עם תאים המבטאים את VS הלא הדומיננטיג 1 מ"ל של מדיום + trypanosomes בדרך כלל לוקח 6 - 7 דקות לזרום דרך העמודה.
  2. 2x לשטוף עם 1 מ"ל של HMI-9 עם סרום ולאסוף זרימה דרך באותו צינור כמו בשלב 3.1.
  3. זרימה דרך Divide (3 מ"ל) לשני צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    הערה: אלה ניתן לשלב מאוחר יותר או חצי יכול לשמש כדי לבודד RNA, וכו '
  4. הסר עמודה מגנט. הוסף 3 מ"ל של HMI-9 עם סרום לעמודה לצלול טור לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל להשיג תאים המבטאים את ההתחלה, דומיננטי VSG. הסר 300 μl של חומר eluted לצורך ניתוח מאוחר יותר. שמור את התאים הללו על קרח.
  5. לשימוש בתור חיובי כביקורת שלילית, לקחת כ 1 מיליון תאי מתרבות המוצא של תאים מלאים גדלו ב 37 ° C (מדינות שאינן צפויות לעבור תדיר) ו פיפטה אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
    הערה: תאי בקרה חיוביים יהיו מוכתמים עם נוגדן fluorophore שכותרתו בשלב 4.1. הרמ"א תאי הבקרה השליליב רבב בכל שאר הפרוטוקול.
  6. זרימה דרך ספין דגימות מדגם מלא נוגדנים חיוביים על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant.
    הערה: עוד 300 μl aliquot של תאים eluted ניתן להשתמש כביקורת חיובית מכתים אנטי VSG.

מכתים 4. לזהות מזהמים בוררים

  1. זרימה דרך גלולת דגימות ותא בקרה חיובית ב 100 μl של HMI-9 עם סרום + עיקרי, שכותרתו fluorophore, נוגדן אנטי VSG על הדילול המתאים.
    הערה: הנוגדן אנטי VSG שכותרתו נעשה בבית והשתמש בדילול של 1: 1,000. Fluorophore שכותרתו, אנטי VSG יכול להיות מאותו מקור כמו הנוגדן ללא תווית בהפרדת MACS step.There צריך להיות 3 מ"ל של מדגם זרימה דרך בשני צינורות microcentrifuge לאחר שלב 3.5.
  2. כדי לנתח את כל הזרימה דרך על ידי זרימת cytometry, לשלב את הכדורים בשני צינורות microcentrifuge בעוד מחדש susממתינים דגימות 100 μl של HMI-9 עם נוגדן בסרום + אנטי VSG. לערבב היטב.
  3. תאים וורטקס בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להוסיף 800 - 1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. ספין דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant להסיר נוגדן מאוגד.
  4. שטפו תאים עם 1 מ"ל של HMI-9 עם סרום. ספין דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant. במהלך הספין האחרון, לסובב את דגימות eluted משלב 3.4 ואת מדגם ביקורת השלילי.
  5. Resuspend כל דגימות הזרימה דרך eluted ב: 148.5 μl HMI-9 עם סרום, 25 μl חרוזים ספירה מוחלטת 1.5 μl יודיד Propidium מכתימים פתרון (175 סך μl). Resuspend דגימות בקרת נוגדנים חיוביות ושליליות 175 μl HMI-9 עם סרום. הקפד לרשום את מספר חרוזי ספירה מוחלטים / 25 μl עבור במגרש המסוים בשימוש.
  6. הפעל את כל הדגימות באמצעות cytometer זרימה ולאסוף נתונים. תאים מתים כתם כמו PI - VSG +. בוררים להכתים כמו PI - VSG - 8.
  7. חישוב מיתוג תדרים באמצעות זרימת cytometry נתונים.
    הערה: לקבלת הוראות כיצד לחשב תדרים מיתוג, עיין בקובץ משלים Flow Cytometry Calculations.docx ולוח 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה המתוארת כאן שמשה על מנת להוכיח כי הפסקות פעמי גדיל בתוך אתר ביטוי VSG הגדיל את מספר בוררים באוכלוסייה 8. כאן, אנו מציגים תוצאות נציגים מתוך אוכלוסייה של trypanosomes זה היה יכול להיגרם באופן דומה כדי ליצור הפסקה פעמי גדיל באתר הביטוי. אנו משווים trypanosomes אלה לאלה שלא היה מושרה ליצור הפסקה פעמי גדיל. איור 1 מציג את זרימת נציג cytometry מגרש מתאי un-induced המושרים שנאספו הזרימה דרך מעמודת מיון התא המגנטית מופעל. לצורך ניסוי מסוים זה VSG החל הדומיננטי היה VSG2. הפנלים השמאליים של האיור 1A להראות קדימה פיזור בצד, המאפשר שערים להיגרר סביב חרוזי ספירה המוחלטים ותאי ההראה חתימה קדימה וצד פיזור אופייני של תאי חיים. שים לב ששערים יכוליםלהיגרר לכלול יותר תאי כי ניתן למנוע תאים מתים עם מכתים PI; עם זאת, השער חייב להישמר זהה עבור כל הדגימות. הפאנלים הימני של איור 1A להראות רק את התאים שנמצאים בתוך השער 'בשידור חי' על לוחות השמאלי. תאים להכתים חיובי עבור PI (Q1 ו Q2) הם תאים מתים. תאים להכתים חיובי עבור VSG הדומיננטי שלילית עבור PI ב Q3 הם מזהמים. תאים להכתים לכף חובה על שניהם PI ואת VSG דומיננטי Q4 הם תאים חיים כי עברו. אפשר לצפות כי אחוז מזהמי Q3 נמוך עבור תאים שבם הפסקה פעמי גדיל כבר מושרה. עם זאת, את האחוזים Q3 לא ניתן להשתמש בהם כדי להסיק אם יש יותר בוררים באוכלוסיה נתונה. זה רק על ידי השוואת היחס בין מספר התאים Q4 למספר חרוזים שנאספו שאפשר לחשב תדרים מיתוג. טבלה 1 מציגה את מספרי המתקבל פלומגרשים w cytometry והשיטה לחישוב בוררים אחוזים באוכלוסיות אלה. חישובים אלה בוצעו על 3 דגימות ביולוגיות כדי להשיג את תדרי מיתוג נצפו מוצגים באיור 1 ב. רמת המיתוג סטוכסטיים במבחנה היא נמוכה למדי, כפי שחושב כאן בקצב ממוצע של 9.53 x 10 -5, תוך גרימת תוצאות הפסקת 1 - 6 x 10 -3 תאי עברת VSG הלא הדומיננטי.

