Abstract
In vitro trans biyoanalizlere Bununla birlikte onların benimsenmesi ve yaygın uygulama nedeniyle standart yöntem ve sağlam, kullanıcı dostu teknoloji kullanılabilirlik eksikliği kısmen engellemiştir edilmiştir, su kalitesi izleme araçları olarak söz göstermiştir. Bu çalışmada, piyasada mevcut, bölünme-tutuklandı hücre hatları kantitatif çevresel kalite uzmanları ilgilendiren su örneklerinde bulunan kimyasalların endokrin faaliyeti taranması için kullanılmıştır. Kapsamlı kalite güvence / kalite kontrol dahil tek, standart bir protokol (QA / QC) denetler hücre tabanlı Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) testi kullanılarak (sırasıyla, ER ve GR) Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör aktivitesi için geliştirilmiştir. Kaliforniya (ABD) tatlı su sistemlerinden tedavi belediye atık suyun ve yüzey suyunun numuneleri, katı faz ekstraksiyon kullanılarak çıkarılan ve standardize proto kullanarak endokrin aktivitesi için analiz edildiCol. Arka plan ve bitiş noktası özgü referans kimyasallar için doz-yanıt güvenilir ölçümü için gerekli gördüğü QA / QC kurallarına araya geldi. Yüzey su örnekleri için biyoassay tarama yanıtı büyük ölçüde saptanabilir değildi. Bunun aksine, ikincil arıtma tesisleri atık örnekleri ER 392 ng deksametazon GR / L ve 17 ng 17β-estradiyol / L'ye kadar, tahmini biyo-analizi eşdeğer konsantrasyonlarda (BEQs) ile en yüksek ölçülebilir aktiviteye sahiptir. bir tersiyer atık su örneği için biyolojik yanıtın, tedaviden sonra endokrin aktif kimyasalların daha düşük bir bakiye gösteren ikincil atık için ölçülen daha düşüktü. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilir kullanan nitro trans biyo-deneylerde, bölme durdurulmuş hücreli "setleri", su içinde endokrin aktivitesi için taranması için adapte edilebileceğini göstermiştir.
Introduction
Mevcut su kalitesi izleme doğru ve kesin yaban hayatı ve insanlar maruz kalma bir vekil olarak kimyasal kirleticilerin oluşumunu ölçmek için yeteneği esas alınmaktadır. Ancak, bu kimyasal-by-kimyasal izleme ve değerlendirme paradigma Karşı karşıya olduğumuz sürekli değişen kimyasal evren ayak uydurmak mümkün değil. Biz kader ve sentetik ve doğal kimyasalların etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek, biz biyolojik etkileri beklenen hitap eden ölçüm araçları aramaya devam, ve aynı zamanda bu kimyasal üretim, kullanım ve çevre girdi değişikliklere karşı bağışık bulunmaktadır. Bu tür araçlar bilinmeyen ya da yeni kimyasallar ve dönüşüm ürünleri, dikkatimizi hak edip anlamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, suda mevcut kimyasallar kompleks karışımlar zayıf tek tek kimyasal izleme ile ele alınmaktadır. Böylece, daha iyi adrese yüzey suları tha bu sorunları mevcut izleme araç kutusunu modernizasyonu sorunuyla karşı karşıyat tedavi atiksuyun ve kentsel / yağmursuyu ikinci tur atılmasını alırsınız.
Son yıllarda, biyoanalitik teknikler su kalitesi değerlendirmesi için tarama araçları olarak söz göstermiştir. Bilinen yoluyla hareket eden kimyasallara tepki özellikle, in'vitro biyoanalizlere olarak, eylemin 1,2 spesifik modları çevresel izleme topluma 3 büyük ilgi görmektedir. Sayısız araştırmalar içme, yüzey ve Atıksuların 4 -6 endokrin aktivitesini ölçmek için in vitro biyoanalizlere istihdam var. Ayrıca, biyo-deneylerde bir dizi molekül başlatma olaylar (örneğin, reseptör aktivasyonu), potansiyel olarak istenmeyen sonuç yolu ile zararlı etkileri ile bağlantılı olabilir 7,8 analiz hedef alır.
