Abstract
Fastholdelse plante sektion integritet er væsentlig for at studere detaljerede anatomiske strukturer på cellulært, væv, eller endda organ niveau. Men nogle planteceller har stive cellevægge, hårde fibre og krystaller (calciumoxalat, silica, etc.), og højt vandindhold, der ofte forstyrrer væv integritet under plantevæv sektionering.
Denne undersøgelse etablerer en simpel Hybrid-Cut væv sektionering metode. Denne protokol ændrer en paraffin-baseret sektionering teknik og forbedrer integriteten af vævssnit fra forskellige planter. Plantevæv blev indlejret i paraffin, før sektionering i en kryostat ved -16 ° C. Sektionering under lav temperatur forhærdede paraffinblokke, reduceret tåreflåd og skrabe, og forbedret væv integritet væsentligt. Denne protokol blev anvendt med succes til calcium oxalat-rige Phalaenopsis orkidé væv samt genstridige væv såsom reproduktiv organs og blade af ris, majs, og hvede. Desuden kunne den høje kvalitet af vævssnit fra Hybrid-Cut anvendes i kombination med in situ hybridisering (ISH) for at tilvejebringe rumlige ekspressionsmønstre for gener af interesse. Afslutningsvis denne protokol er særlig nyttig til genstridige plantevæv med høj krystal eller silicaindhold. Gode vævssnit kvalitet muliggøre morfologiske og andre biologiske undersøgelser.
Introduction
Den paraffin-baserede sektionering metoden er en udbredt teknik til anatomiske studier. Bevarelse af intakt væv anatomi er vigtig for morfologiske og biologiske undersøgelser. Den paraffinindlejret sektionering teknik er fordelagtig, fordi paraffin-embedding bevarer celler og væv morfologi. Desuden kan paraffinblokke opbevares bekvemt i lange perioder. Imidlertid paraffinindlejret sektionering er ikke egnet til plantevæv indeholdende intracellulære krystaller. Krystaller i cellerne ofte rive paraffin bånd og vævsskader integritet under sektionering.
I modsætning til paraffin sektionering, cryosectioning er relativt hurtig og sektioner kan opnås uden fiksering, seriel dehydrering eller indlejring medium infiltration 1. Kryosektioner er kompatible med mange anvendelser, såsom immunhistokemi, in situ-hybridisering og enzym histokemi. Den anden fordel ved cryosectioning erat denne metode ikke går igennem en potentiel denaturering processer såsom høj temperatur og kemiske behandlinger, er så cellulære molekyler velbevarede inden vævssnittene 2. Cryosectioning foretrækkes generelt frem paraffin-baseret sektionering til studier i dyrevæv. Men cryosectioning er ikke første valg i planter, fordi frysning temperatur til tider forårsager dannelse af iskrystaller, der påvirker kvaliteten af afsnittet integritet. Selvom osmoregulering såsom saccharose opløsninger, polyethylenglycol (PEG), eller glycerol-3 er rapporteret at reducere krystal isdannelse under frysebetingelser, forbedringen er mindre end optimal.
For at tilpasse sig forskellige miljøer, forskellige planter har ofte forskellige væv tekstur og planteceller har udviklet sig til at danne stive cellevægge, hårde fibre og krystaller 4,5. For eksempel uopløselige calcium oxalat krystaller og silica organer er ret almindelig iplanter 6. Silikat organer / krystaller er blevet rapporteret til at hjælpe med at opretholde plante arkitektur, erectness, og forebygge sygdom eller skadedyr i korn planter 7-9.
De syltet orkideer og cut-blomst orkidé markedet blomstrer, og det er en voksende industri. Phalaenopsis aphrodite (orkidé) er en af de vigtigste eksportmarkeder prydplanter i Taiwan. Der er gjort en betydelig indsats for at forstå de morfologiske og fysiologiske ændringer i de blomstrende processer i Phalaenopsis orkidéer. Blomster pigge Phalaenopsis orkidéer initieres fra armhulen knopper på bladet base. Efter en periode med køligt omgivende temperatur (ca. halvanden måned), armhulen knopper forstørre, bryde vækstdvale, og rage fra bladet basen at udvikle sig til unge blomster pigge. For at forstå de fysiologiske, cellulære og molekylære processer i spike indledning, er det nødvendigt at udvikle en robust anatomisk teknik til udstyr og forretniLize væv eller markører i tide. Tilstedeværelsen af allestedsnærværende krystaller i orchid væv, især i armhulen knopper, gør anatomiske arbejde vanskelig.