איור 1
בידוד באיור 1. כימות של אוכלוסיות Trypanosome Switched. (א) cytometry זרימה מראה שברים של trypanosomes בשבריר הזרימה דרך בעקבות בחירתה של בוררים שאינם על טור מיון תא מגנטי מופעל. אוכלוסייה של תאים עם הפסקת פעמי גדיל מושרה I-SCEI מושווית אוכלוסייה של תאים ללא BRE מושרהak. (ב) מחושב מיתוג תדרי תאים שיש להם או שלא היה מושרה עם הפסקת פעמים התקועה I-SCEI. מספר על המגרש מייצג את התוצאות של מבחן T שני זנב, מזווג. ברי שגיאה מייצגים SD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קובץ משלימה 1. חישובים cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

שולחן 1
טבלה 1. חישוב של שכיחויות מיתוג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עם כל כבוד טכניקה ניסויית, המרכיב הקריטי ביותר של פרוטוקול השמירה על כל הדגימות קרות. Trypanosomes במהירות מאוד להפנים נוגדן מאוגד השטח שלהם 9, אך תהליך זה הוא תנועתיות תלויה, ואינו להשפיע על assay כל עוד התאים נשמרים על 4 מעלות צלזיוס. כל הדגימות תמיד צריך להיות כל הזמן על הקרח, ואת pipetting צריך להיעשות במהירות כדי לצמצם את החשיפה לסביבה מעבדה C 25 °. קרת HMI-9 עם סרום צריך להיות זמין בתחילת הניסוי צריך להישמר על קרח לאורך כל דרך. בידוד של trypanosomes ידי הפעלת אותם על עמודה חייב להיעשות בחדר קר, כפי שהוא לוקח 5 - 7 דקות לרוץ מדגם 1 מ"ל דרך העמודה. אם יש יותר דגימות מ יחידות הפרדה מגנטית זמינות, בידוד מגנטי ניתן לעשות ברצף, כל עוד דוגמאות לא הפרידו באופן פעיל כל זמן על קרח.