Su kalitesi değerlendirmesi için bioscreening evrimi açısından değerlendirilmiştir edilerek in vitro biyoassay uç noktaları farklı yüzlerce nispeten hızlı olmuştur onlarınyarar 9,10. Şu anda, Biyoanalizlerin sadece bir avuç su kaliteleri 5,6 arasında ayrım yeteneği gösterirken (laboratuarlar içinde) iyi ölçüm hassasiyeti elde gösterilmiştir. Özellikle muamele edilmiş atık suyun, östrojenler ve glukokortikoid steroid oluşumu başarılı olmuştur nitro trans aktivasyon 11,12 kullanarak oluşturmaktadır. kimin hücre hatları tescilli (ve dolayısıyla yaygın olarak kullanılabilir değil) Ancak bugüne kadar birçok çalışma istihdam var biyoassayler, sürekli bakım ve manipülasyon, ya da her ikisi gerektirir. Sonuç olarak, yetenek topluluk engellenmiş kalır su kaynaklarına bu tarama teknolojisini transfer etmek sonuçta, protokolleri standardize laboratuvarlar arası kalibrasyon egzersizleri, ve.
ABD ToxCast programı ile incelenen in vitro biyo-deneyler arasında en az bir teslimatçı "dondurma ve çözme, kullanımı kolay 13 ticari olarak temin edilebilir4; biçimleri. Bu takım durdurulmuş hücreli "setleri" tedavi 14 farklı seviyelerde ifade eden sudan ekstre kimyasal aktivitesinin ölçülmesi sağlam olması gösterilmiştir. satıcı protokolleri bireysel kimyasalların veya karışımların biyo ekrana mevcut olmasına rağmen onlar su numunelerinin uygulanabilir önce, bazıları değişiklik gerektirir. Arıtılmış atıksu çıkış 15, yağmursuyu akış 16, alıcı sular 17,18 ve daha yakın dönüştürülmüş su 19,20 su kalitesi, topluluğun ilgileneceği olan sulu ortam asal örnekleridir.
Bu çalışma, ticari olarak mevcut kullanarak su örneklerinde endokrin aktivitesini ölçmek için tek bir standart protokol sunar, bölünme-tutuklandı in vitro trans biyo-deneylerde. Biz tw için tepki arka doz cevap verebilen ve tekrarlanabilirlik kapsamlı bir değerlendirme ile protokol sağlamlığını gösterdiÖzellikle faiz Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör transaktivasyonunun (ER ve GR, sırasıyla) o bitiş noktaları. protokol Kaliforniya'da tatlı su sistemlerinden tedavi atiksuyun ve yüzey suyunun ekran örneklerine uygulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Toplama ve Proses Suyu Numune (Escher ve ark Modifiye. 9)
- Çevrede su numunesi ile en 1 g sodyum azid ve 50 mg askorbik asit ihtiva eden bir temizleme 1 L amber cam şişe doldurun. 72 saat sonra 4 ° C saklayınız numune ve proses.
NOT: Sodyum azit çok zehirlidir ve dikkatle ele alınması gerekir. koruyucu giysiler (göz / yüz, eldiven, giysi) kullanın ve düzgün işleyen bir duman başlığı içinde tartın. tartmak için metal bir spatula kullanmayın. - 1.6 uM cam elyaf filtre ile ve daha sonra 5-10 ml / dakika bir akış hızında, bir ön şartlandırılmış Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) kartuşundan örnek geçirin. akış hızını kontrol etmek için vakum pompasının basıncı ayarlayın.
- Vakum, 15 dakika boyunca kartuş kurutun.
- 10 ml aseton içindeki ardından 10 ml metanol, kartuşu Zehir: heksan (1: 1, hac / hac).
- Yüksek saflıkta, hafif bir azot akımı altında yaklaşık 1 ml'ye elüat konsantre edilir. çözücüdimetilsülfoksid (DMSO) 500 ul ekleyerek ve aşağı 500 ul özü buharlaştırılması ile değişimi.
- Bir amber cam bir numune alıcı viale aktarın özü. -20 ° C'de saklayın.
2. Deney Özgü Referans Kimya ve Su Özü dilüsyonları hazırlayın
- Kalibrasyon eğrisi için 9 dilüsyonları hazırlayın.
