Abstract
Upprätthålla växt sektion integritet är väsentlig för att studera detaljerade anatomiska strukturer på cellulär, vävnad, eller till och med organnivå. Men vissa växtceller har styva cellväggar, tuffa fibrer och kristaller (kalciumoxalat, kiseldioxid, etc.), och hög vattenhalt som ofta störa vävnadsintegritet under växtvävnadssnittning.
Denna studie etablerar en enkel hybrid-Cut vävnad sektione metod. Detta protokoll ändrar en paraffinbaserad snitt teknik och förbättrar integriteten hos vävnadssnitt från olika växter. Växtvävnader bäddades in i paraffin innan snittning i en kryostat vid -16 ° C. Sektionering i låg temperatur hårdnat paraffinblock, minskad riva och klia, samt förbättrad vävnadsintegritet avsevärt. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på kalciumoxalat rika Phalaenopsis orkidé vävnader samt motsträviga vävnader såsom reproduktiv organs och blad av ris, majs och vete. Dessutom kan den höga kvaliteten på vävnadssnitt från Hybrid-Cut användas i kombination med in situ hybridisering (ISH) för att tillhandahålla spatiala expressionsmönster av gener av intresse. Sammanfattningsvis är detta protokoll speciellt användbar för motsträviga växtvävnad som innehåller höga kristall eller kiseldioxid innehåll. Bra vävnadssnitt kvalitet möjliggör morfologiska och andra biologiska studier.
Introduction
Fotogenbaserade snittmetoden är en allmänt använd teknik för anatomiska studier. Bevarandet av intakt vävnad anatomi är viktigt för morfologiska och biologiska studier. Den paraffininbäddade snitt teknik är fördelaktig eftersom paraffin-inbäddning behåller cell- och vävnads morfologi. Dessutom kan paraffinblock lagras bekvämt under långa tidsperioder. Dock är paraffininbäddade sektionering inte lämpar sig för växtvävnader innehåller intracellulära kristaller. Kristaller i cellerna riva ofta paraffin band och vävnadsskada integritet under snittning.
Till skillnad från paraffin sektionering, är cryosectioning relativt snabbt och sektioner kan erhållas utan fixering, seriell uttorkning eller bädda medel infiltration 1. Kryosnitt är kompatibla med många applikationer såsom immunohistokemi, in situ hybridisering, och enzym histokemi. Den andra fördelen med cryosectioning äratt denna metod inte går igenom en potentiell denatureringsprocesser såsom hög temperatur och kemiska behandlingar, är så cellulära molekyler väl bevarade i vävnadssnitt 2. Cryosectioning allmänhet att föredra framför paraffinbaserad sektionering för studier i djurvävnader. Dock är cryosectioning inte förstahandsvalet i växter eftersom frystemperatur orsakar ibland bildning av iskristaller som påverkar kvaliteten i avsnitt integritet. Fastän osmoregulation såsom sackaroslösningar, polyetylenglykol (PEG), eller glycerol 3 har rapporterats att minska kristall isbildning enligt frysbetingelser, är förbättringen mindre än optimal.
Att anpassa sig till olika miljöer, olika växter har ofta olika vävnads textur och växtceller har utvecklats för att bilda styva cellväggar, tuffa fibrer och kristaller 4,5. Till exempel, olösliga kalciumoxalat kristaller och kiseldioxid organ är ganska vanligt iväxter 6. Silikat organ / kristaller har rapporterats för att upprätthålla växt arkitektur, UPPRÄTT STÄLLNING, och förebygga sjukdom eller skadedjur i spannmålsväxter 7-9.
De krukväxter orkidéer och cut-blomma orkidé marknaden blomstrar och det är en växande bransch. Phalaenopsis Afrodite (orkidé) är en av de viktigaste exportprydnadsväxter i Taiwan. Betydande ansträngningar har gjorts för att förstå de morfologiska och fysiologiska förändringar av blommande processerna i Phalaenopsis orkidéer. Blommor spikar av Phalaenopsis orkidéer initieras från armhålan knoppar på bladbasen. Efter en period av sval omgivningstemperatur (ca en och en halv månad), axillära knoppar förstoring, bryta dvala, och skjuter ut från bladbasen att utvecklas till unga blom spikar. För att förstå den fysiologiska, cellulära och molekylära processer spik initiering är det viktigt att utveckla en robust anatomisk teknik för att videoanläggningLize vävnader eller markörer i tid. Emellertid närvaron av allmänt förekommande kristaller i orkidé vävnader, speciellt i axillära knoppar, gör anatomiska arbetet svårt.