זה גם קריטי כי דגימות להיות גם מאוד af מעורבתter לשטוף האחרון הבא דגירה עם microbeads ולפני בידוד על המגנט. ניתן להשיג זאת על ידי מצליף אגרסיבי של הצינור צנטריפוגות או vortexing אור. אין גלולה או גושים של תאים צריכה להיות גלויה לפני תוספת של המדגם לעמודת ההפרדה, אשר ניתן לבדוק על ידי ההסתכלות על רמת מיקרוסקופ האור. אם גושים נוכחים, רמת זיהום במדגם זרימת דרך של תאים המבטאת את VSG הדומיננטי היא בדרך כלל גבוהה בהרבה רצוי. בעת ביצוע החישוב של מספר בוררים במדגם בסוף הפרוטוקול, חשוב לקחת בחשבון אם כל הזרימה דרך שמש ניתוח התזרים cytometric, או אם חצי שמש. אם רק חצי שמש, המספר הכולל של בוררים חושב יוכפל 2.

בעת הסרת supernatant במהלך השלבים לשטוף, זה לא הכרחי כדי פיפטה את כל טיפה, ובדרך כלל 15 - 25 μl הםעזוב סביב הגלולה של תאים. זהו עניין חיוני במיוחד בשלבים הסופיים של מכתים ושטיפה, כי בשלב זה כדורים נראים לעיתים נדירים בדגימות הזרימה דרך בגלל שיש כל כך מעט עברת תאים.

בעוד הכתם אנטי VSG הסופי מבוצע בדרך כלל עם נוגדן מטוהר, fluorophore שכותרתו אנטי VSG, הכתם אנטי VSG הראשון לפני הבידוד מגנטי ניתן לעשות עם נוגדן או בסרום מטוהר. גם השתמשנו supernatant bioreactor נגזר hybridomas להביע נוגדנים נגד VSG. בכל מקרה, החומר המשמש את הכתם הראשוני חייב להיות טיטרציה כדי להבטיח הפרדה טובה של תאים לעשות או אינו מבטאים את VSG הדומיננטי, החל.

זה אופייני עבור האוכלוסייה התאימה את הזרימה דרך להיות מזוהם עם תאים המבטאים את VSG הדומיננטי. בעוד זיהום זה אמור להיות מזערי, מניסיוננו זה נדיר עבור האוכלוסייה להיות נטול לחלוטין של תאים להביעing את VSG הדומיננטי. כמו כן, חשוב לציין כי תאים שעברו הליך הבידוד לא ללכלך כמו במאור פנים עם נוגדן אנטי VSG לאלה שלא עברו את ההליך. אנו משערים כי שני דברים יכולים להסביר את ההבדל הזה. הראשונה היא כי ספינינג trypanosomes מוביל שפיכת VSG, ויש ספינים רבים המעורבים בהליך הבידוד. זה יהיה צפוי להקטין את עוצמת האות הכתם אנטי VSG הסופי. השני הוא כי הצעד הראשון של הפרוטוקול כרוך מכתים עם נוגדן אנטי VSG עיקרי. אם אפיטופים מוכרים על ידי הנוגדן משמש בשלב ראשון זה זהים או לחסום את אפיטופים מוכר על ידי הנוגדן את הכתם האחרון, ניתן היה לצפות את עוצמת האות להיות נמוכה יותר מאשר אם רק אחד נוגדן שמש. מסיבה זו חשוב לכייל הנוגדן המשמש בשלב הסופי, כך האות מתא מוכתם חיובי היא כשתיסדר הגודל גבוה יותר עבור תא מוכתם שלילי. בדרך זו, גם אם עוצמת האות מתא מכתים חיובי הוא ירד בתאים שעברו הליך הבידוד, התאים החיוביים הללו עדיין יופרדו גם מהתאים השליליים על עלילת cytometry הזרימה. אם נמצא בשימוש-פיצוי אוטומטי, דגימות בקרת כתם יחיד צריכים להיות מוכנות. נוגדנים כי יצרנו זמינים לרכישה ממתקן נוגדן monocolonal במרכז לחקר הסרטן סלואן הזיכרון. היו לנו את ההצלחה הטובה ביותר עם באמצעות נוגדן IgG חד שבטי ללא תווית. ביצענו פרוטוקול עם נוגדנים VSG polyclonal, אבל נוגדנים polyclonal יכול מדי פעם להכיר VSGs אחרים כך נוגדנים חד שבטיים עדיפים. זהות VSG יכולה להיקבע על ידי cDNA VSG רצף המופק ההגברה של רצפי שימור של VSG 3'UTR ומנהיג השחבור. נוגדן מסוים יכול להיבדק על סגוליות על בעבר, שבודד החליפהתאים מי זהות VSG נקבעו כפי שתוארו לעיל.