- % 100 DMSO içinde deney özel bir referans kimyasal bir stok çözeltisi yapın. nihai konsantrasyon ER analizi için 2 uM 17β-estradiol ve GR analizi için 100 uM deksametazon olmalıdır. -20 ° C'de stok solüsyonları saklayın.
- steril bir tüp içinde deney ortamı 285 ul uygun referans kimyasal stokunun 15 ul ekleyin (tüp # 1). Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından örnek karıştırın.
- 8 ek borular (borular # 2-9) 'de deney ortamı içinde,% 5 DMSO içeren bir çözeltiye 200 ul ekle.
- küvet ile tüp # 2 tüp # 1 100 ul tablet aktarınE # 9, 3 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirmek için. Her bir seyreltilmiş örnek bir tümbölen alınarak ve aşağıdaki borunun eklemeden önce bir pipet ile iyice karıştırılması gerekir.
- deney ortamı 190 ul DMSO içerisinde 10 ul karıştırılmasıyla bir çözücü kontrol örneği hazırlayın.
- Her su ekstraktı için dört dilüsyonları hazırlayın.
- birinci tüp içinde, deney ortamı 95 uL su özütü 5 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer üç tüplerde deney ortamı içinde,% 5 DMSO, 50 ul ekle.
- sonraki bir tüpten çözeltisi 50 ul transfer ile 2 kat seyreltme gerçekleştirin.
3. FRET Biyoassay Davranış Hücre Süspansiyon Hazırlamak
- üreticinin talimatlarına göre analiz, belirli bir ortam hazırlar. Deney ortamı, 4 ° C'de saklanır ve kullanılmadan önce bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar ısıtılmalıdır.
- kriyojenik serbest üzerinden ER veya GR bölünme-tutuklanan hücrelerin bir şişe alınzer yumuşak çalkalama ile 2 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içinde flakon yerleştirerek hücrelerin hızlı bir şekilde eritin. % 70 etanol ile şişeyi arındırmak ve Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yerleştirin.
- aseptik teknikler kullanılarak şişe açılır ve deney ortamında 10 ml hücre transfer edin.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
- steril bir cam pipet kullanılarak süpernatan aspire ve deney ortamında 6 ml hücre pelletini.
- Bir canlı bir boya çözeltisi 5 ul hücre süspansiyonu 5 ul karıştırın ve bir sayma bölmesine bir kısım ilave edin.
- ışık mikroskobu ya da otomatik hücre sayacı kullanılarak canlı hücre sayısını ve hücre süspansiyonu, canlı hücrelerin yoğunluğunu tahmin ediyoruz. Deney ortamı, ml başına 550.000 canlı hücreler bir son yoğunluk elde etmek gerektiğinde seyreltilir.
4. Plaka 96-kuyu Siyah Duvar Clear-alt Plate Hücreler ve seyreltilmiş Su Extract ekle
- bir tabak oluşturunHer su ekstraktı için 9-nokta denemesi özel kalibrasyon eğrisi, QA / QC örnekleri ve çoklu dilüsyonları içeren düzen. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örnek, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
- tekrarlanan hücresiz kontrol oyuklarına deney ortamı 90 ul ekle.
- steril pipet haznesindeki hücre süspansiyonu dökün ve çok kanallı pipet kullanılarak kuyu hücre süspansiyonu 90 ul ekle.
- Uygun oyuklara kademe 2 sırasında hazırlanan seyreltilmiş numunelerin 10 ul ekle. oyuk başına nihai DMSO konsantrasyonu% 0.5 düzeyinde olmalıdır.
- Bir kapak plakası kapatılır ve 16 saat 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatöründe yerleştirin.
Şekil 1: a. 96 oyuklu plaka taslağına Örnek çok-yuvalı plaka bir deney, belirli bir kalibrasyon eğrisi, 3 tip içerecek şekilde tasarlanmıştırQA / QC kontrolleri ve su ekstraktı başına 4 dilüsyonları (medya sadece DMSO içinde temiz bir ortamda hücreler ve hücreler orta çivili). Her kontrol ve su ekstresinin seyreltme üçlü kuyular analiz edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
5. Yükleme Çözüm hazırlayın ve her Şey ekle
- İnkübasyondan sonra, plaka, oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Bu FRET Biyolojik deney için, 5.6 ile 5.2, doğrudan ışık olmadan yapılmalıdır yineleyin.
