Summary
Denne protokollen beskriver indirekte nevron-astrocyte coculture for compartmentalized analyse av nevron-gliaceller interaksjoner.
Abstract
Riktig neuronal utvikling og funksjon er en forutsetning for utvikling og den voksne hjernen. Imidlertid er mekanismene bak svært kontrollert dannelse og vedlikehold av komplekse nevrale nettverk som ikke er fullstendig forstått så langt. De åpne spørsmål angående nevroner i helse og sykdom er mangfoldige og nå fra å forstå den grunnleggende utvikling for å undersøke menneskerelaterte sykdommer, for eksempel Alzheimers sykdom og schizofreni. Den mest detaljerte analyser av neuroner kan bli utført in vitro. Imidlertid er neuroner krevende celler og trenger ekstra støtte av astrocytter for deres langtidsoverlevelse. Denne mobil heterogenitet er i strid med det formål å dissekere analyse av nevroner og astrocytter. Vi presenterer her en cellekultur-analyse som gjør det mulig for den langsiktige cocultivation av rene primære neuroner og astrocytter, som deler de samme kjemisk definert medium, mens den er fysiskseparert. I dette oppsettet, kulturer overleve i opptil fire uker, og analysen er egnet for et mangfold av undersøkelser vedrørende nevron-gliaceller interaksjon.
Introduction
Gjennom de siste tiårene har den generelle tolkningen av gliacelle funksjon utviklet seg fra tildeling av en bare støttende mot et aktivt regulerende rolle om nevronale funksjon 1. På grunn av sin fremtredende innvirkning på hjernen homeostase i helse og sykdom 2, astrocytter er av spesiell interesse for det vitenskapelige samfunnet. I de siste årene, har et mangfold av studier fokusert på nevron-gliaceller interaksjoner in vivo og in vitro tre. Men de fleste av de kultursystemer ikke gir mulighet for separat analyse av begge celletyper og deres respektive secretomes.
Flere tilnærminger utnytte direkte cocultivation av nevroner og gliaceller å oppnå langvarig overlevelse og fysiologisk relevant nevronale nettverk utvikling 4-6. Denne protokoll når de samme målene, samtidig som begge celletypene fysisk adskilte 7. Sammenlignet med conditioned medium tilnærminger 8,9, systemet gjør det mulig å studere toveis kommunikasjon mellom nevroner og astrocytter. Ekspresjon av utskilt signalmolekyler kan overvåkes mens cellene maturate i den felles medium. Denne muligheten er spesielt relevant, da astrocytter frigjør oppløselige faktorer, slik som cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulære matriks-molekyler 10,11, for derved å regulere neuronal vekst og funksjon 7,12. Det har således blitt vist at tilsetningen av thrombospondin til gangliecelle in vitro induserer dannelsen av synapser 13. Men andre ennå ukjente faktorer er nødvendig for å gjengi synapser funksjonelle 13. Videre molekyler utgitt av astrocytter har til å bli identifisert for å forstå grunnlaget for neuron-gliaceller interaksjoner.
Dyrking av primære neuroner og astrocytter fra mus og rotte har blitt beskrevet tidligere 14-16. her er vipresentere en elegant og allsidig verktøy for å kombinere begge celletyper i en indirekte coculture tilnærming. Siden de to kulturene er fysisk adskilt, men deler den samme medium, virkningen av neuroner, astrocytter og oppløselige molekyler, kan hver for seg analysert, og dermed skape et kraftig verktøy for neuron-glia interaksjonsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene med mus var i samsvar med den tyske loven og den tyske foreningen for Neuroscience retningslinjer for dyrehold. De dyr omsorg og utnyttelse komiteer i Ruhr-Universität Bochum har gitt de nødvendige tillatelser.
1. Forberedelse og Dyrking av kortikal Astrocytter
Merk: Fullfør disse trinnene i protokollen minst 7 dager før du går videre til neste trinn, som astrocyttkulturer skal utvikle seg til konfluent monolag før nervecellene er forberedt. Primære astrocytter er hentet fra blandede gliaceller kulturer hentet fra museunger rundt postnatal dag (P) 0-3. Tre hjerne cortex (6) per T75-kolbe som skal benyttes.
- Klargjør astrocytt medium ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% volum / volum hesteserum og 0,1% volum / volum gentamycin under sterile betingelser. Oppbevar medium ved 4 ° C i opptil 2 uker.
- Coat 3x T75 krukker with 10 ug / ml poly-D-lysin (PDL, i cellekultur-grad vann) i minst 1 time ved 37 ° C i nærvær av 6% volum / volum CO 2. Etter belegging vaskes kolbene to ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS) for å fjerne ubundne kationer, og legge til 9 ml astrocytt medium.
- For fremstilling av hjernen, tilsett 10 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS) til 1 x 10 cm petriskål og 1 ml HBSS til 1 x 15 ml rør (uavhengig av antall hjerner som skal brukes). Hold et par av kirurgiske saks, 2 fine pinsett og en kikkert innen rekkevidde for prosedyren.
- Halshogge 3 valper raskt med de kirurgiske saks og samle hodene i en tom 10 cm tallerken.
- Utfør utarbeidelsen av cortices under kikkerten. Ved å bruke to fin pinsett, fjerner rygghuden fra skallen ved midtlinjen, fra halsen opp mot nivået av øynene. Deretter hjernen med sine blodkar er synlig under skallen.
- Fest hodet på rostral enden med en pinsett og langsgående snitt i midtlinjen av skallen, som starter på bakenden. Deretter klippet av høyre og venstre halvdeler av skallen for å avsløre hjernen.
- Lukk tuppen av tang og plasser den ventralt under hjernen. Løft hjernen ut av skallen og overføre den inn i HBSS fylt 10 cm petriskål. Fortsett på samme måte med de resterende prøven før alle hjerner er samlet i fatet.
- Etter å ha samlet hjernen, start med separasjon av de cortices ved å knipe av hindbrain ved hjelp av en pinsett som en saks. Utfør en midtlinjen snitt mellom de to halvkulene med en pinsett. fikse nøye hjernen med en tang og klippe av midthjernen og olfactory pærer bruke en annen pinsett til å ende opp med cortical halvdeler.
- Fest en kortikal halvdel med en pinsett og skrelle hjernehinnene fra de halvkuler ved å koble dem fROM den laterale kanten og deretter trekke dem fra kortikale overflaten med en andre tang.
- Vend cortical halvdel med overflateorientert ned mot fatet; nøye dissekere og fjerne halvmåneformede hippocampus ved hjelp av en pinsett. Overfør enkelt cortices inn den koniske 15 ml tube bruke ett lukkede pinsett til å gjennomføre et individuelt cortex.
- Etter å ha samlet alle cortices, transitt til sterile laminær hette og begynne med forberedelsene til dissosiasjon av kortikale vev.
- Tilsett 1 ml DMEM til en 2 ml reaksjonsrør og tilsett 0,1% vekt / volum papain (30 enheter). Inkuber suspensjon i et vannbad ved 37 ° C inntil en klaret oppløsning utvikles (ca. 3 minutter). Legg til 0,24 mg / mL L-cystein og 20 mikrogram / ml DNAse og riste forsiktig.
MERK: For fordøyelsen, er ca 1 ml enzymløsning nødvendig. - -Filter (0,22 um porestørrelse) for å oppnå 1 ml steril løsning før tilsetningdet til det kortikale vev. Inkuber rørene i 30 minutter - 1 time ved 37 ° C (det vil si i et vannbad).
MERK: Trinn 01.11 til 01.14 er kritisk og skal være fullført innen 15 min. - For å avslutte fordøyelsen reaksjon, tilsett 1 ml astrocyte medium og nøye triturer fordøyd vev ved hjelp av en 1 ml pipette. For finmaling, forsiktig flytte pipette stempelet, og dermed aspirere og ekstrudering kortikale vev suspensjon.
- Etter at vevet har blitt dissosiert til en enkelt cellesuspensjon, tilsett 5 ml astrocytt medium og sentrifuger i 5 minutter ved 216 x g.
- Aspirer supernatanten forsiktig fra den resulterende pellet og resuspender cellene i 1 ml astrocytt medium.
- Legg cellesuspensjoner til T75 kolber fylles med 9 ml astrocyte medium (se 1.2).
- Inkuber cellene ved 37 ° C i inkubator i nærvær av 6% volum / volum CO 2. Etter 4 d, utføre den første komplette medium endring (10 ml). Deretter endre kulturen medium hver 2-3 d.
- Etter 7 d, sjekk om cellene har dannet en konfluent monolag. Hvis ikke, må du vente i ytterligere 2 - 3 dager til fullstendig samløpet av kulturen er oppnådd.
MERK: Astrocytter vise store flate cellelegemene, lokalisere på bunnen av kolben, og utvikler ikke kjente cellulære prosesser. De skiller seg fra de små fase-kontrast lyse progenitorceller og mikroglia som befinner seg på toppen av monolaget 17. - For å kvitte seg med stamceller og få en ren astrocyte kultur, plasserer T75 kolber på en orbital shaker og rist kulturer O / N ved 250 rpm. Sikre at temperaturen reguleres til 37 ° C, og at filteret i kolben blir forseglet med laboratoriefilm for å forhindre fordamping av CO 2.
- Den neste dag, aspirere mediet og tilsett 10 ml friskt kulturmedium etterfylles med 20 uM cytosin-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) til eliminate restskille celler.
MERK: inkubasjon med AraC til 2 - 3 d i inkubator ved 37 ° C, 6% CO2 resulterer i en ren astrocytt kultur. - Overvåke renheten av astrocyttkulturer ved visuell inspeksjon under lysmikroskop. Hvis rest fase kontrast lys stamceller og microglia fortsatt ligge på toppen av astrocytic monolayer 17 (se trinn 1.16), gjenta trinn 1.18 og 1.19.
MERK: konfluent og rene astrocyttkulturer monolayers kan opprettholdes i inntil 14 d i inkubator (37 ° C, 6% v / v CO 2) før du går videre til neste trinn. Endre halvparten av mediet hver 3 d. Ikke samle inn, fryse og tine astrocytter, som disse cellene vil miste sine nevrale støttende egenskaper gjennom lagring prosedyre.
2. Å Astrocytter for Indirekte coculture
Merk: 48 - 72 timer før utarbeidelsen av nevroner, overføre astrocytter til cell-kultur inserts. Vanligvis leverer en enkelt T75 kolbe et tilstrekkelig antall celler for å understøtte de nevronale kulturer som ble oppnådd med en forberedelse.
- Plassere så mange innsatser som er nødvendig inn i 24-brønnplater. Coat hver innsats med 10 ug / ml PDL (oppløst i cellekultur-grad vann) i ca. 1 time ved 37 ° C, 6% volum / volum CO 2. Etter inkuberingen vaskes innsatsene to ganger med PBS. I mellomtiden fortsetter med utarbeidelse av astrocytter.
MERK: Innleggene fylt med PBS kan holdes inntil astrocyte cellesuspensjonen er klar til bruk. - Aspirer astrocytt medium (med AraC) og vaskes kulturen en gang med 10 ml PBS for å sikre at eventuelt gjenværende serum fjernes.
- Tilsett 3 ml med 0,05% trypsin-EDTA (Etylendiamintetraeddiksyre) til kolbene og inkuberes cellene i trypsinering ved 37 ° C, 6% volum / volum CO 2 i ca 10 min.
- Styr celle avløsning ved visuell inspeksjon ved hjelp av et mikroskop og facilitate avløsning av cellene ved å trykke på siden av flaskene mot skrivebordet.
MERK: Trinn 02.05 til 02.08 er kritisk og bør være ferdig i løpet av 15 - 20 min. - Etter den trypsinering, forsiktig resuspendere cellene i 7 ml astrocytt medium og overføre cellesuspensjonen i et 15 ml rør. Sentrifuger i 5 min ved 216 x g.
- aspirer supernatanten forsiktig og cellepelleten suspenderes i 1 ml astrocytt medium.
- Tell cellene ved hjelp av et tellekammer.
- Fylle bunnen av brønnene i 24-brønners-platen med 500 ul medium astrocytt og overføre 25.000 celler i 500 ul medium astrocytt inn i hver enkelt innsatsen. Inkuber kulturen ved 37 ° C, 6% volum / volum CO 2.
MERK: Etter 42-72 h kulturer vil nå ca 100% samløpet. På dette stadiet renheten av kulturen kan verifiseres ved immunocytochemistry 11. De løpende kulturer kan opprettholdes i inntil 7 dager før du går videre tilneste steg. Endre halvparten av mediet hver 3 d.
3. Utarbeidelse av primær hippocampus nevroner
Merk: Primær muse hippocampus nevroner bør være avledet fra E15.5 - E16 embryoer av tidsinnstilte gravide mus.
- Forbered neuron medium (MEM med 10 mM natrium-pyruvat, 0,1% w / v ovalbumin, 2% volum / volum B27 medium supplement, og 0,1% volum / volum gentamicin (sterilfiltrert)), og fremstillingen medium (HBSS med 0,6% w / v glukose og 10 mM HEPES (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazin etansulfonsyre)). Pre-varme og pre-likevekt neuron medium i filter kolber ved 37 ° C, 6% volum / volum CO 2.
- Plasser glassDekkGlass (12 mm diameter) inn i brønnene av 24-brønners-plater (bruke spesialDekkGlass, som er hakk for bruk med cellekultur inserts).
- Coat i minst 1 time med 15 mikrogram / ml poly-DL-Ornitin i vann (cellekultur-grade) ved 37 ° C. Bruk minst 500 mL per brønn for å sikre atDekkglass er helt dekket. Vask brønnene to ganger med PBS. La PBS i brønnene til plating av cellene. Sørg for at brønnene ikke tørker ut.
- For å dissekere hippocampi, forberede 3x 10 cm retter fylt med forberedelser medium og 1x 2 ml tube med 1 ml forberedelse medium. Forbered saks og 2 fine tang.
- Ofre gravid mus ved halshugging, sterilisere magen ved å vaske med 70% v / v etanol, og åpner buken hjelp skarp saks. Eksisere beaded livmoren nøye med saks og overføre organ i 1x 10 cm tallerken fylt med forberedelser medium.
- Deretter fjerner embryoene fra livmor. innsnittet livmoren nøye og fjern amnion uten å skade embryoene ved hjelp av 2 tang. Deretter halshogge hver embryo med en saks og overføre hodene inn i en ny 10 cm tallerken leveres med utarbeidelse medium.
- Fortsett med utarbeidelse av hodene (ligner på FORBEREDELSERasjon beskrevet i 1.4 til 1.7).
- Immobilisere hodet med en pinsett og innsnittet skallen og huden i halsområdet nær bakhjernen, vinkelrett på neuraxis. Bruke en andre pinsett til å løfte både skallen og dekker hud, og bøye den myke skallen hetten mot den rostrale ende av hodet, for derved å eksponere i hjernen.
- Med hjelp av 2 tang, løsner hjernen fra kraniet. For å gjøre dette, nær en pinsett og skille hjernen fra skallen starter på olfactory pærer og beveger seg mot hindbrain. Samle hjerner i en annen 10 cm tallerken fylt med forberedelser medium.
- Dissekere hippocampi fra cortex grupper som beskrevet ovenfor for fremstilling astrocytt (trinn 1.6). Fjern hippocampi fra hver halvkule og samle dem i 2 ml rør fylt med forberedelse medium.
- Etter endt disseksjon, overføre røret til den sterile laminær benk og Digest hippocampus vev med 1 ml fordøyelse løsning inneholdende papain. Klargjør fordøyelse løsning som beskrevet i trinn 1.9 til 1.10, men bruker i stedet MEM DMEM.
MERK: Trinn 03.09 til 03.12 er kritisk og skal være fullført innen 10 - 15 min. - Etter fullførelse av fordøyelse, trekk forsiktig fordøyelse oppløsning ved forsiktig suging med en pipette.
- Vask hippocampi 3 ganger med nervecellen medium ved sekvensielt å legge til og deretter forsiktig aspirere 1 ml friskt kulturmedium per vask. Ikke sentrifuger cellesuspensjonen.
- Etter den siste vasketrinnet, forsiktig triturer vevet i 1 ml medium neuron.
- Tell cellene ved hjelp av et tellekammer og plate 35.000 celler i 500 ul medium neuron per en enkelt brønn av en 24-brønns-plate (plate nevnt i punkt 3.2).
MERK: Hvis du vil, kan en celle delmengde være kontra med trypanblått å vurdere vitaliteten i cellepreparat. Styr plating tettheten ved visuell inspeksjonion ved hjelp av mikroskop (typisk 90 - 110 celler pr visuelle feltet på et standard 10X objektiv). - Plasser nevroner i inkubator ved 37 ° C, 6% volum / volum CO 2 i 1 time.
- Post inkubasjon, ta de preparerte inserts (sådd med konfluent astrocyttkulturer monolag) ut av inkubatoren (se trinn 2.8). Utveksle mediet ved å aspirere til astrocyte medium og erstatte den med 500 mL frisk neuron medium.
MERK: Innleggene skal havna konfluent astrocyttkulturer monolag etter 2-3 DIV (dager in vitro). - Plasser innsatsene med astrocytter nøye i brønnene som inneholder nervecellen kulturer (trinn 3.13) ved hjelp av steril pinsett.
- Plasser den resulterende indirekte neuron-astrocytt coculture tilbake i inkubatoren ved 37 ° C, 6% volum / volum CO 2.
MERK: Under disse betingelser kan nerveceller dyrkes i opptil 4 uker i fullstendig definert medium. Ingen medium endring er nødvendig. For lang tid kulturer, er det anbefalt å fylle empty brønner med sterilt vann for å redusere fordampningen fra den 24-brønns-plate. - Utfør in vitro celleanalyser etter ønsket kultur perioder (for eksempel for immunocytochemistry, PCR, Western blot, elektrofysiologiske opptak (patch clamp eller multielectrode array)) 7,15,18.
MERK: Kulturen Systemet er også egnet for akutt og kronisk farmakologisk behandling av kulturer 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen av de nevrale kulturer via den indirekte coculture systemet er mangfoldig og kan utføres på ulike stadier av kultur modning. På grunn av det faktum at cellene kan bli opprettholdt i opptil 4 uker, langvarige undersøkelser av kulturene er mulig.
Skjematisk i midten venstre panel i figur 1 viser cocultivation oppsett. Med bruk av dette systemet, kan levende celle avbildning av begge celletyper skal utføres, som eksemplifisert ved fasekontrast bilder av astrocyte monolaget (øverst til venstre panel) og nevronale nettverk (nederst til venstre panel). Etter fiksering, er immunocytokjemisk vurdering mulig, slik som vist i øvre høyre og nedre høyre panel.
Neurons begynne å etablere synaptiske forbindelser som starter ved omtrent 7 DIV i vår modell (data ikke vist). Ved 14 DIV multiple synapser blir dannet i løpet av nevrale nettverk, som er identifisert ved den kombinerte immuncytokjemisk påvisning av pre- og postsynaptiske markører (figur 1, panel nederst til høyre). Viktigere, kan ikke bare mengden av synaptiske markør puncta bli visualisert og kvantifisert ved hjelp av denne tilnærmingen, men også strukturelt fullført synapser, som er mest sannsynlig å bidra til nettverkstilkobling.
De astrocyttkulturer ikke bare gi trofisk støtte for å nevroner 11, men også syntetisere flere faktorer utskilt 19,20 som er involvert i nerve plastisitet. Ekspresjon av en av disse faktorer, nemlig matriks metalloproteinase 2 (MMP2), er demonstrert i panelet på figur 1 til høyre. Interessant nok ble 2 forskjellige MMP2-isoformer detektert i coculture medium ved hjelp av Western blot (Figur 1, panel midten til høyre ). Potensielt astrocytter utsondre MMP2 inn i shared medium, og dermed påvirke plastisitet av nerveceller. Også flere isoformer av tenascin-C, en kjent regulator av axon utvekst, cellemigrering og differensiering 21 ble identifisert.
Samlet utgjør disse resultatene viser to eksempler, og dermed fremlegge bevis for prinsippet for variasjonen av undersøkelser av astrocytter nevroner og deres gjensidige kommunikasjon som kan realiseres ved hjelp av indirekte cocultivation metoden beskrevet her.
. Figur 1: Indirekte astrocyte-Neuron coculture System Tillater Separat analyse av astrocytter nevroner og skilles Molekylære Meklere Top panel, venstre: de astrocytter skjemamonolagene på cellekulturinnsats membran, fasekontrast; skala bar: 250 mikrometer Top panel, akkurat. somtrocytes er immunostained for Glial Surt fibrillar Protein (GFAP) (mus klone GA5) og matriksmetalloprotease 2 (MMP2) (kanin polyklonale); skala bar. 250 my Middle panel, venstre: ordningen illustrerer indirekte coculture oppsett. Selv om to kulturer er fysisk atskilt, men de deler samme medium Midt panel, akkurat. To utskilte molekylære formidlere av nevroner-gliaceller interaksjoner er avslørt i samdyrkning medium ved hjelp av Western Blot. . Flere isoformer av tenascin C (TNC), en neurittutvekst regulator, og MMP2, en ekstracellulær matrix modifier, er dokumentert Bunnplate, venstre: primære nevroner utvikle svært sammenvevd nett av den 14. dagen i dyrking, fasekontrast; . skala bar: 250 mikrometer Bunnplate, høyre: starter med 14 d in vitro, er flere synaptiske forbindelser etablert mellom nevroner, som påvises ved immunocytokjemisk merking; Målestokk: 50 mikron. Samlokaliseringen av den presynaptiske markør Fagott (kanin polyklonale) med den postsynaptiske PSD95 stillas protein (mus klone 6G6-1C9) dokumenterer strukturelt fullført synapser formasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedmålet med den nåværende protokollen er å helt separate nevronale og astrocytic kulturer, og samtidig opprettholde dem i delt medium. Av denne grunn bør renheten av kulturene som oppnås verifiseres ved begynnelsen av prosedyren. Vi anbefaler bruk av neuron-spesifikke tubulin, nevrofilamenter eller Neun protein som nevrale markører, GFAP som astrocytic markør, O4 antigen som oligodendrocyte forløper markør og Iba1 protein for å identifisere microglia.
Vær spesielt oppmerksom når du utfører en kritisk trinn i protokollen, som angitt av en "NB" før trinn beskrivelse. Ta i betraktning at både primære kulturer av nevroner og astrocytter er ganske følsom. Derfor kan det oppstå flere problemer ved begynnelsen av prosedyren. Hvis astrocytter ikke når en konfluent monolag i T75 kolber etter 10 DIV (protokoll seksjon 1) Kontroller komponentene i astrocyte medium (for utløpsdato). I tillegg,øke mengden av kortikale vev fremstilt for å initiere kultur (opp til 10 kortekser per kolbe). Hvis astrocytter ikke når en konfluent monolag på cellekultur inserts etter 72 h (protokoll seksjon 2), sjekk komponentene i astrocyte medium og PDL (for utløpsdato) .Prøv å plate ut nylagde kulturer, bestemme hvor stor andel av levedyktige celler før plating og justere celle tall tilsvarende (f.eks bruke trypanblått kontra). Hvis lav overlevelse av neuroner blir detektert etter 24 timer ble hippocampus vev ikke gnidd forsiktig nok (protokoll trinn 3.11) .Pay oppmerksomhet for å unngå dannelse av bobler ved dissosiering av vevet. Hvis overlevelse av nevroner er betydelig redusert etter 7-14 DIV og hvis nevroner danner aggregater av 3 - 5 celler etter 7 DIV, bruker nylaget inserts med astrocytter, sjekk for astrocyte renhet ved immunocytokjemi, og kontroller neuron mellom komponenter. Hvis store aggregater av nerveceller (flere enn 10 celler) er visible, er det mulig at hippocampus vevet ikke var tilstrekkelig findelt, noe som resulterer i ufullstendig dissosiasjon (protokoll trinn 3.11). Vær oppmerksom på suspensjon homogenitet. Hvis neuronal kulturen er kontaminert med ikke-neuronale celler (mikroglia, astrocytter, oligodendrocytt forløperceller, etc.), fjerne nabo kortikale vev tilstøtende til hippocampus (trinn 3.7) og også kontrollere neuron mellom komponentene.
Den foreslåtte indirekte coculture av primære nevroner og astrocytter gir et allsidig verktøy for den langsiktige undersøkelse av nevron-gliaceller interaksjoner. Viktigere er denne protokollen optimalisert for museceller, som åpner perspektiv for gjennomføring av muse genetiske modeller. På grunn av den fullstendig fysisk separasjon av de 2 celletyper, kan neuroner og astrocytter av forskjellige genotyper kombineres på ønsket måte.
Blant en rekke applikasjoner, kan denne tilnærming brukes til å investigate utvikling nevrale nettverk, synaptogenesis, nettverksaktivitet og astrocyte-neuron signalering. Selv om indirekte cocultivation av nevroner og astrocytter åpner enorme muligheter for deres segregert analyse og langtrekkende signalering, kan mangelen på direkte kontakt kompromittere subtil regulering av synaptisk plastisitet 22. Dermed manglende interaksjon mellom astrocytic fremspring og nevrale synapser har å bli behandlet nøye ved bruk av denne modellen.
Analysen er basert på to tidligere protokoller for astrocyte og nevronale forberedelser 14,17 og har blitt forbedret i løpet av de siste årene. Tilnærmingen opprinnelig er etablert for mus 7 og rotte 11 celler. Tidligere publikasjoner i laboratoriet gi en detaljert karakterisering av de analyser vedrørende celleoverlevelse, synapse dannelse og elektrofysiologisk karakterisering av de resulterende celler 7,11,15,18. Videre, tHan analysen kan tilpasses andre innstillinger, for eksempel mikroelektrode-matriser (måle) 7. For fremtidige applikasjoner leseren bør vurdere andre protokoller for detaljert undersøkelse av synapse formasjon 23, så vel som for MEA analyse in vitro. Som konklusjon, gir analysen et allsidig verktøy for laboratorier med fokus på ulike aspekter av nevron-gliaceller interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