Her søgte vi at forbedre sektion integriteten af genstridige plantevæv, der hidtil har været betragtet som teknisk udfordrende. Her viser vi en forbedret protokol hedder Hybrid-Cut. Det er en paraffin-baseret sektionering metode, der udføres ved anvendelse af en kryostat. Paraffin indlejring løser højt vandindhold i plantevæv. Sektionering under lav temperatur hærder paraffinblokken, reducerer krystal rive problem, og forbedrer vævsintegritet betydeligt. Denne protokol forbedrer vævsintegritet for genstridige vegetabilske prøver betydeligt.
Protocol
1. Fiksering og Indlejring
- forberedelse Reagens
- 10x phosphatpufret saltvand (PBS)
- Der tilsættes 80 g NaCl, 2 g KCI, 14,4 g Na 2 HPO 4, og 2,4 g KH 2 PO 4 i 800 ml dobbelt destilleret vand (Hedeselskabet 2 O), og pH indstilles til 7,4 med HCI. Tilføj Hedeselskabet 2 O til et samlet volumen på 1 liter, tilsæt derefter 1000 pi diethylpyrocarbonat (DEPC) og rystes kraftigt. Store PBS natten over ved stuetemperatur og autoklaveres ved 121 ° C i 20 minutter den følgende dag.
- 1x PBS
- Fortynd stock 10x PBS ved 1:10 i Hedeselskabet 2 O til opnåelse af en slutkoncentration på 0,01 M Na 2 HPO 4, 0,002 M KH 2 PO 4, 0,003 M KCI, og 0,13 M NaCl.
- Paraformaldehyd (PFA) fiksativ
Forsigtig: Paraformaldehyd er giftigt. Forbered det under en emhætte. Brug handsker.- Til fremstilling 250 ml PFA fiksativ, opvarme 100ml 1x PBS til 70 - 80 °, og der tilsættes 1.750 pi NaOH. Derefter tilsættes 10 g paraformaldehyd og bland grundigt, indtil opløst. Placer løsning på is og derefter justere pH til 7,2 med H 2 SO 4 (260 - 270 pi til 100 ml) efter afkøling.
- Justere lydstyrken til 250 ml med 1x PBS, tilsættes 625 pi glutaraldehyd til en slutkoncentration på 0,25%. Tilsæt 250 pi Triton X-100 og 250 pi Tween 20 for at lette infiltration af fiksativ.
BEMÆRK: PFA fixativ kan opbevares ved 4 ° C i en måned uden at miste sin fiksering evne.
- Forbered forskellige koncentrationer af ethanol (30%, 50%, 70%, 85%, og 95%) med DEPC-behandlet vand.
- 10x phosphatpufret saltvand (PBS)
- Plant prøveindsamling
- aksil knopper
- Brug modne Phalaenopsis orkidé planter på firkløver fase. Fjern forsigtigt blade ved at rive bladet efter midtribbe ved hjælp af hænder.
- Brug en skarp skalpel til carefUlly fjerne aksil knopper fra bunden af den tredje eller fjerde blad på monopodial stilk.
- basisprøve
- Harvest modne orkidé frø bælg på 4 måneder efter bestøvning. Skær frø bælg på langs med en skalpel. Ryst åbningen frø pod blidt og frigive de tørre frø på filtrerpapir.
- Protocorm
- Sow modne orchid frø på en 1 / 2x Murashige og Skoog-agarplade, og vokse i en vævskultur værelse i en 12 h lys periode og konstant temperatur på 25 ° C. Prøve grøn protocorm på 7 uger efter såning.