- üreticinin talimatlarına göre bir 6x yükleme çözeltisi hazırlayın.
- her bir kuyunun 6x yükleme solüsyonu 20 ul ekleyin.
- seyreltilmiş, su Sitotoksisitenin değerlendirmek için her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi 10 ul ekle.
- alüminyum yapışkan film ile plaka mühür.
- 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin.
6. ölçün Sitotoksisite ve Endokrin Etkinlik Tepki
- Üreticinin talimatları izleyerek alt-okuma yetenekleri ile mikroplaka okuyucu ayarlayın.
- FRET transaktivasyon Biyoassay, mavi floresan (409/460 nm, uyarma (Ex) / emisyon (Em) dalga boyu) ve yeşil (409 Ex / 530 Em nm) kanalları ölçün.
- sitotoksisite deneyi için 560 Ex / 590 Em nm'de floresan ölçmek.
7. Veri Kalitesinin belirleme QA / QC Çekler değerlendirin
- ve hücreler sadece (temiz analiz ortamında hücreleri) kontrol hücre içermeyen (sadece medya) ortalama ham floresan karşılaştırın. Ortam sadece arka plan flüoresan hücrelerin sadece kontrol cevabına kıyasla en az% 25 daha düşük olması gerekir.
- Ham FRET veri işlemek. hem 'blue' ve 'yeşil' veri setleri için de içeren tüm hücreden hücre içermeyen kontrol çukurlarında ortalama floresan çıkarmak. hesaplamakHer deneysel kuyu için mavi / yeşil oranı.
- DMSO kontrolleri ile sadece hücreler-ve hücrelerin mavi / yeşil oranını karşılaştırın. bu denetimlerin floresan değerleri% 15 Bağıl Standart Sapma (RSD) içinde olmalıdır.
- bir günlük moleküler kütleye (M log) olarak ifade numune konsantrasyonuna karşı mavi / yeşil oranı olarak tahlil özel kalibrasyon eğrisi çizilir. Eğim, R 2 hesaplayın ve EC 50 (% 50 etki konsantrasyonu) oturum açın. Kalibrasyon parametreleri Tablo 1 'de listelenen beklenen aralıkta olmalıdır.
- tüm üçlü kuyular için RSD hesaplayın. çoğaltır arasında değişkenlik% 20 daha az olmalıdır.
- sitotoksisite verileri (560 EX / 590 Em nm), tüm hücre içeren kaynaklardan gelen hücre içermeyen kontrol ortalaması (örneğin, ortam geri plan) çıkarılır.
- Her numune için ortalama arka plan çıkarılır floresan hesaplayın. DMSO kontrolü bir yüzdesi olarak ortaya çıkan floresan verilerini çizilir. Numune seyreltileri olmamalıhücreleri yalnızca DMSO kontrollere göre% 20'den fazla, hücre ölüm sergiler.
8. Veri Analizleri
- Asgari kalibrasyon tepki artı yanıt ortalamanın iki standart sapma olarak Algılama (LOD) tahlil Sınırı hesaplayın.
- Bir doz tepkisini gösteren örnekler için AK 50 türetmek Referans kimyasal 10 ve% 50 etki konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisinin lineer regresyonunun eğim ile su ekstresi.
- / EC sayılı su numunesi 50 referans kimyasal BEQ = EC 50: formülü kullanarak Biyoanalitik Eşdeğer Konsantrasyon (BEQ) hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, tedavi belediye atiksuyun 4x 24 saat kompozit numuneler, Güney Kaliforniya'da tatlı su sistemlerinden yüzey sularının 6 kapmak örnekleri ve ultra saf su içeren bir alan boş bu protokolü göstermek için seçildi. 4 atık örneklerinin 3 konvansiyonel aktif çamur atıksu arıtma tesislerinde ( "ikincil atık"), ve kum / karbon filtrasyon eklendi sonrası biyolojik arıtma ( "üçüncül atık") ile gelişmiş atık su arıtma tesisi dördüncü birinden idi. Yüzey suyu numuneleri (açık, tarım ve kentsel) farklı arazi kullanımı temsil havzalarda toplanmıştır.
