Summary
Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.
Abstract
Proper neuronale ontwikkeling en de functie is een voorwaarde van de ontwikkelingslanden en de volwassen hersenen. De mechanismen waardoor sterk gecontroleerde vorming en instandhouding van complexe neuronale netwerken niet volledig tot nu toe begrepen. De onbeantwoorde vragen betreffende neuronen bij gezondheid en ziekte zijn divers en het bereiken van het begrijpen van de fundamentele ontwikkeling te onderzoeken menselijke pathologieën, bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer en schizofrenie. De gedetailleerde analyse van neuronen kan worden uitgevoerd in vitro. Echter, neuronen veeleisend cellen en moet de extra steun van astrocyten voor hun voortbestaan op lange termijn. Deze cellulaire heterogeniteit is in strijd met het doel om de analyse van neuronen en astrocyten ontleden. We presenteren hier een celkweek test die het mogelijk maakt voor de langdurige cocultivatie zuivere primaire neuronen en astrocyten, die dezelfde chemisch gedefinieerde medium doorgegeven, terwijl fysiekgescheiden. In deze opstelling, de kweken overleven tot vier weken en de bepaling is geschikt voor diverse onderzoeken inzake neuron-glia interactie.
Introduction
Gedurende de afgelopen decennia is de algemene interpretatie van neuroglia functie is ontstaan uit de toekenning van een louter ondersteunende naar een actieve regulerende rol met betrekking tot de neuronale functie 1. Vanwege hun prominente invloed op de hersenen homeostase in gezondheid en ziekte 2, astrocyten van bijzonder belang zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap. In de afgelopen jaren diverse studies zijn gericht op neuron-glia interacties in vivo en in vitro 3. De meeste van de kweeksystemen niet voorziet in afzonderlijke analyse van beide celtypen en hun secretomen.
Verschillende manieren gebruik maken van de directe cocultivatie van neuronen en glia om langdurige overleving en fysiologisch relevante neuronale ontwikkeling van het netwerk 4-6 te bereiken. Het huidige protocol dezelfde doelen bereikt, terwijl beide celtypen fysiek gescheiden 7. Vergeleken met conditioned medium benadert 8,9, ons systeem maakt het mogelijk om de bidirectionele communicatie tussen neuronen en astrocyten te bestuderen. De expressie van uitgescheiden signaalmoleculen kan worden bewaakt terwijl de cellen rijpen in het gedeelde medium. Deze mogelijkheid is bijzonder relevant, aangezien astrocyten oplosbare factoren, zoals cytokinen, groeifactoren en extracellulaire matrix moleculen 10,11 loslaat, waardoor neuronale groeiregulerende en functie 7,12. Zo is aangetoond dat de toevoeging van thrombospondine retinale ganglion cellen in vitro induceert de vorming van synapsen 13. Echter, andere nog onbekende factoren noodzakelijk synapsen functionele 13 maken. Bovendien moleculen vrijgegeven door astrocyten moeten worden geïdentificeerd met het oog op basis van neuron-glia interacties te begrijpen.
De teelt van primaire neuronen en astrocyten uit muizen en ratten is eerder 14-16 beschreven. Hier Wijpresenteren een elegante en veelzijdige tool om beide celtypen te combineren in een indirecte coculture aanpak. Aangezien de twee culturen fysiek gescheiden zijn maar hetzelfde medium, het effect van neuronen, astrocyten en oplosbare moleculen delen kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd, waardoor een krachtig hulpmiddel voor neuron-glia interactie studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten met muizen waren in overeenstemming met de Duitse wet en de Duitse Society for Neuroscience richtlijnen van de veehouderij. De verzorging van dieren en het gebruik commissies van de Ruhr-Universität Bochum hebben de nodige vergunningen verleend.
1. Voorbereiding en Teelt van corticale Astrocytes
Let op: Voer deze stappen van het protocol ten minste 7 dagen voordat u verder gaat met de volgende stappen, zoals de astrocyten culturen moet uitgroeien tot confluente monolagen voordat de neuronen worden bereid. Primaire astrocyten zijn afkomstig van gemengde gliale culturen verkregen uit muis pups ongeveer postnatale dag (P) 0-3. Drie hersenen (cortex 6) per T75 fles worden gebruikt.