- Protocorm legemer (PLB)
- Grow orkidé PLB på T2 regenererende agarplader som tidligere 10 og sted beskrevet under de samme vækstbetingelser som i trin 1.2.3.1. Saml 10 PLB i en højde af 5 - 8 mm.
- bladprøve
- Indsamle bladvæv fra en moden Phalaenopsis orkidé plante som beskrevet i trin1.2.1.1.
- Brug en skarp skalpel til at skære et lille stykke bladvæv (7 mm længde x 5 mm bredde) fra den anden nyudviklede blade.
- rodprøve
- Under anvendelse af samme anlæg beskrevet i trin 1.2.1.1, dissekere 1 cm længde rodspids væv med en skarp skalpel.
- Unge spike
- Brug en skarp skalpel til at skære ung spike væv fra spidsen delen af stilk 10 cm i længden.
- blomsterknop
- Forbrugsafgifter en lille blomsterknop af 5 mm i diameter fra orkidé blomst stilk. Skær en del af blomsterknop væv i længderetningen (3 mm tykke).
- Bladvæv og småaks væv af kornafgrøder
- Skær 1 cm længde bladpladen væv fra de første nyudviklede blade fra planter ris, hvede og majs.
- Saml 10 småaks fra planter (ris, hvede og majs) en dag før anthesis.
- aksil knopper
- fiksering
- Fix plante prøver straks ved at overføre dem til en glasscintillationshætteglas indeholdende 15 ml iskold PFA fiksativ.
- Påfør et vakuum (~ 720 mm Hg) til plante prøver i et 4 ° C køligt rum. Hold vakuum i 15 - 20 min (bør frigives små bobler fra prøverne). Gentag dette trin, indtil de fleste af de væv synker efter frigivelsen af vakuum. Hold vakuum natten og frigive vakuum langsomt den næste dag.
- Dehydrering
BEMÆRK: Brug samme hætteglas fra fikseringen gennem infiltration trin. Hæld eller brug en pipette til at dræne opløsningen i forrige trin og erstat med 15 ml nyt opløsning i hætteglasset. Afhængigt teksturen af væv, behandle hårdere væv, såsom orchid axillær knop, frø, protocorm, og PLB, og småaks af ris, hvede og majs i længere tid; behandle blødere væv såsom orkidé blomsterknop, unge spike, blade og rod, og bladet af ris, hvede og majs i kortere tid.- Dehydrere prøver i 15 ml ethanol serie ved stuetemperatur som følger: 30% ethanol i 30 minutter, 50% ethanol i 30 minutter, 70% ethanol i 1 time, 85% ethanol i 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv, 95% ethanol i 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv, og 100% ethanol to gange for 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv.
BEMÆRK: Plant prøver kan opbevares i 70% ethanol ved 4 ° C i flere måneder.
- Dehydrere prøver i 15 ml ethanol serie ved stuetemperatur som følger: 30% ethanol i 30 minutter, 50% ethanol i 30 minutter, 70% ethanol i 1 time, 85% ethanol i 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv, 95% ethanol i 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv, og 100% ethanol to gange for 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv.
- Infiltrere prøver med 15 ml erstatning blanding ethanol og xylen for hver 54 min for hårdere væv og 30 min til blødere væv, ved stuetemperatur som følger: ethanol / xylen substitut (2: 1, vol / vol), ethanol / xylen substitut (1 : 1, v / v), ethanol / xylen substitut (1: 2, vol / vol), og ren xylen erstatning to gange. Advarsel: Xylen er giftigt. Gør dette trin i stinkskab. Infiltrere prøven i hætteglas med 15 ml xylen erstatning og paraffin blandingen i en ovn ved 60 ° C, natten over til hårdere væv, og i 60 minutter til blødere væv som følger: xylen erstatning / paraffin (2: 1, vol / vol), xylen erstatning / paraffin (1: 1, vol / vol), og xylen erstatning / paraffin (1: 2, vol / vol).
- Infiltrere prøven med 15 ml ren paraffin to gange om dagen og inkuberes ved 60 ° C i en ovn.
- Gentag trin 1.5.3 den næste dag.