Här har vi försökt förbättra avsnitt integritet motsträviga växtvävnader som har hittills ansetts som tekniskt utmanande. Här visar vi en förbättrad protokoll som heter Hybrid-Cut. Det är en paraffinbaserad sektione metod som utförs med hjälp av en kryostat. Paraffininbäddning löser hög vattenhalt i växtvävnad. Sektionering i låg temperatur härdar paraffinblocket, minskar kristall riva problem och förbättrar vävnadsintegritet avsevärt. Detta protokoll avsevärt förbättrar vävnadsintegritet för motsträviga växtprover.
Protocol
1. Fixering och inbäddning
- reagensberedning
- 10x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- Lägg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, och 2,4 g KH 2 PO 4 i 800 ml dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) och justera pH till 7,4 med HCl. Lägg DDH 2 O till en total volym av 1 L, lägg sedan till 1000 l dietylpyrokarbonat (DEPC) och skaka kraftigt. Store PBS över natten vid rumstemperatur och autoklavera vid 121 ° C under 20 min följande dag.
- 1x PBS
- Späd stam 10x PBS vid 01:10 förhållandet i DDH 2 O för att erhålla en slutlig koncentration av 0,01 M Na 2 HPO 4, 0,002 M KH 2 PO 4, 0,003 M KCl och 0,13 M NaCl.
- Paraformaldehyd (PFA) fixativ
Varning: Paraformaldehyd är giftig. Förbered det under ett dragskåp. Använd handskar.- För att bereda 250 ml PFA fixativ, värme 100ml 1x PBS till 70-80 ° C och tillsätt 1750 pl NaOH. Tillsätt sedan 10 g paraformaldehyd och blanda väl tills det är upplöst. Placera lösningen på is och sedan justera pH till 7,2 med H 2 SO 4 (260 - 270 ul för 100 ml) efter kylning.
- Justera volymen till 250 ml med 1 x PBS, tillsätt 625 l glutaraldehyd till en slutlig koncentration av 0,25%. Lägg 250 ul Triton X-100 och 250 ^ il Tween 20 för att underlätta infiltration av fixativ.
OBS: PFA fixativ kan lagras vid 4 ° C under en månad utan att förlora sin fixeringsförmåga.
- Förbereda olika koncentrationer av etanol (30%, 50%, 70%, 85%, och 95%) med DEPC-behandlat vatten.
- 10x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- Växt provsamling
- axillära knoppar
- Använd mogna Phalaenopsis orkidé växter vid fyra-bladsstadiet. Försiktigt bort blad genom att riva blad efter Mittnerven hjälp av händerna.
- Använd en vass skalpell för att carefUlly bort armhålan knoppar från basen av den tredje eller fjärde löv på monopodial stammen.
- utsäde prov
- Harvest mogna orkidé frökapslar vid 4 månader efter pollinering. Skär frökapslar längsled med en skalpell. Skaka öppnings frökapsel försiktigt och lossa torra frön på filterpapper.
- Protocorm
- Sugga mogna orkidé frön på en 1 / 2x Murashige och Skoog-agarplatta, och växa i en vävnadsodlingsrummet i en 12 h ljusperiod och konstant temperatur av 25 ° C. Prov grön protocorm vid 7 veckor efter sådd.
- Protocorm liknande organ (PLBs)
- Växer orkidé PLBs på T2 regenere agarplattor såsom beskrivits tidigare 10 och placera under samma förhållanden tillväxt som i steg 1.2.3.1. Samla 10 PLBs på en höjd av 5 - 8 mm.
- leaf prov
- Samla in bladvävnad från en mogen Phalaenopsis orkidé växt såsom beskrivs i steg1.2.1.1.
- Använd en vass skalpell för att skära en liten bit av bladvävnad (7 mm längd x 5 mm bredd) från den andra nyligen utvecklade blad.
- rotprovet
- Med användning av samma anläggning som beskrivs i steget 1.2.1.1, dissekera en cm längd av rotspetsen vävnad med användning av en skarp skalpell.
- ung spik
- Använd en vass skalpell för att skära ung spik vävnad från spetsdelen av blomman stjälk 10 cm i längd.
- Blomknopp
- Excidera en liten blomknopp av 5 mm i diameter från orkidé blomstjälk. Skära en del av blomknopp vävnaden longitudinellt (3 mm i tjocklek).
- Bladvävnader och spikelet vävnader från spannmål
- Klipp 1 cm lång blad bladvävnad från de första nyutvecklade bladen från ris, vete och majsplantor.
- Samla 10 spikelets från växter (ris, vete och majs) en dag före antes.
- axillära knoppar
- Fixering
- Fixa växtprover omedelbart genom att överföra dem i en glasskintillationsflaska innehållande 15 ml iskall PFA fixativ.
- Applicera ett vakuum (~ 720 mm Hg) för växtprover i ett 4 ° C kallt rum. Hålla vakuumet i 15 - 20 min (bör små bubblor frigöras från proverna). Upprepa detta steg tills det mesta av vävnaderna sjunka efter frisättning av vakuum. Håll vakuum över natten och släppa vakuumet långsamt nästa dag.
- Uttorkning
OBS: Använd samma flaskan från fixeringen genom infiltrationsstegen. Häll eller använd en pipett för att rinna av lösningen i föregående steg och ersätt med 15 ml av ny lösning i flaskan. Beroende på strukturen av vävnader, behandla hårdare vävnader såsom orkidé armhålan knopp, frö, protocorm och PLB och spikelet av ris, vete och majs för en längre tid; behandla mjukare vävnader såsom orkidé blomknopp, ung spik, blad och rot och blad av ris, vete och majs för en kortare tid.- Dehydratisera prover i 15 ml etanol serien vid rumstemperatur enligt följande: 30% etanol under 30 min, 50% etanol under 30 min, 70% etanol under 1 timme, 85% etanol i 54 min för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader, 95% etanol under 54 min för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader, och 100% etanol två gånger för 54 min för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader.
OBS: Växt prover kan lagras i 70% etanol vid 4 ° C i flera månader.
- Dehydratisera prover i 15 ml etanol serien vid rumstemperatur enligt följande: 30% etanol under 30 min, 50% etanol under 30 min, 70% etanol under 1 timme, 85% etanol i 54 min för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader, 95% etanol under 54 min för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader, och 100% etanol två gånger för 54 min för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader.
- Infiltrera prover med 15 ml etanol och xylensubstitut blandningen under 54 min vardera för hårdare vävnader och 30 min för mjukare vävnader, vid rumstemperatur enligt följande: etanol / xylensubstitut (2: 1, v / v), etanol / xylensubstitut (1 : 1, v / v), etanol / xylensubstitut (1: 2, volym / volym), och ren xylensubstitut två gånger. Varning: Xylen är giftig. Gör detta steg i dragskåp. Infiltrera provet i flaskan med 15 ml xylen substitut och paraffinblandning i en ugn vid 60 ° C, över natten för hårdare vävnader, och i 60 min för mjukare vävnader enligt följande: xylensubstitut / paraffin (2: 1, volym / volym), xylensubstitut / paraffin (1: 1, volym / volym), och xylen substitut / paraffin (1: 2, volym / volym).
- Infiltrera provet med 15 ml ren paraffin två gånger om dagen och inkubera vid 60 ° C i en ugn.
- Upprepa steg 1.5.3 nästa dag.
- Slå på strömmen av vävnaden inbäddning centrum en timme i förväg för att smälta vaxet i paraffinbehållaren innan bädda vävnader i en paraffinblock.
- Värma upp formarna metall (storleken av basen 3,3 cm längd x 2 cm bredd) på uppvärmningen fack vid 62 ° C, och häll ca 13 ml smält vax i formbasen.
- Överför ett vävnadsprov från avsnitt 1.5.4 i formen med värmas pincett och rikta den till önskad position.
- Flytta formenpå de kalla plattan försiktigt och lämna tills vaxet stelnat.
2. Tissue Sektione
- Paraffinsektione metod
- Göra ett vax bas genom att placera ett inbäddning kassett på toppen av en form (samma storlek i avsnittet 1.6.2), fyll på med smält vax och ta bort formen efter vaxet stelnar.
OBS: inbäddning kassett kommer att bilda ett vax bas för att förankra provparaffinblocket. - Trimma paraffin blocket i en lämplig form och storlek, och placera några vax bitar på en plan spatel. Värm vaxet bitar med hjälp av en alkoholbrännare tills vaxet smälter och sedan placera smält vax på vaxet basen i avsnitt 2.1.1 för att fästa blocket. Kläm det i mikrotomen.
- Placera ett nytt blad på mikrotomen och justera vinkeln till 5 grader för att underlätta snitt i mikrotomen.
- Skära provet paraffinblocket i tunna skivor (10 | im), såsom beskrivits tidigare 11. </ Ol>
- Göra ett vax bas genom att placera ett inbäddning kassett på toppen av en form (samma storlek i avsnittet 1.6.2), fyll på med smält vax och ta bort formen efter vaxet stelnar.
- Hybrid-Cut snitt metod
- Trimma provet paraffinblocket från steg 1.6.4 till en kolonn med en trapets yta upptill till en lämplig storlek med ett rakblad.
- Lägg till lite Optimal Cutting Temperature förening (oktober) till mitten av kryostaten scenen. Fäst paraffinblocket till kryostat stadiet och sedan snabbt orientera vävnadsblock i önskad position.
- Överför paraffinblocket / stadium till en kryostat kammare. Låt oktober stelna på snabbfrysning bar vid -42 ° C under 10 min. Flytta inte blocket under stelningen av oktober (figur 2C).
- Låt kryostat adaptern och kammartemperatur för att kyla ner till -20 ° C och -16 ° C respektive innan monteringen paraffinblocket / stadium kryostaten adapter. Sektions vävnader till 10 | j, m i tjocklek.
- Plocka vävnadssnitt med pincett. Float avsnitten om 800 pl DEPC-behandlat vatten i en Poly - L - lysin coated slide och överföra bilderna på en varm platta vid 42 ° C.
- Tillåta sektionerna att platta på DEPC-behandlat vatten vid 42 ° C. Använd filterpapper för att dränera bort vattnet från kanten.
- Montera vävnad på bilden genom att placera bilden på en 42 ° C värmeplatta över natten.
3. Vävnadsfärgning
- Avparaffinering
- Samla bilderna från den varma plattan och placera dem i en färgningsställ. Lägg 150 ml xylen i en färgnings burk i dragskåp och sänk ned kuggstången i xylen under 5 min.
- rehydrering
- Förbered olika koncentrationer av etanollösningar (100%, 95%, 70%, 50%, och 30%) i DEPC-behandlat vatten och fylla 150 ml lösning i distinkta färgnings burkar, respektive.
- Rehydrera proverna genom en serie med minskande etanolkoncentration, varvid varje steg i 3 min vid rumstemperatur. Överför bilderna i färgning rack en burk till en annan burk innehållande different etanolkoncentrationer: 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol, och 30% etanol.
- Efter rehydrering, sänk proverna i DDH 2 O 3 min.
- hematoxylin-färgning
- Fläckvävnadsprover genom att sänka vävnads glider i hematoxylin lösning under 1,5 minuter.
- Skölj hastigt i DDH 2 O innehållande 1 - 2 droppar 12 N saltsyra (HCI) under några sekunder, och sedan tvätta kort i DDH 2 O.
- Uttorkning
- Dehydratisera proverna genom en serie av ökande etanolkoncentrationer under 3 min vid rumstemperatur: 30% etanol, 50% etanol, 70% etanol, 95% etanol, och 100% etanol. Rensa proverna med xylen i dragskåp i 5 minuter.
- Montering
- Släpp på lämpligt 600 il xylen-baserat monteringsmedium på objektglaset. Placera försiktigt ett täck över provet. Undvik luftbubblor bildar att få bilder av god kvalitet.
- Låt objektglasen lufttorka över natten. Observera provet under ett mikroskop nästa dag.
Obs: Bilder fångades på 25X till 400X förstoring beroende på storleken av prover.
4. In Situ Hybridisering
- probsyntes
- Klon Phalaenopsis aphrodite Actin genspecifika kodande sekvensen med hjälp av primrar 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'och 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (för att få 242 bp PCR-amplikon) och CyclinB1; en genspecifik kodande sekvens med hjälp av primrar 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 ' och 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(för att få 327 bp PCR-amplikon) som beskrivits 12.
- Ligera de specifika kodande sekvenserna in i vektorer (t.ex. pGEMT) enligt tillverkarens protokoll.
- Generera digoxigenin (DIG) märkt sense- och antisense-sonder med användning av SP6 / T7 DIG RNA märkningskit enligt tillverkarens instruktioners.
- In situ-hybridisering
- Klipp 2: a och 3: e armhålan bud vävnadssnitt (10 | im tjocklek) genereras med hjälp av Hybrid-Cut-metoden, och montera skivor på bestruket bild.
- Avparaffinera vävnadssnitt i xylen (se 3.1.1), rehydrera i minskande koncentrationer av etanol (se 3.2.2), och smälta med 2 mg / ml proteinas K vid 37 ° C under 30 min.
- Utför in situ hybridisering enligt protokollet som tidigare beskrivits 11,13 med vissa ändringar, det vill säga med hybridiseringstemperaturen för aktin som 59 ° C och 60 ° C för CyclinB1;. 1 Hybridisera glida med 40 ng DIG-märkt RNA-sond.
- Använd nitroblåtetrazolium / 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) lösning för att detektera hybridiseringssignaler som beskrivs 11.
Representative Results
Hybrid-Cut Förbättrar integritet av vävnadssnitt
Förstå anatomi reproduktions blommig struktur är viktig för att undersöka mekanismerna bakom blomma initiering i orkidéer. Men ansamling av intracellulära kalcium oxalatkristaller i Phalaenopsis orkidéer gör sådana studier en utmanande uppgift. För att kringgå de problem som är förknippade med sönderrivning som orsakas av kristaller under snittn (Figur 1), har vi utvecklat ett system som vi namngav Hybrid-Cut. Detta protokoll kombinerar traditionella paraffininbäddning och kryosektion tekniker. Vi testade första Hybrid-Cut i armhålan knoppar av Phalaenopsis orkidé eftersom de är ökända för vävnads styvhet och hög kristall innehåll. Axillär knopp vävnaden fixerades i 4% PFA (se protokollet, steg 1,3). Efter serie etanol uttorkning och paraffin infiltration ades den axillära knopp inbäddade i en paraffinblock. Blocket skars till lämplig storlek innan snittning (Figur 2A). En liten mängd av oktober applicerades sedan till centrum av kryostaten steget (Figur 2B). Paraffin blocket därefter anslutit sig till scenen via oktober Scenen inkuberades i en kryostat i 10 min för att medge fullständig stelning av oktober innan snitt (figur 2C) och därefter kryosektion utfördes i en -16 ° C kammare (figur 2D).
Som jämförelse framställdes en paraffinblock som innehåller en armhålan knopp Phalaenopsis orkidé föremål för regelbunden mikrotom sektionering. Såsom visas i figur 1 A, var svår sönderrivning av de paraffin band observerades efter mikrotom snittning. Vävnaden integritet och cellstruktur också äventyras (Figur 1B). Hybrid-Cut, å andra sidan,producerade intakta vävnadssnitt (figur 3a) med bevarad strukturell integritet (Figur 3B).
Tillämpning av hybrid-Klipp till olika vävnader av P. aphrodite
För att ytterligare testa mottaglighet av Hybrid-Cut, testade vi olika vävnader hos Phalaenopsis orkidéer. Det är ofta svårt att erhålla sektioner av frön med god vävnadsintegritet på grund av de härdade fröhöljen. Med hjälp av detta protokoll, har detaljerade strukturer frön bevaras efter sektionering (Figur 4A). Som visas i figur 4A, proteinkroppar, kan de gemensamma lagringsprodukter 14, tydligt kan identifieras. Hybrid-Cut arbetade också med framgång och visade detaljerade strukturer skjuta apikala meristem av en månad gammal protocorm (den grodda strukturen från ett frö) (Figur 4B) ochprotocorm liknande organ (PLBs figur 4C). De intracellulära kristaller observerades i delar av PLB. Phalaenopsis orkidéer har tjocka och saftiga blad och de utför CAM-fotosyntes (CAM) -typ fotosyntes 15. Den tvärgående delen av bladet bladet uppvisade stora mesofyllceller och kärlknippena innehåller xylem och floem (Figur 4D). Få stomatala öppningar observerades på abaxial bladytan under dagtid (Figur 4D). I själva verket, CAM växter utvecklats för att maximera kol vinst men samtidigt minimera vattenförlust genom att öppna sina stomates i natten under torra förhållanden 15,16. Roten apikala meristem av P. aphrodite visas i figur 4E. Rotspetsen cellerna tycktes innehålla ett stort antal kristaller, som var mycket väl bevarade efter sektionering (Figur 4E). Längdsnitt av unga blommor spikar tillgänglig information om arkitekturen av unga blom primordials (Figur 4F). Dessutom foderblad, kronblad, labellum och pollinia kan tydligt identifieras från längdsnitt av unga blomknoppar som har avslutat differentiering i denna 5 mm blomknopp (Figur 4G). Lägg märke till att kristaller ackumuleras i foderblad unga blomknoppar. Kort sagt, detta protokoll arbetar konsekvent för att upprätthålla vävnadsintegritet och producerar intakt morfologi möjliggör anatomiska och eventuella cellstudier.
Hybrid-Cut Bevarar vävnadsintegritet i spannmålsgrödor
Vi testade också Hybrid-Cut på spannmålsgrödor såsom ris, vete och majs som innehåller höga kiselhalt 17,18. Som visas i figur 5, var vävnaden integritet tvärsnitt av ris, vete och majs blad förbättrats avsevärt av Hybrid-Cut-metoden. Xylem, floem, mesofyllceller, stomates och bulliform celler som styr rullande av bladet bladet för att undvika vattenförlust tydligt identifierats från delar av ris blad. Kranz anatomi, mesofyllceller och kärlknippena av majs blad 19,20 tydligt identifierats. Det var spännande att hitta en hög täthet av stomates på både adaxial och abaxial sidor av majs blad (Figur 5). Förhållandet mellan adaxial och abaxial klyvöppningar av 0,7 i majs har tidigare 21 rapporterats. Dessutom detta protokoll också arbetat framgångsrikt för att ge detaljerade cellmorfologin av spikelets från ris, vete och majs (Figur 6). Spikelets är kända för att innehålla rikligt kiseldioxid 9. Normalt orsakar att svårigheter att ledande vävnad snittning.
In situ-hybridisering
In-situ hybridisering (ISH) har utvecklats för att lokalisera genuttrycksmönster på vävnadsnivå 11, 22-25. Dessutom kan ISH ger cellulära, och i vissa fall sub-cellulär, upplösning av mRNA distribution i flercelliga organismer 26. Under ISH är avgörande för att få tillförlitlig rumslig information om den valda transkript RNA och vävnadsintegritet. Vi testade ISH med användning av Hybrid-Cut-protokollet Actin genen (PATC157348) klonades med hjälp av primrar 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'och 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3 "för att få 242 bp PCR-amplikon Cyklin B1:.. 1 (PATC146999) genspecifik kodande sekvensen med användning av primrar 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'Och 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 "för att få 327 bp PCR-amplikon. Efter ISH, aktin och cyklin B1: 1 genuttryck övervakades hos unga och mogna armhålan knoppar (Figur 7). Båda generna uttrycktes i meristematiska celler av 2: a och 3: e axillära knoppar, med starkare signaler detekterades i 3 rd axillära knoppar. Dessa resultat visade att Hybrid-Cut behålla bra anatomi och ger spatial genuttrycket.
Figur 1: Traditionell Paraffin avsnitt orsakar svår rivning av Tissue En paraffinblock som innehåller en armhålan knopp Phalaenopsis orkidé utsattes för regelbunden mikrotom sektionering.. Svår rivning av paraffin band observerades efter traditionell mikrotom sektionering (A) (B). Pilarna visar den svåra sönderslitning av vävnaden slice. Arrowhead visar kristallorgan. Skala bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Hybrid-Cut Sektione Metod En armhålan bud vävnaden fixerades i PFA och vävnader var uttorkad, infiltrerade med paraffin, och inbäddade i en paraffinblock. Paraffinblocket trimmades till en lämplig storlek (A). Optimal Cutting Temperature föreningen (oktober) applicerades på mitten av kryostat steget (B). Paraffin blocket fästes till oktober på kryostaten scenen. Under låg temperatur, paraffinblocket fästes vid kryostat stadiet via oktober (C). Vävnadsskivor sektionerades i kryostat kammaren vid -16 ° C (D). Skalstrecken representerar 0,5 cm (A) och 1 cm (BD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Hybrid-Cut Förbättrar avsnitt Integrity En paraffinblock som innehåller en armhålan knopp Phalaenopsis orkidé utsattes för Hybrid-Cut sektionering (A) och Hybrid-Cut-metoden producerade sektioner med utmärkt vävnadsintegritet (B).. Den pilspets visar de endogena kristallorgan inbäddade i armhålan linda vävnaden. Skalstock 100 um.rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tillämpning av hybrid-Klipp till olika vävnadssnitt av Phalaenopsis orkidé Olika orkidé. vävnader sektionerades med användning av Hybrid-Cut metod, såsom längdsnitt av orkidé utsäde under mogen fas (A), längsgående sektion av protocorm (B), längsgående tvärsnitt av protocorm liknande kroppar (PLB) (C), tvärgående sektion av bladet bladet (D), längsgående sektion av rot (E), längsgående sektion av ung stocklöpare (F) och längdsnitt av unga blomknoppar (G). Vävnadssnitt färgades av hematoxylin. SC, fröskal; PB, proteinkropp; M,meristem; MP, mor PLB; DP, dotter PLB; Ad, adaxial bladytan; Ab, abaxial bladytan; St, klyvöppningar; MC, mesophyll cell; VB, vaskulär bunt; RC, rot cap; fb, blomknopp; Se, sepal; Pe, kronblad; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, förhårdnader. Pilspetsar visar kristaller. Skalstrecken representerar 20 pm (AE) och 200 pm (FG). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Hybrid-Cut Bevarar bladvävnad integritet i flera spannmålsskördar Jämförelse av bladvävnad med den traditionella paraffin metoden (vänster panel) och Hybrid-Cut teknik som utvecklats i denna studie (höger panel). Bilderna visar bladtvärsektioner av ris, vete och majs. MC, mesophyll cell; Ph, floem; St, klyvöppningar; BC, bu lliform cell. Pilar visar sönderslitning av vävnaden slice. Pilspetsar visar kiselorgan. De blå streckade cirklarna indikerar Kranz anatomi i C4 majs. Skalstrecken 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Hybrid-Cut Bevarar spikelet vävnadsintegritet i flera spannmålsskördar Jämförelse av vävnad integritet spikelet sektioner mellan traditionella paraffin och Hybrid-Cut metoder. Pilar visar sönderslitning av vävnaden slice. Pilspetsar indikerar kiseldioxid kroppar. Skalstrecken 20 pm (ris), och 200 pm (vete och majs). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: In Situ Hybridisering av Actin och CyclinB1; 1 uttrycksmönster i Axillary Bud av Phalaenopsis orkidé Vävnads skivor av den 2: a axillära knoppar och 3 rd axillär knopp framställdes med användning av Hybrid-Cut-metoden.. Totalt 40 ng av Actin och CyclinB1; en dig-märkt sond användes för hybridisering. Känslan prob användes som en negativ kontroll. Pilarna anger reproduktiv meristem av armhålan knopp. Skalstrecken 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Växtceller har styva cellväggar, tuffa fibrer, kristaller och hög vattenhalt som orsakar vävnads slita problem under växtvävnad snittning. Även om paraffinbaserad sektionering används ofta för växtvävnader, de endogena kristaller SARGA ofta växtvävnaden under sektionering (Figur 1). På grund av den inneboende höga vattenhalten inom växtcellerna, orsakar kryostat baserade sektione ofta brutna celler och spruckna vävnadssektioner.
I den aktuella studien var en kombinerad paraffin-inbäddning och kryosektion protokoll som heter Hybrid-Cut utvecklat och god vävnadssnitt kvalitet erhölls. Detta protokoll löser problemet i samband med högt vatteninnehåll genom att införa paraffininbäddning, och minskar bristningar effekt genom härdning paraffinvax under låg temperatur vid snittning (Figur 3). Därför är fördelaktig jämfört med antingen paraffin-baserad ITT denna modifierade protokollning eller cryosectioning för att bevara växtvävnad integritet.
Detta manuskript visar att Hybrid-Cut-metoden bevarar vävnadsintegritet i många vävnader hos Phalaenopsis orkidé såsom armhålan knopp, frö, och PLB, etc. som innehåller höga halter av kristaller (figurer 3-4). Dessutom är detta protokoll mottaglig för spannmål som reproduktionsorgan och blad av ris, majs och vete som innehåller höga kiseldioxid (figurerna 5-6). Förmodligen kan detta protokoll tillämpas på vedartade växter som innehåller höga fiber.
I allmänhet är fastställande vävnad ordentligt mycket viktig för Hybrid-Cut. Vi fann att formaldehyd-alkohol-sur syra (FAA) fixativ är bättre än PFA att bevara vävnad integritet vissa motsträviga vävnader såsom axiellt knoppar, rötter, etc. Men fungerar PFA bättre än FAA att bevara RNA integritet. Därför PFA rekommenderas att åtgärdaprov för in situ hybridisering (ISH) arbete. Protokollet som beskrivs här är utformad för RNA ISH experiment. Därför var alla reagens beredda att undvika RNA nedbrytning genom att eliminera RNas förorening av DEPC behandling. Om Hybrid-Cut sektionen är för anatomiska studier, regelbunden omvänd osmos (RO) vatten och dess härledda buffert eller reagens är acceptabla.
Minska prov storlek och tjocklek till mindre än 3 mm är till hjälp för infiltration. Dessutom ökar nedsänkningstid för dehydrering och infiltration är nödvändiga för hård konsistens vävnader. Begränsning av detta protokoll kan bero på problem som orsakas av otillräcklig fixering, dehydrering, och infiltration av provet. Därför är justering av behandlingstiden för varje steg kritiskt att producera bra kvalitet paraffin block. Normalt behöver hårdare vävnad längre bearbetningstid än mjukare vävnad.
Dessutom visade vi att Hybrid-Cut arbetat framgångsrikt i kombination with ISH att ge rumslig fördelning av de utvalda transkript (Figur 7). Sammanfattningsvis är detta protokoll användbara för studier av växtanatomi och tillhandahåller en vävnadsspecifik RNA-karta över de valda generna. Dessutom kan den appliceras till andra molekylära studier såsom terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end märkning (TUNEL) -analys, fluorescerande in situ-hybridisering (FISH), och immunfärgning tekniker. Sammanfattningsvis är denna förbättrade vävnad snitt protokoll både användbar och till hjälp för forskare inom växtsamhällen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
| Microtome model RM2255 | Leica | ||
| Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
| Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
| RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
| Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
| Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
| Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
| Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
| Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
| SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
| FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
| Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
| Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
| pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
- Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
- Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
- Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
- Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
- Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
- Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
- Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
- Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
- Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
- Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
- Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
- Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
- Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
- Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
- Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
- Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
- Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
- Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
- Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
- Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
- Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
- Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).