- Bereid de astrocyt medium door toevoeging Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% v / v paardenserum en 0,1% v / v gentamycine onder steriele omstandigheden. Bewaar het bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
- Coat 3x T75 kolven with 10 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL, in celcultuur kwaliteit water) gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C in aanwezigheid van 6% v / v CO2. Na het bekleden was de kolven tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om ongebonden kationen te verwijderen en voeg 9 ml astrocyt medium.
- Voor de bereiding van de hersenen, voeg 10 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) tot 1x 10 cm Petrischaal en 1 ml HBSS tot 1x 15 ml buis (ongeacht het aantal hersenen die worden gebruikt). Houd een paar van chirurgische schaar, 2 fijn pincet en een verrekijker binnen handbereik voor de procedure.
- Onthoofden 3 pups snel met de chirurgische schaar en het verzamelen van de koppen in een lege 10 cm schotel.
- Voer de bereiding van de cortex onder de binoculaire. Met behulp van twee fijne tang, verwijder de dorsale huid van de schedel op de middellijn, vanaf de hals richting ooghoogte. Daarna de hersenen met bloedvaten zichtbaar onder de schedel.
- Bevestig de kop aan de rostrale einde met een pincet en de middellijn incisie van de schedel, vanaf het achterste einde. Vervolgens afknippen rechts en links helften van de schedel de hersenen bloot.
- Sluit het uiteinde van de tang en plaats deze ventraal onder de hersenen. Til de hersenen uit de schedel en over te dragen in de HBSS gevulde 10 cm petrischaal. Ga op dezelfde wijze met de resterende monster totdat alle hersenen worden verzameld in de schaal.
- Na het verzamelen van de hersenen, te beginnen met de scheiding van de cortex van de achterhersenen knijpen met een tang als een schaar. Voer een middellijn incisie tussen de twee hersenhelften met een pincet. Zorgvuldig vast de hersenen met een pincet en sneed de middenhersenen en de olfactorische bollen met behulp van een tweede tang om te eindigen met de corticale helften.
- Fix een corticale helft met een pincet en schil de hersenvliezen van de hemisferen door ze los from de zijrand en vervolgens te trekken van de corticale oppervlak met een tweede tang.
- Flip de corticale helft met zijn oppervlakte georiënteerd naar beneden naar het gerecht; zorgvuldig te ontleden en verwijder de halvemaanvormige hippocampus met behulp van een pincet. Breng de interne cortices in de conische 15 ml buis via een gesloten tang om een individuele cortex dragen.
- Na het verzamelen van alle cortex, doorvoer naar de steriele laminaire stroming kap en beginnen met de voorbereidingen voor de dissociatie van de corticale weefsel.
- Voeg 1 ml DMEM een 2 ml reageerbuis en voeg 0,1% w / v papaïne (30 eenheden). Incubeer de suspensie in een waterbad bij 37 ° C totdat een geklaarde oplossing optreedt (ongeveer 3 minuten). Voeg 0,24 mg / ml L-cysteïne en 20 ug / ml DNAse en schud voorzichtig.
Opmerking: Voor digestie wordt ongeveer 1 ml enzymoplossing nodig. - Filter (0,22 urn poriegrootte) met 1 ml steriele oplossing te verkrijgen voor het toevoegenaan de corticale weefsel. Incubeer de buizen gedurende 30 minuten - 1 uur bij 37 ° C (dat wil zeggen in een waterbad).
OPMERKING: Stappen 1,11-1,14 zijn kritisch en moet binnen 15 minuten worden voltooid. - Om de spijsvertering reactie te beëindigen, voeg 1 ml astrocyten middelgrote en zorgvuldig het verteerde weefsel vermaal met behulp van een 1 ml pipet. Voor aanwrijven, beweeg de pipet zuiger, waardoor opzuigen en het extruderen van de corticale weefsel schorsing.
- Zodra het weefsel werd gedissocieerd in een enkelvoudige celsuspensie, voeg 5 ml astrocyten medium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 216 x g.
- Zuig het supernatant voorzichtig uit de resulterende pellet en resuspendeer de cellen in 1 ml medium astrocyten.
- Voeg de celsuspensies om T75 kolven aangevuld met 9 ml astrocyten medium (zie 1.2).
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in de incubator bij aanwezigheid van 6% v / v CO2. Na 4 d, voert u de eerste complete medium change (10 mL). Daarna verandert het kweekmedium elke 2-3 d.
- Na 7 dagen, controleer dan of de cellen een confluente monolaag hebben gevormd. Zo niet, wacht nog 2-3 dagen tot volledige confluentie van de kweek wordt verkregen.
OPMERKING: Astrocytes tonen grote platte cellichamen, lokaliseren de bodem van de kolf en geen opmerkelijke cellulaire processen niet ontwikkelen. Ze verschillen van de kleine fasecontrast heldere progenitor cellen en microglia wonende bovenop de monolaag 17. - Om zich te ontdoen van de stamcellen te krijgen en het verkrijgen van een zuivere astrocyten cultuur, plaatst u de T75 kolven op een orbitale shaker en schud de culturen O / N bij 250 rpm. Dat de temperatuur wordt ingesteld op 37 ° C en dat het filter van de kolf wordt afgesloten met laboratorium film om verdamping van de CO 2 voorkomen.
- De volgende dag, zuig het medium en voeg 10 ml vers kweekmedium aangevuld met 20 uM cytosine-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) naar Eliminate resterende delende cellen.
OPMERKING: incubatie met AraC 2 - 3 d in de incubator bij 37 ° C, 6% CO2 tot een zuivere astrocyten cultuur. - Controleer de zuiverheid van de astrocyt culturen door visuele inspectie onder de lichtmicroscoop. Als resterende fase-contrast heldere voorlopercellen cellen en microglia nog steeds op de top van de astrocytaire monolaag 17 verblijven (zie stap 1.16), herhaalt u stap 1.18 en 1.19.
OPMERKING: De confluente monolagen en zuivere astrocyten kan worden gehandhaafd gedurende maximaal 14 d in de incubator (37 ° C, 6% v / v 2 CO) alvorens naar de volgende stap. Verander de helft van het medium elke 3 d. Niet verzamelen, te bevriezen en ontdooien van de astrocyten, omdat deze cellen hun neuronale ondersteunende eigenschappen zullen verliezen door de opslag procedure.
2. Voorbereiden Astrocytes voor de indirecte Coculture
Let op: 48-72 uur voor de voorbereiding van de neuronen, de overdracht astrocyten naar de cell-cultuur inserts. In het algemeen, een T75 kolf levert een voldoende aantal cellen om de neuronale kweken verkregen met een preparaat ondersteunen.
- Plaats zoveel inserts als nodig is in 24-well-platen. Coat elke insert met 10 ug / ml PDL (opgelost in celcultuur kwaliteit water) gedurende 1 uur bij 37 ° C, 6% v / v CO2. Na de incubatie was de inzetstukken tweemaal met PBS. In de tussentijd gaan met de voorbereiding van de astrocyten.
OPMERKING: De inzetstukken gevuld met PBS kan worden gehouden totdat de astrocyt celsuspensie klaar voor gebruik. - Zuig het medium astrocyt (met AraC) en was de kweek eenmaal met 10 ml PBS te zorgen alle resterende serum wordt verwijderd.
- Voeg 3 ml 0,05% trypsine-EDTA (Ethyleendeniaminetetraacetaat) aan de kolven en incubeer de cellen voor behandeling met trypsine bij 37 ° C, 6% v / v CO2 gedurende ongeveer 10 minuten.
- Controle van de cel detachement door visuele inspectie met behulp van een microscoop en FacilitaTÉ het losmaken van de cellen aan de kant van de kolven tegen de desktop te tikken.
OPMERKING: Stappen 2,5-2,8 zijn van cruciaal belang en moet worden voltooid binnen 15 - 20 min. - Na de behandeling met trypsine, zacht resuspendeer de cellen in 7 ml astrocyten medium en breng de celsuspensie aan een 15 ml buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 216 x g.
- Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 ml astrocyten medium.
- Tel de cellen met behulp van een telkamer.
- Vul de bodem van de putjes van de 24-well-plaat met 500 pl medium en astrocyten overdragen 25.000 cellen in 500 ul medium astrocyten in elk afzonderlijk inzetstuk. Incubeer de kweek bij 37 ° C, 6% v / v CO2.
NB: Na 42-72 uur zal de kweken ongeveer 100% samenvloeiing bereiken. In deze fase de zuiverheid van de kweek kan worden geverifieerd door immunocytochemie 11. De samenvloeiende culturen kan worden gehandhaafd tot 7 d totdat wordt overgegaan tot devolgende stap. Verander de helft van het medium elke 3 d.
3. Voorbereiding van de primaire hippocampus neuronen
Opmerking: Primaire muis hippocampale neuronen moeten worden afgeleid uit E15.5 - E16 embryo's van getimede zwangere muizen.
- Bereid neuron medium (MEM met 10 mM natriumpyruvaat, 0,1% w / v ovalbumine,% v 2 / v B27 mediumsupplement en 0,1% v / v gentamicine (steriel gefiltreerd)) en bereiding medium (HBSS met 0,6% w / v glucose en 10 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine- ethaansulfonzuur)). Voorverwarmen en pre-equilibreren het neuron medium filtreerkolven bij 37 ° C, 6% v / v CO2.
- Plaats de glazen dekglaasjes (12 mm diameter) in de putjes van 24-well-platen (de speciale dekglaasjes die zijn gekerfd voor gebruik met celkweek inserts).
- Coat minimaal 1 uur met 15 ug / ml Poly-DL-Ornithine in water (celcultuur kwaliteit) bij 37 ° C. Gebruik minimaal 500 ul per putje opdatde dekglaasjes worden volledig bedekt. Was de putjes tweemaal met PBS. Laat de PBS in de putjes totdat beplating van de cellen. Zorg ervoor dat de putten niet uitdrogen.
- Om de hippocampus ontleden, bereiden 3x 10 cm schalen gevuld met de voorbereiding op middellange en 1x 2 ml buis met 1 ml voorbereiding medium. Bereid schaar en 2 fijne tang.
- Offer de zwangere muis door cervicale dislocatie, steriliseren de buik door wassen met 70% v / v ethanol, en opent de buik met behulp van een scherpe schaar. Accijnzen de kralen baarmoeder voorzichtig met een schaar en breng het orgel in 1x 10 cm schotel gevuld met voorbereiding medium.
- Verwijder vervolgens de embryo's uit de baarmoeder. incise voorzichtig de baarmoeder en verwijder de amnion zonder nadelige gevolgen voor de embryo's met behulp van 2 tang. Daarna onthoofden elk embryo met een schaar en breng de koppen in een tweede 10 cm schaal met voorbereiding medium toegevoerd.
- Tot opstelling van de koppen (vergelijkbaar met de preparatie beschreven in 1,4-1,7).
- Immobiliseren het hoofd met een pincet en incise de schedel en de huid in de nek regio dicht bij de hindbrain, loodrecht op de neuraxis. Gebruik een tweede pincet om zowel de schedel en die de huid op te heffen, en buig de zachte schedel dop in de richting van de rostrale einde van het hoofd, waardoor de hersenen bloot.
- Met de hulp van 2 pincet, los van de hersenen van de schedelholte. Om dit te dicht 1 pincet te doen en scheiden de hersenen uit de schedel te beginnen bij de olfactorische bollen en op weg naar de achterhersenen. Verzamel de hersenen in een andere 10 cm schotel gevuld met voorbereiding medium.
- Ontleden de hippocampus van de cortex groepen zoals hierboven beschreven voor de bereiding astrocyten (stap 1,6). Verwijder de hippocampus van elk halfrond en verzamel ze in de 2 ml buis gevuld met voorbereiding medium.
- Na het voltooien van de dissectie, overdracht van de buis naar de steriele laminaire stroming bankje en Digest de hippocampus weefsel met 1 ml verteringsoplossing met papaïne. Bereid de digestie als beschreven in stap 1,9-1,10, maar gebruiken in plaats daarvan MEM DMEM.
OPMERKING: Stappen 3,9-3,12 zijn kritisch en moet binnen 10 worden afgerond - 15 min. - Na voltooiing van de spijsvertering, nauwkeurig de vertering oplossing door voorzichtig afzuigen met een pipet trekken.
- Was de hippocampus 3 maal met neuron medium door het achtereenvolgens toevoegen en daarna zorgvuldig opzuigen 1 ml vers kweekmedium per wasbeurt. Niet centrifuge de celsuspensie.
- Na de laatste wasstap, voorzichtig vermaal het weefsel in 1 ml medium neuron.
- Tel de cellen met behulp van een telkamer en de plaat 35.000 cellen in 500 ul neuron medium per één putje van een 24-well-plaat (de in 3.2 genoemde plaat).
OPMERKING: Eventueel kan een cel aliquot worden tegengekleurd met trypan blauw aan de vitaliteit van het celpreparaat beoordelen. Controle van de plating dichtheid visueel inspecterenion met de microscoop (typisch 90-110 cellen per gezichtsveld van een standaard 10X objectief). - Plaats neuronen in de incubator bij 37 ° C, 6% v / v CO2 gedurende 1 uur.
- Plaats incubatie, neem de geprepareerde inzetstukken (ingezaaid met samenvloeiende astrocyten monolagen) uit de incubator (zie stap 2.8). Wisselen het medium door afzuigen de astrocyten medium en te vervangen door 500 ul vers medium neuron.
LET OP: De inserts moeten samenvloeiende astrocyten monolagen haven na 2-3 DIV (dagen in vitro). - Plaats de wisselplaten met astrocyten voorzichtig in de putten die de neuron culturen (stap 3.13) met behulp van een steriel pincet bevatten.
- Plaats de resulterende indirecte neuron astrocyten gemengde cultuurmedium terug in de incubator bij 37 ° C, 6% v / v CO2.
NB: Onder deze omstandigheden, kan neuronen worden gekweekt voor maximaal 4 weken in een volledig gedefinieerd medium. Geen medium verandering is noodzakelijk. Voor de lange termijn culturen, is het raadzaam om e vullenmpty putjes met steriel water om de verdamping van de 24-well plaat verminderen. - Voer in vitro cel analyseert na gewenste cultuur periodes (bijvoorbeeld voor immunocytochemie, PCR, Western Blot, elektrofysiologische opnames (patch clamp of multielectrode array)) 7,15,18.
OPMERKING: Het teeltsysteem is ook geschikt voor acute en chronische farmacologische behandeling van de kweken 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De analyse van de neuronale cultures via de indirecte gemengde cultuursysteem is veelsoortige en kan worden uitgevoerd in verschillende stadia van rijping cultuur. Vanwege het feit dat de cellen kunnen worden gehandhaafd gedurende maximaal 4 weken, langdurige onderzoek van de kweken mogelijk.
Het schema in het midden linkerkant van Figuur 1 toont de cocultivatie setup. Met het gebruik van dit systeem kunnen live cell imaging van beide celtypen worden uitgevoerd, zoals bijvoorbeeld fasecontrast beelden van de astrocyten monolaag (linker paneel) en het neuronale netwerk (paneel linksonder). Na fixatie immunocytochemische beoordeling mogelijk, zie rechtsboven en rechtsonder panelen.
Neuronen beginnen synaptische verbindingen tot stand vanaf ongeveer 7 DIV in ons model (gegevens niet getoond). Door 14 DIV meervoudige synapsen worden gevormd binnen neuronale netwerken, zoals aangegeven door de gecombineerde immunocytochemische detectie van pre-en postsynaptische markers (figuur 1, rechtsonder paneel). Belangrijk is, kan niet alleen de hoeveelheid van synaptische marker puncta worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van deze aanpak, maar ook de structureel voltooid synapsen, die de grootste kans om bij te dragen aan netwerk connectiviteit zijn.
De astrocyten culturen bieden niet alleen trofische ondersteuning aan neuronen 11, maar ook synthetiseren verschillende uitgescheiden factoren 19,20 betrokken bij neurale plasticiteit. De expressie van één van deze factoren, namelijk matrix metalloproteinase 2 (MMP2), blijkt uit het rechter paneel van figuur 1. Interessant is dat 2 verschillende MMP2-isovormen gedetecteerd in het gemengde cultuurmedium met behulp van Western blot (Figuur 1, midden rechterpaneel ). Potentieel astrocyten scheiden MMP2 in de sHared medium, ten gevolge waarvan de plasticiteit van neuronen. Ook meerdere isovormen van Tenascin-C, een bekende regulator van axon uitgroei, celmigratie en differentiatie 21 werden geïdentificeerd.
Samengenomen tonen deze resultaten aan beide voorbeelden en daardoor bewijs van het principe voor de verschillende onderzoeken astrocyten, neuronen en hun onderlinge communicatie te realiseren met de cocultivatie indirecte hierin beschreven.
. Figuur 1: De Indirect Astrocyte-Neuron Coculture systeem maakt het mogelijk voor afzonderlijke analyse van Astrocytes, Neuronen en afgescheiden Molecular Mediators Top paneel, links: de astrocyten formulier monolagen op de celkweek insert membraan, fase contrast; schaal bar: 250 micron Top paneel, rechts:. alstrocytes zijn immunostained voor Glial Zure Fibrillar Protein (GFAP) (muis kloon GA5) en matrixmetalloprotease 2 (MMP2) (konijn polyklonaal); schaal bar:. 250 micron Midden-paneel, links: de regeling illustreert de indirecte coculture setup. Hoewel de twee culturen fysiek gescheiden zijn, ze delen hetzelfde medium Midden-paneel, rechts:. Twee afgescheiden moleculaire mediatoren van neuron-glia interacties worden onthuld in de co-kweekmedium met behulp van Western Blot. . Meerdere isovormen van Tenascin C (TNC), een neurietuitgroei regulator, en MMP2, een extracellulaire matrix modifier, zijn gedocumenteerd Bodempaneel, links: primaire neuronen ontwikkelen sterk met elkaar verbonden netwerken door de 14 e dag van de teelt, fase contrast; . schaal bar: 250 micron Bodempaneel, rechts: te beginnen met 14 d in vitro, worden meerdere synaptische verbindingen gelegd tussen neuronen, zoals gedetecteerd door immunocytochemische labeling; schaal bar: 50 micron. De co-lokalisatie van het presynaptische marker Fagot (konijn polyklonaal) met de postsynaptische PSD95 steigers eiwit (muis kloon 6G6-1C9) documenteert de structureel voltooid synapsen formatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste doel van het huidige protocol is het volledig gescheiden neuronale en astrocytaire culturen, terwijl het handhaven ervan in gedeeld medium. Daarom moet de zuiverheid van de kweken verkregen wordt gecontroleerd bij het begin van de procedure. Wij raden het gebruik van neuron-specifieke tubuline, neurofilaments of Neun eiwit als neuronale markers, GFAP als astrocytaire marker, O4 antigeen oligodendrocyt precursor marker en Iba1 eiwit microglia te identificeren.
Besteed speciale aandacht bij het uitvoeren van een cruciale stap van het protocol, zoals gespecificeerd door een 'NB' voordat de stap beschrijving. Er rekening mee dat zowel de primaire culturen van neuronen en astrocyten zijn nogal gevoelig. Daarom kunnen verschillende problemen aan het begin van de procedure ontstaan. Als de astrocyten niet een confluente monolaag in T75 kolven te bereiken na 10 DIV (protocol deel 1), controleer de componenten van de astrocyten medium (voor vervaldatum). Daarnaast,grotere hoeveelheid hersenweefsel bereid de cultuur (maximaal 10 cortex per kolf) te leiden. Als de astrocyten niet een confluente monolaag op celkweek inserts te bereiken na 72 uur (protocol paragraaf 2), controleer de componenten van de astrocyten medium en PDL (voor vervaldatum) .proberen aan de plaat uit vers bereide culturen, bepalen het aandeel van levensvatbare cellen voorafgaand aan de beplating en mobiele nummers dienovereenkomstig aan te passen (bijvoorbeeld gebruiken trypan blauwe tegenkleuring). Als lage overleving van neuronen gedetecteerd na 24 uur werd hippocampus weefsel niet voorzichtig genoeg getritureerd (protocol stap 3,11) .Pay aandacht voor de vorming van luchtbellen te vermijden wanneer dissociëren het weefsel. Als de overleving van neuronen aanzienlijk wordt verlaagd na 7-14 DIV en als neuronen vormen aggregaten van 3-5 cellen na 7 DIV, gebruik van vers bereide wisselplaten met astrocyten, controleren op astrocyten zuiverheid door middel van immunocytochemie, en controleer de neuron medium componenten. Als grote aggregaten van neuronen (meer dan 10 cellen) zijn visible, is het mogelijk dat de hippocampus weefsel onvoldoende werd getritureerd, wat resulteert in onvolledige dissociatie (protocol stap 3.11). Besteed aandacht aan schorsing homogeniteit. Als neuronale kweek verontreinigd met niet-neuronale cellen (microglia, astrocyten, oligodendrocyt precursor cellen, etc.), de aangrenzende corticale weefsel grenzend aan de hippocampus (stap 3,7) volledig te verwijderen en controleer ook neuron mediumcomponenten.
De voorgestelde indirecte co-kweek van primaire neuronen en astrocyten verschaft een veelzijdig gereedschap voor het lange termijn onderzoek neuron-glia interacties. Belangrijk is dat dit protocol geoptimaliseerd voor muizencellen, welk perspectief opent voor de uitvoering van de muis genetische modellen. Door de volledige fysische scheiding van de 2 celtypes kunnen neuronen en astrocyten van verschillende genotypes worden gecombineerd in de gewenste manier.
Uit een verscheidenheid aan toepassingen, kan deze benadering worden gebruikt om investigate neurale netwerken ontwikkeling, synaptogenesis, netwerkactiviteit en astrocyten-neuron signalering. Hoewel de indirecte cocultivatie van neuronen en astrocyten opent enorme mogelijkheden voor hun gescheiden analyse en lange afstand signalering, kan het gebrek aan direct contact de subtiele regulatie van synaptische plasticiteit 22 in gevaar brengen. Dus het gebrek aan interactie tussen uitsteeksels astrocytische en neuronale synapsen moet worden zorgvuldig behandeld bij gebruik van dit model.
De assay is gebaseerd op twee eerdere protocols voor astrocyten en neuronale preparaten 14,17 en is verbeterd in de loop van de afgelopen jaren. De aanpak die oorspronkelijk is opgericht voor de muis 7 en ratten 11 cellen. Vorige publicaties van het laboratorium een gedetailleerde karakterisering van de testen met betrekking tot overleving van de cel, de vorming van synapsen en elektrofysiologische karakterisering van de resulterende cellen 7,11,15,18. Verder tHij test kan worden aangepast aan andere instellingen, zoals de micro-elektrode-arrays (MEA) 7. Voor toekomstige toepassingen wordt de lezer overwegen andere protocollen voor gedetailleerd onderzoek van synapsvorming 23, alsmede voor MEA analyse in vitro. Kortom, de assay verschaft een veelzijdig gereedschap voor laboratoria van de verschillende aspecten van neuron-glia interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