- Tænd for strømmen af vævet indlejring center 1 time på forhånd at smelte voks i paraffin reservoir før indlejring væv i en paraffin blok.
- Varm op metalformene (størrelse af base 3.3 cm længde x 2 cm bredde) på varmepladen ved 62 ° C, og hæld ca. 13 ml smeltet voks i formen base.
- Overfør en vævsprøve fra afsnit 1.5.4 i formen med varmede pincet og orientere det i den ønskede position.
- Flyt formenpå de kolde plade omhyggeligt, og forlade indtil voksen er størknet.
2. vævssektionering
- Paraffin sektionering metode
- Foretag en voks base ved at placere en indlejring kassette på toppen af en støbeform (samme størrelse i afsnittet 1.6.2), fyldes med smeltet voks og fjerne formen efter voksen er størknet.
BEMÆRK: indlejring kassette vil danne en voks base for at forankre prøven paraffin blok. - Trim paraffinblokken i en passende form og størrelse, og placere nogle voks stykker på en flad spatel. Varm voks stykker med en alkohol brænder indtil voks smelter og derefter placere den smeltede voks på voks base i afsnit 2.1.1 til at klæbe blokken. Spænd det i mikrotomen.
- Placer en ny klinge på mikrotom, og justere vinklen til 5 grader for at lette sektionering i mikrotomet.
- Skær prøven paraffinblokken i tynde skiver (10 um), som tidligere 11 beskrevet. </ Ol>
- Foretag en voks base ved at placere en indlejring kassette på toppen af en støbeform (samme størrelse i afsnittet 1.6.2), fyldes med smeltet voks og fjerne formen efter voksen er størknet.
- Hybrid-Cut sektionering metode
- Trim prøven paraffinblokken fra trin 1.6.4 på en søjle med en trapez overflade ved toppen til en passende størrelse ved hjælp af et barberblad.
- Tilføje nogle Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OLT) til centrum af kryostaten fase. Fastgør paraffin blok til kryostat scenen og derefter hurtigt orientere vævsblokken i den ønskede position.
- Overfør paraffinblokken / etape til en kryostat kammer. Tillad OLT til et størkne på hurtig fryse bar ved -42 ° C i 10 min. Flyt ikke blokken under størkning OLT (Figur 2C).
- Tillad kryostaten adapter og kammer temperatur at køle ned til -20 ° C og -16 ° C henholdsvis før fastgørelse paraffinblokken / fase til den kryostat adapter. Afsnit væv til 10 um i tykkelse.
- Pick vævssnit med pincet. Float afsnittene om 800 pi DEPC-behandlet vand i en Poly - L - lysin coated slide og overføre objektglassene på en varmeplade ved 42 ° C.
- Lad afsnittene til at flade på DEPC-behandlet vand ved 42 ° C. Brug filtrerpapir til at bortlede vandet fra kanten.
- Monter væv på diaset ved at placere dias på en 42 ° C varm plade natten over.
3. Tissue Farvning
- Afparaffinering
- Saml dias fra den varme plade og placere dem i en farvning rack. Tilsæt 150 ml xylen i en farvning krukke i stinkskab og fordybe rack i xylen i 5 min.
- rehydrering
- Forbered forskellige koncentrationer af ethanolopløsninger (100%, 95%, 70%, 50% og 30%) i DEPC-behandlet vand og fyld 150 ml opløsning i separate farveskålene hhv.
- Rehydrere prøverne gennem en række faldende ethanolkoncentration, hvert trin i 3 min ved stuetemperatur. Overfør objektglassene i farvningen sættes en krukke til en anden beholder indeholdende different ethanolkoncentrationer: 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol og 30% ethanol.
- Efter rehydrering, fordybe modellerne i Hedeselskabet 2 O i 3 min.
- Hematoxylin farvning
- Farv vævsprøver ved at nedsænke væv slides i hæmatoxylin opløsning i 1,5 min.
- Skyl kort i Hedeselskabet 2 O indeholdende 1 - 2 dråber 12 N saltsyre (HCI) i et par sekunder, og derefter vaskes hurtigt i Hedeselskabet 2 O.
- Dehydrering
- Dehydrere prøverne gennem en serie af stigende ethanolkoncentrationer i 3 min ved stuetemperatur: 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 95% ethanol og 100% ethanol. Fjern prøverne med xylen i stinkskab i 5 min.
- Montering
- Drop passende vis 600 pi xylen-baserede montering medium på dias. Placer forsigtigt et dækglas over prøven. Undgå luftbobler danner at få god kvalitet billeder.
- Lad dias at lufttørre natten over. Overhold prøven under mikroskop næste dag.
Bemærk: Billeder blev taget til fange ved 25X til 400X forstørrelse afhængigt af størrelsen af eksemplarer.
4. In situ hybridisering
- probesyntese
- Klon Phalaenopsis aphrodite Actin genspecifikke kodningssekvens anvendelse af primere 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'og 5'AGGACAGAAGTTCGGCTGGC 3' (for at få 242 bp PCR-amplikon) og CyclinB1; 1 genspecifikke kodende sekvens under anvendelse af primere 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 ' og 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(for at få 327 bp PCR-amplikon) som beskrevet 12.
- Ligere specifikke kodende sekvenser i vektorer (f.eks pGEMT) ifølge fabrikantens protokol.
- Generere digoxigenin (DIG) -mærket sense og antisense prober under anvendelse SP6 / T7 DIG-RNA-mærkningskit i overensstemmelse med producentens instruktioners.
- In situ-hybridisering
- Skær 2. og 3. aksillær opløbet væv skiver (10 um tykkelse) genereret ved hjælp af Hybrid-Cut-metoden, og monter skiver på coated dias.
- Afparaffiniser vævssnit i xylen (se 3.1.1), rehydrere i faldende koncentrationer af ethanol (se 3.2.2), og fordøje med 2 mg / ml proteinase K ved 37 ° C i 30 minutter.
- Udføre in situ hybridisering ifølge protokollen beskrevet tidligere 11,13 med visse modifikationer, dvs., med hybridiseringstemperatur for actin som 59 ° C og 60 ° C i CyclinB1;. 1 hybridisere slide med 40 ng DIG-mærket RNA-probe.
- Brug nitroblue tetrazolium / 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBT / BCIP) opløsning til at detektere hybridiseringssignaler som beskrevet 11.
Representative Results
Hybrid-Cut Forbedrer integritet vævssnit
Forståelse anatomi reproduktive blomster struktur er vigtig for at undersøge den underliggende mekanisme af blomst initiering i orkideer. Imidlertid akkumulering af intracellulært calcium oxalat krystaller i Phalaenopsis orkideer gør sådanne undersøgelser en udfordrende opgave. For at omgå problemerne med tåreflåd forårsaget af krystaller under skæreprocessen (figur 1), vi udviklet et system, vi hedder Hybrid-Cut. Denne protokol kombinerer traditionelle paraffin indlejring og kryosektion teknikker. Vi først testede Hybrid-Cut i aksillær knopper af Phalaenopsis orkidé, fordi de er berygtet for væv stivhed og høj krystal indhold. Axillary opløbet væv blev fikseret i 4% PFA (se protokol, trin 1.3). Efter seriel ethanol dehydrering og paraffin infiltration, armhulen opløbet blev indlejret i en paraffin blok. Blokken blev trimmet til en passende størrelse, før sektionering (figur 2A). En lille mængde OLT blev derefter påført på midten af kryostaten fase (Figur 2B). Den paraffin blok blev derefter klæbet til scenen via oktober Etapen blev inkuberet i en kryostat i 10 minutter for at tillade fuldstændig størkning OCT før sektionering (Figur 2C) og derefter kryosektion blev udført i en -16 ° C kammer (figur 2D).
Til sammenligning blev en paraffin blok, der indeholder en aksillær knop af Phalaenopsis orkidé udsat for regelmæssig mikrotom sektionering. Som vist i figur 1A, blev alvorlig rives over paraffin bånd observeret efter mikrotomsektionering. Vævet integritet og cellulær struktur blev også kompromitteret (figur 1B). Hybrid-Cut, på den anden side,producerede intakte vævssnit (figur 3A) med bevaret strukturel integritet (figur 3B).
Anvendelse af Hybrid-Cut til forskellige væv af P. aphrodite
For yderligere at teste modtagelighed af Hybrid-Cut, vi testede forskellige væv af Phalaenopsis orkidéer. Det er ofte vanskeligt at opnå dele af frø med god vævsintegritet grund af de hærdede frøskaller. Ved hjælp af denne protokol, blev detaljerede strukturer af frø bevaret efter sektionering (figur 4A). Som vist i figur 4A, protein organer, kunne de fælles opbevaring produkter 14, klart identificeres. Hybrid-Cut også arbejdet med succes og viste de detaljerede strukturer i skyde apikale meristem af en måned gamle protocorm (de spirede struktur fra et frø) (figur 4B) ogprotocorm-lignende-organer (PLB, figur 4C). De intracellulære krystaller blev observeret i sektioner af PLB. Phalaenopsis orkidéer har tykke og saftige blade og de udfører Crassulacean syre metabolisme (CAM) -type fotosyntese 15. Den tværgående del af bladpladen viste store mesofylceller og vaskulære bundter indeholder xylem og phloem (figur 4D). Få stomatale åbninger blev observeret på abaxial bladoverfladen i dagtimerne (figur 4D). Faktisk CAM planter udviklet sig til at maksimere kulstof gevinst, men samtidig minimere vandtab ved at åbne deres stomates i nat under tørre forhold 15,16. Roden apikale meristem af P. aphrodite er vist i figur 4E. Rodenden celler syntes at indeholde et betydeligt antal krystaller, der blev meget velbevarede efter sektionering (Figur 4E). Længdesnit af unge blomster pigge forudsat information om arkitekturen af unge blomster primordials (Figur 4F). Desuden bægerblade, kronblade, labellum, og pollinia klart kunne identificeres fra længdesnit af unge blomsterknopper, som har afsluttet differentiering i denne 5 mm blomsterknop (Figur 4G). Bemærk at krystaller blev akkumuleret i bægerblade af unge blomster knopper. Kort sagt, denne protokol fungerer konsekvent at opretholde væv integritet og producerer intakt morfologi muliggør anatomiske og eventuelle cellulære undersøgelser.
Hybrid-Cut Bevarer Tissue Integritet i kornafgrøder
Vi har også testet Hybrid-Cut på kornafgrøder såsom ris, hvede og majs, der indeholder højt indhold af silica 17,18. Som vist i figur 5, blev vævet integritet tværsnit af ris, hvede og majs blade forbedres signifikant ved Hybrid-Cut-metoden. Xylem, Phloem, mesofylceller, stomates, og bulliform celler, der styrer rullende af bladpladen at undgå vandtab var klart identificeret fra dele af ris blade. Den Kranz anatomi, mesofylceller, og vaskulære bundter af majs blad 19,20 var klart identificeret. Det var spændende at finde en høj tæthed af stomates på både adaxial og abaxial sider af majsblade (figur 5). Forholdet mellem adaxial og abaxial stomata på 0,7 i majs er tidligere 21 blevet rapporteret. Desuden denne protokol også arbejdet med succes til at give den detaljerede celle morfologi småaks fra ris, hvede og majs (figur 6). Småaks er kendt for at indeholde rigeligt silica 9. Normalt, og som forårsager problemer, når de vævssektionering.
In situ-hybridisering
In situ hybridisering (ISH) er blevet udviklet til at lokalisere genekspressionsmønstre på vævsniveau 11, 22-25. Desuden kan ISH give cellulær, og i nogle tilfælde sub-cellulær, opløsning af mRNA distribution i flercellede organismer 26. Under ISH, RNA og væv integritet er afgørende for at opnå pålidelige geografisk information om den valgte udskrift. Vi testede ISH hjælp af Hybrid-Cut-protokol Actin gen (PATC157348) blev klonet ved anvendelse af primerne 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'og 5'AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' for at få 242 bp PCR-amplikon cyclin B1:.. 1 (PATC146999) gen specifik kodende sekvens under anvendelse af primere 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG3 'og 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' for at få 327 bp PCR-amplikon. Efter ISH, Actin og cyclin B1: 1-genekspression blev overvåget i unge og modne armhulen knopper (Figur 7). Begge gener blev udtrykt i meristemceller af 2. og 3. axillære knopper, med stærkere signaler detekteres i 3 rd axillære knopper. Disse resultater viste, at hybrid-Cut bevarer god anatomi og giver rumlige genekspression mønster.