Su ekstrelerinin seyreltimi DMSO kontrol (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında gözlenen% 20'den daha az, hücre mortalite ile belirgin bir sitotoksisite göstermiştir. Hücre içermeyen (medya sadece) arka plan düşüktü ve cSadece hücre-ve DMSO yanıtlarla hücreler arasında omparison çözücü fluoresans ölçümleri üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Eğim ve EC 50 günlük olmak üzere tahlil özel kalibrasyon eğrileri parametreleri, zamanla kalibrasyon eğrileri iyi tekrarlanabilirlik gösteren kabul edilebilir tarihi değerleri (Tablo 1) aralığında idi. ER deney için kabul edilebilir bir kalibrasyon eğrisinin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. 17β-estradiyol ve deksametazon noktası referans kimyasal tahlili yanıt diğer araştırmacılar tarafından arıtılan atık suyun ve tarihi kullanımda meydana gelme olasılığı gücüne göre gibi 20- 22. Üç numune arasındaki karşılık olarak değişkenlik en az% 20 RSD idi. Böylece, tüm veriler kabul edilebilir kalitede olduğu kabul edildi ve daha sonra atık su ve yüzey suyu numunelerinde ER ve (ng / L BEQ olarak ifade edilir) GR biyoaktivitelerini tahmin etmek için kullanılmıştır.
(Şekil 3). Ancak, yüzey su ekstreleri güçlü ER veya GR aktivite yoktu. 10 bir REF rağmen, floresan tepkiler veya LOD altında genellikle yakın idi. alan boşluğu için biyoassay yanıtlarının yokluğu LOD, yukarıda belirtilen algılamalar örnekleme ya da usul laboratuar eserler sonucu olmadığını doğruladı.
ER ve GR aktiviteleri E2 / L ng 17 BEQs en yüksek olan, 7 tespit ve 10 temsilci su örneklerinde sırasıyla (Tablo 2) 4 edildi ve 392 ikincil atık bulunan Dex / L ng. üçüncül atık numunesi GR aktivitesi biyoassay LOD altında oldu. Aynı şekilde, çoğu yüzeysel su numuneleri hiçbir GR LOD yukarıdaki faaliyet ve ikincil atık daha ER aktivite çok daha düşük düzeylerde sergiledi.
Şekil 2:. ER Deney doz-yanıt eğrisi için kalibrasyon eğrisi örnek, ortalama floresans oranı (± SEM) olarak çizilmiştir, sigmoidal EC 10 ve EC50 değerlerinin belirlenmesi için kullanılmaktadır. Eğrinin bu bölümü lineer regresyon kullanılarak monte ve bir biyoassay eşdeğer konsantrasyonu türetmek için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
les / ftp_upload / 54725 / 54725fig3.jpg "/>
Şekil 3:. TheRrelative Zenginleştirme Faktörü Biyoassay Eşdeğer konsantrasyonlarına karşı çizildiği Su Örneklerinin Ortalama Mavi / yeşil floresan Oranı (± SEM) (BEQ) olan seyreltme serisi sınırının üzerinde iki nokta arasında en az bir konsantrasyon bağımlı-tepki göstermek numuneler için hesaplanır algılama (LOD) evi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Östrojen reseptörü (ER) Deneyi | Glukokortikoid reseptörü (GR) Tahlili | |||
| Araştırma sonuçları | Kabul şartları | Araştırma sonuçları Kabul şartları | ||
| kalibrasyon parametreleri | ||||
| EC50 (M) log ortalama | -9,6 | -10,1 -9,1 Ile | -8.5 | -9.0 Ile -8.0 |
| eğim ortalama | 1.1 | 0,9-1,5 | 2.0 | 1,8-2,4 |
| R2 | 0.99 | > 0.95 | 0.99 | > 0.95 |
| QA / QC kontrolleri | ||||
| Medya arka plan | Evet | medya sadece <hücre + medya | Evet | medya sadece <hücre + medya |
| Sitotoksisite (% mortalite) | 0% | <% 20 mortalite | 0% 5 | <% 20 mortalite |
| Örnek hassas (% RSD) </ Td> | 2-18% | <% 20 | 4-13% | <% 20 |
Tablo 1: Tedavi Atıksu Atıksularının Biyoanalitik Tarama ve Yüzeysel Su Örneklerden QA / QC Sonuçların Özeti.
| Numune Kimliği ve Açıklama | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - Tam ikincil arıtma tesisinden gelen son çıkış | 6.4 | 248 |
| B - Tam ikincil arıtma tesisinden gelen son çıkış | 13 | 392 |
| C - Tam ikincil arıtma tesisinden gelen son çıkış | 17 | 236 |
| D - üçüncül arıtma p nihai atıklant | 2.3 | <22 |
| E - tarım alanı yüzey suyu | <0.5 | 30 |
| F - tarım alanı yüzey suyu | <0.5 | <22 |
| G - kentsel bölgede yüzey suyu | 4 | <22 |
| H - kentsel bölgede yüzey suyu | 0.9 | <22 |
| I - açık alanda yüzey suyu | 0.8 | <22 |
| J - açık alanda yüzey suyu | <0.5 | <22 |
| K - alan boş (saf su) | <0.5 | <22 |
Tablo 2: östrojen reseptörü (ER-BEQ) ve glukokortikoid reseptörüne Biyo eşdeğer konsantrasyonları (GR-BEQ) ac. tivity Kaliforniya (ABD) toplanan örneklerin Üç çeşit analiz edilmektedir: belediye atık su atık (AD), yüzey suyu (EJ), ve alan boş (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu 17β-estradiol (E2), ng / L konsantrasyonlarda 23,24 de, bu maddeler için garanti tarama çevresel estrojenler iyi belgelenmiş gücü. Bu çalışmada, atık su Pis su ER tepkisi (BEQ aralığı: 2,3-17 ng E2 / L) E2 / L ng 4 0.5 <yüzey suyuna (için BEQs ise, Avustralyalı atıksu arıtma tesislerinin 20 ikincil atık bildirilen biraz daha yüksek oldu ) E2 ng 11 / L) 16 yerde yüzey ve yağmur suyu (<1 için rapor aralığında idi. yüzey suyu numunelerinde ölçülen ER aktivitesinin düşük seviyelerde olmasına rağmen, bu testte su kalitesinin değerlendirilmesi için uygun bir tarama bitiş noktası temsil eder. bisfenol A ve alkilfenol sürfaktanlar gibi östrojenler, genellikle su ortamında tespit edilir, ancak konvansiyonel analitik kimya kullanılarak ölçülmesi zor olabilir. Kojima ve ark gösterildiği gibi ER-hücresi tahlilleri de şu anda çalışan ve yeni kayıtlı pestisit taranmasında yararlı olabilir25.
GR aktivitesi Bu çalışmada (Tablo 2) analiz edilen tüm 4 atık numunelerinde büyüklük sırasına göre ER aktivite aştı. Bu eğilim atiksuyun 14 önceki çalışmalarla uyumludur ve GR-BEQs için aralık biraz daha yüksek ama aynı in vitro biyoassay 12 kullanan diğer ikincil atık için bildirilen karşılaştırılabilir burada rapor. Farklı bir hücre biyolojik tayini kullanılarak, Japonya'da atık su arıtma tesislerinden atık için GR-BEQs için aralık Bu çalışmada 22 ikincil atık için rapor daha düşük (<3-78 ng Dex / L) idi. Düşük aktivite bildirdi Hollandalı yüzey 21 sular için 30 ng Dex / L (Tablo 2, örnek E) maksimum GR tepki kayıtlı tek yüzey suyu numunesi hariç, kalan yüzey suyu numunelerinde GR aktivitesi tutarlı . Ancak, çevre imGR aktif kimyasallar için anlaşma daha az yüksek mertebeden efektleri bir meydan okuma potansiyeli değerlendirme yaparak, 26 aktif kimyasal ER daha karakterizedir.
geleneksel kimyasal analizi, yazılı protokoller ve performansa dayalı QA kullanarak ölçümlerin doğrulama bağlılık gibi / QC yaklaşım veri kalitesi ve sağlamlığı üst düzeye çıkarır. Su kalitesi değerlendirmesi için uyarlanmış hücre biyoanalizlere doğrulama ilk Mehinto ve ark., 14 özetlenen ve bu çalışmada uygulanan QA / QC parametrelerinin ölçümü sonuçlarımız önceden belirlenmiş kılavuz değerler de içinde olduğunu gösterdi, gelişmeye ve geliştirmeye devam edecektir rağmen (Tablo 1 ). Bu Biyoanalizlerin için kalibrasyon eğrisi parametreleri temel fark eden hücreler (örneğin, sitotoksisite) canlılığını değerlendirmek kriterlerin eklenmesi ile (örneğin, GC-MS), diğer analitik protokolleri kalibrasyonu için kullanılan, ayna. başka bir operasyonelyüksek bir verim formatında hücreleri kullanılarak mümkün farkı biyoaktivite (Şekil. 2) ölçüldüğü zaman beklenen konsantrasyona bağımlı tepki gösteren çok sayıda numune seyreltisi dahil edilmesi. Kontrol üç ikincil atık örneklere göre üçüncül atık (örnek D) örnek ölçümleri, alt ER ve GR yanıtları gözden (AC) Tablo bizim biyoassay tarama sonuçlarının göreli doğruluğu ek delil sağlar 2. Kuruluş veya ilgi matrisi temsil referans örnekleri, bu durumda su içinde, daha içinde ve özellikle ölçüm varlıkları arasında biyoassay sonuçları karşılaştırmak için yeteneğini geliştirmek istiyorum.
Bu çalışmada kullanılan ER ve GR transaktivasyon hücre çizgilerinin tepkileri, sırasıyla, mutlaka agonistleri E2 ve deksametazon aktivitesi göre ifade edildi. biyoaktivite kantitatif tahmini bir ifade için bu izin verirSA Biyoassay olarak denk bir konsantrasyonunu (BEQ). Bu da örneğin, geleneksel analitik kimya ile belirlenen bireysel agonistlerin konsantrasyonları ile BEQs doğrudan karşılaştırmak biyo-analizi yanıta katkıda kimyasal incelenmesi, sağlar. Bu kavram aynı zamanda etkileri yönettiği analizi olarak da bilinir etken, tanısal inceleme yönlendirilmesinde bioscreening ilave yardımcı altını çizmektedir.
SPE sulardan gelen ilaç ve diğer "yükselen kirletici" geniş bir izole etmek için kullanıldığı için, biz su hidrofilik hem de hidrofobik kimyasal yakalamak için tasarlanmış bir emici özellikli, önceden yayınlanmış bir protokol 9, 20 kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak, tüm biyolojik olarak aktif organik bileşiklerin kantitatif yakalama kabul da, ek bir iş tamamen standartlaştırmak ve özütleme yöntemleri performansını doğrulamak için gereklidir. Bu çalışmada kullanılan hücre tahlilinde türü ortaya çıkabilirBaşka bir sınırlama. Bu deneyler kirletici ve nükleer reseptörler arasındaki etkileşimi ölçmek ve bu tür kimyasal-zar reseptörü olarak hesap diğer olası etkileşimleri, içine almazlar. Bu nedenle, burada ölçülen bir tarama yanıtları hafife ki mümkündür. Örnek çıkarma gibi, hiçbir standart yöntemler hücre deneyi verilerini analiz etmek ve farklı yaklaşımlar, farklı sonuçlar doğurabilir vardır. Kalibrasyon eğrisinin alt yarısı için yanıt modeli, bu çalışmada kullanılan doğrusal regresyon model yanıtı, bu çalışmada yer alan nispeten dar bir aralık ötesine uzanır, özellikle, bütün hücre tahlilleri için uygun olmayabilir. Yukarıdaki konularda ek araştırma bu araçlar sağlam bir izleme aracı olarak uygulanabilir hangi ölçüde anlamak için gereklidir.
olan temel çok endokrin aktif kimyasallar için ekranlar gibi ER ve GR için atılmaktadır Oysa, araştırmacılar kapsamının genişletilmesi vardırbiyoanalitik araçları diğer ilgili örneğin eylemlerin modu, androjenikliği, genotoksisite, nörotoksisite ve İmmunotoksisite 9,27 içerecek şekilde. Daha kapsamlı bir araç çeşitli sucul ortamlarda 19, 28, şimdi ve gelecekte oluşabilecek bilinen ve / veya bilinmeyen kimyasalların dönüşüm ürünleri de dahil olmak üzere biyoaktif kimyasallar, taranması için yeteneğini artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