הפרוטוקול המובא כאן יש מספר יתרונות. זה יכול לשמש גם כדי לבודד בוררים לניתוח מאוחר יותר לכמת את מספר הבוררים באוכלוסיית נתונה. זה גם יכול לשמש כדי לבודד וריאנט מסוים של עניין, כל עוד נוגדן זמין עבור גרסה כי. כמו כן ניתן לבצע פרוטוקול זה באמצעות trypanosomes מבודד מבעלי חיים, ובלבד כדוריות דם אדומות בוטלו באמצעות אנטי Ter119 מצופה-מגנטי חרוזים על פי הפרוטוקול של היצרן. אנחנו עדיין לא נבחנו לגבול התחתון למספר trypanosomes הנדרש, אבל יש לנו בהצלחה בצענו את הפרוטוקול באמצעות 2.5 - 10 מיליון trypanosomes מ 250 μl של דם. לבסוף, הפרוטוקול יכול לשמש בשילוב עם ניתוח תנודות להשיג את תדירות החלפה באוכלוסיית נתונה.

הליך הבידוד די fאס, לוקח 3 - 4 שעות מתחילתו ועד סופו בהתאם למספר של דגימות, ובכך הוא יותר יעיל מאשר השיטות הקודמות שדרשו חיסון מוקדם של עכברים או זנים מיוחדים המכילים סמנים עמידות לתרופות. השיטה היא מוגבלת על ידי העובדה כי נוגדנים כנגד VSG החל נדרשים, עם זאת. ללא חומרים כימיים כגון, שיטה חלופית כגון-seq VSG עשויה להיות בחירה מתאימה יותר כדי לאמוד אלו VSGs שמתבצע הביע באוכלוסייה נתונה 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ברצוננו להודות צלב ג'ורג 'עבור ייעוץ כללי על הביולוגיה trypanosome. עבודה זו נתמכה גם על ידי ביל ומלינדה גייטס GCE מענק DS, מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (dge-1,325,261) כדי MRM ו NIH / NIAID (מענק # AI085973) כדי FNP. אנו מודים גלדריאל בקתה-כורים לשימוש של הזן המכיל את אתר I-SCEI גן וההכרה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
unlabeled anti-VSG antibody n/a n/a VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody n/a n/a VSG antibody is made in house
HMI-9 media n/a n/a HMI-9 is made in house
Propidium Iodide BD Pharmingen 556463
CountBright absolute counting beads Thermofisher Scientific C36950
LD columns Miltenyi Biotech 130-042-901
MACS magnet Miltenyi Biotech 130-042-303
MACS magnetic separator Miltenyi Biotech 130-042-302
vortex adapter-60 ThermoFisher scientific AM10014
flow cytometer Coulter n/a
flow cytometer analysis software FloJo n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195, (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92, (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80, (1), 65-75 (1996).
  4. Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99, (Pt 1), 67-75 (1989).
  5. Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82, (1), 63-80 (1981).
  6. Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84, (2), 189-201 (1997).
  7. Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6, (7), e161 (2008).
  8. Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459, (7244), 278-281 (2009).
  9. Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131, (3), 505-515 (2007).
  10. Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347, (6229), 1470-1473 (2015).
איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulz, D., Mugnier, M. R., Boothroyd, C. E., Papavasiliou, F. N. Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54715, doi:10.3791/54715 (2016).More

Schulz, D., Mugnier, M. R., Boothroyd, C. E., Papavasiliou, F. N. Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54715, doi:10.3791/54715 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter