Summary
Detta protokoll beskriver den indirekta neuron-astrocyternas samodling för compartmentalized analys av neuron-glia växelverkan.
Abstract
Korrekt neuronal utveckling och funktion är en förutsättning för utveckling och den vuxna hjärnan. Emellertid är de mekanismer som ligger bakom den starkt kontrollerade bildningen och underhållet av komplexa neuronala nätverk inte fullständigt klarlagd hittills. De öppna frågorna om nervceller i hälsa och sjukdom är olika och sträcker sig från att förstå den grundläggande utveckling undersöka mänskliga relaterade sjukdomar, t.ex. Alzheimers sjukdom och schizofreni. Den mest detaljerade analysen av neuroner kan utföras in vitro. Men neuroner krävande celler och behöver extra stöd av astrocyter för sin överlevnad på lång sikt. Denna cellulära heterogenitet är i konflikt med målet att dissekera analysen av neuroner och astrocyter. Vi presenterar här en cellodlingsanalys som gör det möjligt att på lång sikt samodling av rena primära nervceller och astrocyter, som delar samma kemiskt definierat medium, samtidigt som fysisktseparerat. Med den här inställningen kulturerna överleva i upp till fyra veckor och analysen är lämplig för en mångfald av undersökningar rörande neuron-glia växelverkan.
Introduction
Alltigenom de senaste decennierna har den allmänna tolkningen av neuroglia funktion utvecklats från tilldelningen av en enbart stödjande mot en aktiv reglerande roll om neuronal funktion 1. På grund av deras framträdande inverkan på hjärnans homeostas vid hälsa och sjukdom 2, astrocyter är av särskilt intresse för det vetenskapliga samfundet. Under de senaste åren har en mångfald av studier inriktade på neuron-Glia interaktioner in vivo och in vitro 3. Men de flesta av de kultursystem tillåter inte för separat analys av båda celltyperna och deras respektive secretomes.
Flera tillvägagångssätt utnyttjar direkt samodling av nervceller och glia att uppnå långvarig överlevnad och fysiologiskt relevanta neuronala nätverket utveckling 4-6. Det nuvarande protokollet når samma mål samtidigt båda celltyper fysiskt separerade 7. Jämfört med conditioned mediet närmar 8,9, vårt system gör det möjligt att studera dubbelriktad kommunikation mellan nervceller och astrocyter. Uttrycket av utsöndrade signalmolekyler kan övervakas medan cellerna ska mogna i det delade mediumet. Denna möjlighet är särskilt relevant, eftersom astrocyter släppa lösliga faktorer, såsom cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulära matrixmolekyler 10,11, därmed reglera neuronal tillväxt och funktion 7,12. Sålunda har det visats att tillsatsen av trombospondin till retinala ganglionceller in vitro inducerar bildningen av synapser 13. Men andra ännu okända faktorer är nödvändiga för att göra synapser funktionella 13. Dessutom molekyler frigörs genom astrocyter måste identifieras för att förstå grunden för neuron-glia växelverkan.
Odling av primära neuroner och astrocyter från mus och råtta har beskrivits tidigare 14-16. Här vipresentera en elegant och mångsidigt verktyg för att kombinera båda celltyperna i en indirekt coculture strategi. Eftersom de två kulturerna är fysiskt åtskilda men delar samma medium, effekterna av neuroner, astrocyter och lösliga molekyler kan analyseras separat, vilket skapar ett kraftfullt verktyg för neuron-glia interaktionsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöken med möss i enlighet med den tyska lagen och den tyska Society for Neuroscience riktlinjer djurhållning. Djurvård och utnyttjande kommittéer Ruhr-Universität Bochum har beviljats ett lämpligt tillstånd.
1. Framställning och odling av kortikal Astrocyter
Obs: Utför dessa steg i protokollet minst 7 d innan du fortsätter till nästa steg, eftersom astrocyternas kulturer bör utvecklas till sammanflytande monolager innan nervceller framställs. Primära astrocyter härrör från blandade gliaceller kulturer erhållna från mus valpar kring postnatal dag (P) 0-3. Tre hjärnor (6 cortex) per T75 kolven ska användas.
- Förbered astrocyt mediet genom att komplettera Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% volym / volym hästserum och 0,1% volym / volym gentamycin under sterila betingelser. Lagra mediet vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Coat 3x T75 kolvar with 10 mikrogram / ml Poly-D-lysin (PDL; i cell-kultur-grade vatten) under minst 1 h vid 37 ° C i närvaro av 6% v / v CO2. Efter beläggning, tvätta flaskorna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna obundna katjoner, och tillsätt 9 ml astrocyt medium.
- För framställningen av hjärnorna, tillsätt 10 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till 1x 10 cm petriskål och ett ml HBSS till 1x 15 ml rör (oberoende av antalet av hjärnor som kommer att användas). Hålla ett par av kirurgiska saxar, 2 fin pincett och en kikare inom räckhåll för förfarandet.
- Halshugga 3 valpar snabbt med kirurgiska saxar och samla huvudet i en tom 10 cm skål.
- Utför framställningen av cortex under kikare. Med hjälp av två fin pincett, ta bort rygghuden från skallen vid mittlinjen, med start från halsen upp mot ögonhöjd. Därefter är hjärnan med sina blodkärl synlig under skallen.
- Fäst huvudet vid rostralt slutet med en pincett och incisionsfilm mittlinjen av skallen, med början vid den bakre änden. Därefter klippa av den högra och vänstra halvorna av skallen för att exponera hjärnan.
- Stäng spets pincett och placera den ventralt under hjärnan. Lyft hjärnan ur skallen och överföra den till HBSS fyllda 10 cm petriskål. Gör på samma sätt med de återstående provet tills alla hjärnor samlas i skålen.
- Efter uppsamling av hjärnor, börja med separationen av cortex genom att nypa av hindbrain med hjälp av en pincett som en sax. Gör en mittlinjen snitt mellan de båda hjärnhalvorna med en pincett. Noggrant fixera hjärnan med pincett och skär bort mellanhjärnan och luktsinnet lökar användning av en andra pincett för att sluta med de kortikala halvor.
- Fix en kortikala halv med en pincett och skala mening från hjärnhalvorna genom att lossa dem from den laterala kanten och därefter dra dem från den kortikala ytan med användning av en andra pincett.
- Vänd kortikala halv med sin yta orienterad nedåt mot skålen; noggrant dissekera och ta bort halvmånformade hippocampus genom att använda en pincett. Överför enstaka cortex i den koniska 15 ml rör med hjälp av en slutna pincett för att bära en enskild cortex.
- Efter att samla alla cortex, väg till sterila laminärt flöde huva och börja med förberedelserna för dissociation av kortikal vävnad.
- Tillsätt 1 ml DMEM till en 2 ml reaktionsröret och tillsätt 0,1% vikt / volym papain (30 enheter). Inkubera suspensionen i ett vattenbad vid 37 ° C tills en klarnade lösningen utvecklas (ca 3 min). Lägg 0,24 mg / ml L-cystein och 20 mikrogram / ml DNAse och skaka försiktigt.
OBS: För rötning, cirka 1 ml enzymlösning behövs. - Filter (0,22 ^ m porstorlek) för att erhålla en ml steril lösning före tillsats avden till den kortikala vävnaden. Inkubera rören i 30 minuter - 1 timme vid 37 ° C (dvs., i ett vattenbad).
OBS: Steg 1,11-1,14 är kritisk och bör slutföras inom 15 minuter. - För att avsluta uppslutningsreaktionen, tillsätt 1 ml astrocyternas medium och försiktigt mal sönder diger vävnad med hjälp av en 1 ml pipett. För finfördelning, rör försiktigt pipetten kolven och därigenom suga och extrudering av den kortikala vävnaden fjädring.
- När väl vävnaden har dissocierade till en enkelcellsuspension, tillsätt 5 ml astrocyt-medium och centrifugera under 5 min vid 216 x g.
- Aspirera supernatanten försiktigt från den resulterande pelleten och återsuspendera cellerna i en ml astrocyt medium.
- Tillsätt cellsuspensioner till T75-kolvar fyllas med 9 ml astrocyternas medium (se 1.2).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i inkubatorn i närvaro av 6% v / v CO2. Efter 4 d, utföra första kompletta mediet förändring (10 ml). Därefter ändra odlingsmediet varje 2-3 d.
- Efter 7 d, kolla om cellerna har bildat ett sammanflytande monolager. Om inte, vänta ytterligare 2 - 3 dagar tills fullständig sammanflödet av kulturen uppnås.
OBS: Astrocyter visa stora plattade cellkroppar, lokalisera längst ned i flaskan och inte utvecklar anmärkningsvärda cellulära processer. De skiljer sig från de små fas kontrast ljusa progenitorceller och mikroglia som bor ovanpå monoskiktet 17. - För att bli av med progenitorceller och få en ren astrocyternas kultur, placera T75-kolvar på en orbital shaker och skaka kulturerna O / N vid 250 rpm. Säkerställa att temperaturen justeras till 37 ° C, och att filtret i kolven är tätad med laboratoriefilm för att förhindra avdunstning av CO2.
- Nästa dag, aspirera mediet och tillsätt 10 ml färskt odlingsmedium fyllas med 20 iM cytosin-1-β-D-arabinofuranosid (AraC) att Eliminate rest delande celler.
OBS: inkubering med AraC för 2-3 d i inkubatorn vid 37 ° C, kommer 6% CO2 resulterar i en ren astrocyt kultur. - Övervaka renheten hos astrocyternas odlingar genom visuell inspektion under ljusmikroskop. Om kvarvarande fas kontrast ljus progenitorceller och mikroglia uppe fortfarande på toppen av astrocytisk monolager 17 (se steg 1,16) Upprepa steg 1,18 och 1,19.
OBS: sammanflytande och rena astrocyternas monolager kan hållas i upp till 14 dagar i inkubatorn (37 ° C, 6% v / v CO2) innan du fortsätter med nästa steg. Ändra hälften av mediet var 3 d. Inte samla in, frysa och tina astrocyter, eftersom dessa celler kommer att förlora sina neuronala stödjande egenskaper genom förfarande för lagring.
2. Förbereda Astrocyter för Indirekt Coculture
Obs: 48 - 72 timmar innan förbereda nervceller, överförings astrocyter till cell-kultur insatser. I allmänhet, erbjuder en enda T75 kolv ett tillräckligt antal celler för att stödja de neuronala kulturer erhållna med en beredning.
- Placera så många insatser som krävs i 24-brunnsplattor. Coat varje insats med 10 mikrogram / ml PDL (löst i cellkultur-grade vatten) under ca 1 h vid 37 ° C, 6% v / v CO2. Efter inkubationen, tvätta insatserna två gånger med PBS. Under tiden fortsätter med utarbetandet av astrocyter.
OBS: Skären fyllda med PBS kan hållas tills astrocyternas cellsuspensionen är klar för användning. - Aspirera astrocyt medium (med AraC) och tvätta odlingen en gång med 10 ml PBS för att säkerställa eventuella restserum avlägsnas.
- Tillsätt 3 ml av 0,05% trypsin-EDTA (etylendiamintetraättiksyra) och kolvarna och inkubera cellerna under trypsinering vid 37 ° C, 6% v / v CO2 under ca 10 min.
- Styr cell lossnar genom visuell inspektion med ett mikroskop och facilitate den lösgöring av cellerna genom att knacka på sidan av kolvarna mot skrivbordet.
OBS: Steg 2,5-2,8 är kritisk och bör vara klar inom 15-20 minuter. - Efter trypsinisering försiktigt återsuspendera cellerna i 7 ml astrocyternas medium och överföra cellsuspensionen till en 15 ml rör. Centrifugera i 5 minuter vid 216 x g.
- Försiktigt aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml astrocyternas medium.
- Räkna cellerna med användning av en räknekammare.
- Fyll botten av brunnarna i 24-brunnars-platta med 500 | il astrocyt medium och överföra 25.000 celler i 500 mikroliter astrocyt medium i varje enskild insats. Inkubera kulturen vid 37 ° C, 6% v / v CO2.
OBS: Efter 42-72 h kulturerna når ca 100% konfluens. I detta skede kan verifieras renheten av kulturen genom immuncytokemi 11. De sammanflytande kulturer kan bibehållas i upp till 7 dygn tills vidare tillnästa steg. Ändra hälften av mediet var 3 d.
3. Beredning av primär hippocampus nervceller
Obs: Primär mus hippocampus nervceller bör härledas från E15.5 - E16 embryon från tidsinställda gravida möss.
- Förbereda neuron medium (MEM med 10 mM natriumpyruvat, 0,1% vikt / volym ovalbumin, 2% volym / volym B27 mediumsupplement, och 0,1% volym / volym gentamicin (sterilfiltrerad)), och beredning medium (HBSS med 0,6% vikt / v glukos och 10 mM HEPES (4- (2-hydroxietyl) -1-piperazin etansulfonsyra)). Pre-varm och pre-jämvikt neuron mediet i filterkolvar vid 37 ° C, 6% v / v CO2.
- Placera glastäckglas (12 mm diameter) i brunnarna på 24-brunnsplattor (använda de speciella täckglas, som är skårade för användning med cellodlings infogningar).
- Coat i minst en timme med 15 mikrogram / ml Poly-DL-ornitin i vatten (cellkultur-kvalitet) vid 37 ° C. Använd åtminstone 500 mikroliter per brunn för att säkerställa atttäckglasen är helt täckta. Tvätta brunnarna två gånger med PBS. Låt PBS i brunnarna tills plätering cellerna. Se till att brunnarna inte torkar ut.
- Att dissekera hippocampi, förbereda 3x 10 cm rätter fyllda med förberedelse medelstora och 1x 2 ml rör med 1 ml beredning medium. Förbered sax och 2 fin pincett.
- Offra den gravida musen genom cervikal dislokation, sterilisera buken genom tvättning med 70% volym / volym etanol, och öppna buken med hjälp av vass sax. Skära ut pärlstav livmodern noga med sax och överföra orgeln i 1x 10 cm skål fylld med förberedelse medium.
- Ta sedan bort embryon från livmodern. Noggrant incisionsfilm livmodern och ta bort amnion utan att skada de embryon genom att använda 2 pincett. Därefter decapitate varje embryo med en sax och för över huvudena in i en andra 10 cm skål levereras med prepareringsmedium.
- Fortsätt med beredningen av huvudena (liknande FÖRBEREDELSEation som beskrivs i 1,4-1,7).
- Immobilisera huvudet med en pincett och incisionsfilm skallen och huden i nacken område nära bakhjäman, vinkelrätt mot neuraxis. Använd en andra pincett för att lyfta både skallen och täcker huden, och böja den mjuka kalott mot rostralt slutet av huvudet, och därmed utsätta hjärnan.
- Med hjälp av 2 pincett, lossa hjärnan från hjärnskålen. För att göra detta, nära en pincett och separera hjärnan från skallen med början på lukt glödlampor och rör sig mot bakhjäman. Samla hjärnor i ytterligare 10 cm skål fylld med förberedelse medium.
- Dissekera hippocampi från cortex molekyldelar, såsom beskrivits ovan för framställningen astrocyt (steg 1,6). Ta bort hippocampi från varje halvklotet och samla dem i 2 ml rör fyllt med förberedelse medium.
- Efter avslutad dissektion, överföra röret till den sterila laminärt flöde bänk och Digest hippocampus vävnad med en ml matsmältningen lösning innehållande papain. Förbered matsmältningen lösning som beskrivs i steg från 1,9 till 1,10, men använd MEM istället DMEM.
OBS: Steg 3,9-3,12 är kritisk och bör vara avslutad inom 10-15 minuter. - Efter fullbordan av matsmältningen, noggrant återkalla uppslutningslösningen genom försiktig sugning med en pipett.
- Tvätta hippocampi 3 gånger med neuron mediet genom att sekventiellt tillsätta och därefter noggrant aspirera 1 ml färskt odlingsmedium per tvätt. Centrifugera inte cellsuspensionen.
- Efter den sista tvättsteget, noggrant mal sönder vävnaden i 1 ml neuron medium.
- Räkna cellerna med användning av en räknekammare och plattan 35.000 celler i 500 mikroliter neuron medium per en enda brunn i en 24-brunnars-platta (plattan som nämns i 3,2).
OBS: Eventuellt kan en cell portionen motfärgades med trypanblått för att bedöma livskraften i cellpreparatet. Styra pläteringen densiteten genom visuell inspektionjon med hjälp av mikroskop (typiskt 90 - 110 celler per synfält av en standard 10X objektiv). - Place neuroner i inkubator vid 37 ° C, 6% v / v CO2 under 1 h.
- Posta inkubation, ta de preparerade insatserna (ympades med konfluenta astrocyternas monolager) ut ur inkubatorn (se steg 2,8). Byta mediet genom att aspirera astrocyternas mediet och ersätta det med 500 pl färsk neuron medium.
OBS: Insatserna bör hysa konfluenta astrocyternas monolager efter 2-3 DIV (dagar in vitro). - Placera skär med astrocyter försiktigt i brunnarna som innehåller neuron kulturer (steg 3,13) med hjälp av steril pincett.
- Placera den resulterande indirekt neuron-astrocyt samodling tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C, 6% v / v CO2.
OBS: Under dessa betingelser, kan neuroner odlas i upp till 4 veckor i fullständigt definierat medium. Inget medium förändring är nödvändig. För lång tid kulturer, är det rekommenderat att fylla empty brunnar med sterilt vatten för att minska avdunstningen från 24-brunnars-plattan. - Utför in vitro cell analyser efter önskad odlingsperioder (t.ex. för immuncytokemi, PCR, Western blot, elektrofysiologiska inspelningar (patch clamp eller multielektrodtyp array)) 7,15,18.
OBS: Kulturen Systemet är också lämpligt för akut och kronisk farmakologisk behandling av kulturerna 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen av de neuronala kulturer via indirekta samodlingen systemet är mångskiftande och kan utföras i olika skeden av kultur mognad. Beroende på det faktum att cellerna kan upprätthållas i upp till 4 veckor, långsiktiga undersökningar av kulturerna är möjliga.
Den schematiska i mitten vänstra panelen i figur 1 visar samodling installationen. Med hjälp av detta system kan göras levande cell imaging av båda celltyperna, som exemplifieras av bilder av astrocyternas monolager (överst till vänster) och neuronala nätverk (nedre vänstra panelen) faskontrast. Efter fixering, är immuncytokemiska bedömning möjlig, såsom visas i övre högra och nedre högra panelerna.
Neuroner börja etablera synaptiska förbindelser med start vid ungefär 7 DIV i vår modell (data ej visade). Senast den 14 DIV flera synapser bildas inom neuronala nätverk, som identifierats av den kombinerade immuncytokemiska upptäckt av pre-och postsynaptiska markörer (Figur 1, nedre högra panelen). Viktigt kan inte bara mängden synaptiska markör puncta visualiseras och kvantifieras med hjälp av denna metod, men också strukturellt färdig synapser, som är mest sannolikt att bidra till nätverksanslutning.
De astrocyternas kulturer inte bara ge trofiska stöd till neuroner 11, men även syntetisera flera utsöndrade faktorer 19,20 inblandade i neural plasticitet. Uttrycket av en av dessa faktorer, nämligen matrismetalloproteinas två (MMP2), visas i det övre högra panelen i figur 1. Intressant nog har 2 distinkta MMP2-isoformer upptäcks i samodlingen mediet med hjälp av Western Blot (Figur 1, mitt högra panelen ). Potentiellt astrocyter utsöndrar MMP2 till SHared medium, vilket påverkar plasticitet av neuroner. Även flera isoformer av tenascin-C, en känd regulator av Axon utväxt, cellmigration och differentiering 21 identifierades.
Sammantaget visar dessa resultat två exempel och därigenom ge proof of principle för olika undersökningar av astrocyter, nervceller och deras ömsesidiga kommunikation som kan realiseras genom att använda samodling metoden indirekt beskrivs häri.
. Figur 1: Indirekt astrocyternas-Neuron Coculture system möjliggör separat analys av Astrocyter, Neurons och utsöndras Molecular medlare Topplatta, vänster: astrocyterna bildar monolager på cellodlingsinsats membran, faskontrast; skala bar: 250 mikron Top panel, höger:. somtrocytes är immun för Glial Sura Fibrillärt protein (GFAP) (mus klon GA5) och matrismetalloproteas 2 (MMP2) (kanin polyklonala); skala bar. 250 mikron USA panel, vänster: systemet visar samodlingen installationen indirekt. Även om två kulturer är fysiskt åtskilda, de delar samma medium Mellanöstern panel, höger:. Två utsöndrade molekylära mediatorer av neuron-glia växelverkan avslöjas i sam-odlingsmediet med hjälp av Western Blot. . Flera isoformer av tenascin C (TNC), en neuritutväxt regulator, och MMP2, en extracellulärmatrix modifierings, dokumenteras Bottenplatta, vänster: primära nervceller utvecklas starkt sammankopplade nät genom den 14: e dagen av odling, faskontrast; . skala bar: 250 mikron Bottenplatta, höger: börjar med 14 d in vitro, är flera synaptiska förbindelser upprättas mellan nervceller, som detekteras genom immunocytokemisk märkning; skala bar: 50 mikron. Samlokaliseringen av presynaptiska markör fagott (kanin polyklonala) med postsynaptiska PSD95 byggnadsställningar protein (mus klon 6G6-1C9) dokumenterar strukturellt färdig synapser bildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Huvudsyftet med det nuvarande protokollet är helt separata neuronala och astrocytiska kulturer, samtidigt som dem i delat medium. Av denna anledning, bör verifieras renheten av odlingarna erhållna i början av förfarandet. Vi rekommenderar användning av neuron-specifik tubulin, neurofilament eller Neun protein som neuronala markörer, GFAP som astrocytisk markör, O4 antigen som oligodendrocyt föregångare markör och Iba1 protein för att identifiera mikroglia.
Ägna särskild uppmärksamhet när de utför ett kritiskt steg i protokollet, som specificerats en "NOTEs före steg beskrivning. Ta hänsyn till att de båda primära kulturer av nervceller och astrocyter är ganska känsliga. Därför kan flera problem uppstå i början av förfarandet. Om astrocyter inte når en sammanflytande monolager i T75-kolvar efter 10 DIV (protokollenheten 1), kontrollera komponenterna i astrocyternas medium (förfallodatum). Dessutom,öka mängden av kortikal vävnad beredda att initiera odlingen (upp till 10 cortex per kolv). Om astrocyter inte når en sammanflytande monolager på cellodlingsinsatser efter 72 h (protokollenheten 2), kontrollera komponenterna i astrocyternas mediet och PDL (för utgångsdatum) .Try till tallrik ut nylagade kulturer, bestämma andelen livskraftiga celler före plätering och justera cellantal i enlighet med (t.ex. använda trypanblått motfärgning). Om låg överlevnad av neuroner detekteras efter 24 timmar, var hippocampus vävnad inte revs försiktigt nog (protokoll steg 3,11) .Pay uppmärksamhet för att undvika bildandet av bubblor när dissociera vävnaden. Om överlevnaden av neuroner avsevärt sänkt efter 7-14 DIV och om nervceller bilda aggregat av 3 - 5 celler efter 7 DIV, använder nygjord skär med astrocyter, kontrollera astrocyternas renhet genom immuncytokemi, och kontrollera neuron mediumkomponenter. Om stora aggregat av nervceller (mer än 10 celler) visible, är det möjligt att hippocampus vävnad inte tillräckligt revs, vilket resulterar i ofullständig dissociation (protokoll steg 3,11). Var uppmärksam på upphängnings homogenitet. Om neuronal kultur är förorenat med icke-neuronala celler (mikroglia, astrocyter oligodendrocyt prekursorceller, etc), helt ta bort den angränsande kortikal vävnad intill hippocampus (steg 3,7) och även kontrollera neuron mediumkomponenter.
Den föreslagna indirekt samodling av primära neuroner och astrocyter tillhandahåller ett mångsidigt verktyg för att på lång sikt undersökning av neuron-glia växelverkan. Viktigare, är detta protokoll optimerad för musceller, som öppnar perspektiv för genomförandet av mus genetiska modeller. På grund av den fullständiga fysiska separationen av de 2 celltyper, kan neuroner och astrocyter av distinkta genotyper kombineras på önskat sätt.
Bland en mängd olika applikationer, kan användas för detta tillvägagångssätt för att investigate neurala nätverk utveckling, synaptogenesis, nätverksaktivitet och astrocyternas-neuron signalering. Även indirekt samodling av nervceller och astrocyter öppnar stora möjligheter för deras segregerade analys och långväga signalering, kan bristen på direktkontakt äventyra subtila reglering av synaptisk plasticitet 22. Således måste behandlas bristen på interaktion mellan astrocytiska utsprång och neuronala synapser noggrant vid användning av denna modell.
Analysen är baserad på två föregående protokollen för astrocyternas och neuronala preparat 14,17 och har förbättrats under de senaste åren. Tillvägagångssättet ursprungligen har fastställts för mus 7 och råtta 11 celler. Tidigare publikationer laboratoriet ger en detaljerad beskrivning av de analyser som rör cellöverlevnad, synaps bildning och elektrofysiologiska karakterisering av de resulterande cellerna 7,11,15,18. Vidare than analys kan anpassas till andra inställningar, till exempel mikroelektrod arrayer (MEA) 7. För framtida tillämpningar, bör läsaren överväga andra protokoll för detaljerad undersökning av synaps bildning 23, liksom för MEA analys in vitro. Sammanfattningsvis ger analysen ett mångsidigt verktyg för laboratorier som fokuserar på olika aspekter av neuron-Glia interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