Figur 1: Traditionel Paraffin Afsnit Årsager Svær rivning af Tissue A paraffin blok, der indeholder en aksillær knop af Phalaenopsis orkidé blev udsat for regelmæssig mikrotom sektionering.. Alvorlig rives over paraffin bånd blev observeret efter traditionel mikrotomsektionering (A) (B). Pilene viser den alvorlige rivning af vævssnit. Arrowhead viser krystal organer. Scale bar 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Hybrid-Cut Sektionsinddeling Metode En axillær bud væv blev fikseret i PFA og væv blev dehydreret, infiltreret med paraffinvoks, og indlejret i paraffin blok. Paraffinblokken blev trimmet til en passende størrelse (A). Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OCT) blev anbragt i centrum af kryostaten fase (B). Den paraffin blok var knyttet til OLT på kryostat scenen. Under lav temperatur, paraffinblokken blev klæbet til kryostat fase via oktober (C). Vævssnit blev snittet i kryostatkammeret ved -16 ° C (D). Scale søjler repræsenterer 0,5 cm (A), og 1 cm (BD). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hybrid-Cut Forbedrer Afsnit Integritet En paraffin blok, der indeholder en aksillær knop af Phalaenopsis orkidé blev udsat for Hybrid-Cut sektionering (A) og Hybrid-Cut-metoden producerede sektioner med fremragende væv integritet (B).. Den pilespids viser de endogene krystal organer indlejret i armhulen opløbet væv. Scale bar 100 pm.rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Anvendelse af Hybrid-Cut til forskellige vævssnit af Phalaenopsis orkidé Different orkidé. væv blev snittet ved anvendelse af Hybrid-Cut fremgangsmåde, såsom længdesnit af orkidé frø under det modne stadie (A), længdesnit af protocorm (B), langsgående snit af protocorm legemer (PLB) (C), tværsnit af bladplade (D), længdesnit af roden (E), længdesnit af ung blomst spike (F), og længdesnit af unge blomsterknopper (G). Vævssnit blev farvet med hematoxylin. SC, frøskal; PB, protein organ; M,meristem; MP, mor PLB; DP, datter PLB; Ad, adaxial blad overflade; Ab, abaxial bladoverfladen; St, stomata; MC, mesophyll celle; VB, vaskulær bundt; RC, rod cap; fb, blomsterknop; Se, bægerblad; Pe, kronblad; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, callus. Pilespidser viser krystaller. Scale søjler repræsenterer 20 um (AE) og 200 um (FG). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Hybrid-Cut Bevarer Leaf Tissue Integritet i flere kornafgrøder Sammenligning af bladvæv ved hjælp af den traditionelle paraffin metode (venstre panel) og Hybrid-Cut-teknik er udviklet i denne undersøgelse (højre panel). Billederne viser blad tværsnit af ris, hvede og majs. MC, mesophyll celle; Ph, phloem; St, stomata; BC, bu lliform celle. Pile viser rivning af vævssnit. Pilespidser viser silica organer. De blå stiplede cirkler angiver Kranz anatomi i C4 majs. Scale bars 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Hybrid-Cut Bevarer spikelet Tissue Integritet i flere kornafgrøder Sammenligning af væv integritet spikelet sektioner mellem traditionelle paraffin og Hybrid-Cut metoder. Pile viser rivning af vævssnit. Pilespidser angiver silica organer. Scale stænger 20 um (ris), og 200 um (hvede og majs). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: In situ hybridisering af actin og CyclinB1; 1 Expression Mønstre i Axillary Bud af Phalaenopsis orkidé Tissue skiver af den 2. armhulen knopper og 3. aksillær opløbet blev fremstillet ved anvendelse af Hybrid-Cut-metoden.. I alt 40 ng af actin og CyclinB1; 1 DIG-mærkede probe blev anvendt til hybridisering. Sense probe blev anvendt som en negativ kontrol. Pile angiver den reproduktive meristem af aksillær opløbet. Scale bars 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Plant celler har stive cellevægge, hårde fibre, krystaller, og højt vandindhold, der forårsager væv rive problemer under plantevæv sektionering. Selvom paraffin-baserede sektionering bruges ofte til plantevæv, de endogene krystaller ofte lacerate plantevævet ved skæring (figur 1). På grund af den iboende høje vandindhold i plantecellerne, kryostat-baserede sektionering ofte forårsager brudte celler og krakket vævssnit.
I den foreliggende undersøgelse blev en kombineret paraffin-indlejring og kryosektion protokol navngivet Hybrid-Cut udviklet og god vævssnit kvalitet blev opnået. Denne protokol løser problemet forbundet med højt vandindhold ved indføring paraffinindlejring og reducerer rivning virkning ved hærdning paraffinvoks under lav temperatur under sektionering (figur 3). Derfor er denne modificeret protokol er fordelagtig i forhold enten paraffin-baseret sektionning eller cryosectioning for at bevare plantevæv integritet.
Dette håndskrift viser, at Hybrid-Cut metode bevarer væv integritet i mange væv af Phalaenopsis orkidé såsom aksillær opløbet, frø, og PLB mv, der indeholder høje niveauer af krystaller (figur 3-4). Desuden er denne protokol er modtagelig for kornafgrøder såsom reproduktionsorganer og blade af ris, majs og hvede, der indeholder høj silica (figur 5-6). Formentlig kan denne protokol anvendes på træagtige planter, der indeholder højt fiberindhold.
Generelt fastsættelse væv grundigt er meget vigtigt for Hybrid-Cut. Vi fandt, at formaldehyd-alkohol-sure syre (FAA) fiksativ er bedre end PFA til at bevare vævet integritet nogle genstridige væv såsom aksialt knopper, rødder, osv Men virker bedre end FAA i at bevare RNA integritet, PFA. Derfor anbefales PFA at fastsætteprøve til in situ hybridisering (ISH) arbejde. Protokollen beskrevet her er designet til RNA ISH eksperiment. Derfor blev alle reagenser fremstillet for at undgå RNA-nedbrydning ved at fjerne RNase forurening med DEPC behandling. Hvis Hybrid-Cut afsnit er for anatomiske studier, regelmæssig omvendt osmose (RO) vand og dets afledte buffer eller reagenser er acceptable.
Reduktion eksemplar størrelse og tykkelse til mindre end 3 mm er nyttigt for infiltration. Desuden øger nedsænkning tid til dehydrering og infiltration er nødvendige for hårde tekstur væv. Begrænsning af denne protokol kan på grund af problemer forårsaget af utilstrækkelig fiksering, dehydrering, og infiltration af prøven. Derfor justering af behandlingstiden for hvert trin er afgørende for at producere god kvalitet paraffin blok. Normalt hårdere væv kræver længere behandlingstid end blødere væv.
Desuden viste vi, at Hybrid-Cut fungeret tilfredsstillende i kombination with ISH at tilvejebringe rumlige fordeling af de udvalgte transkripter (figur 7). Sammenfattende denne protokol er nyttig til studiet af planten anatomi og tilvejebringer en vævsspecifik RNA kort over de udvalgte gener. Derudover kan det anvendes til andre molekylære undersøgelser såsom terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og Immunofarvning teknikker. Afslutningsvis denne forbedrede væv sektionering protokollen er både nyttig og hjælpsom for forskere i plantesamfund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
| Microtome model RM2255 | Leica | ||
| Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
| Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
| RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
| Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
| Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
| Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
| Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
| Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
| SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
| FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
| Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
| Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
| pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
- Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
- Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
- Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
- Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
- Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
- Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
- Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
- Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
- Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
- Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
- Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
- Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
- Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
- Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
- Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
- Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
- Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
- Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
- Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
- Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
- Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
- Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).
