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Neuroscience

अप्रत्यक्ष न्यूरॉन astrocyte coculture परख: एक Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54757
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell Morphology and Molecular Neurobiology, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University

Summary

इस प्रोटोकॉल न्यूरॉन glia बातचीत की बंटे विश्लेषण के लिए अप्रत्यक्ष न्यूरॉन astrocyte coculture वर्णन करता है।

Abstract

उचित न्यूरोनल विकास और समारोह के विकास और वयस्क मस्तिष्क की शर्त है। हालांकि, तंत्र अत्यधिक नियंत्रित गठन और जटिल neuronal नेटवर्क के रखरखाव के अंतर्निहित पूरी तरह से इस प्रकार अब तक समझ नहीं रहे हैं। स्वास्थ्य और रोग में न्यूरॉन्स के विषय में खुला प्रश्न विविध और मानव संबंधित विकृतियों, जैसे, अल्जाइमर रोग और मानसिक असंतुलन की जांच करने के लिए बुनियादी विकास को समझने से पहुंच रहे हैं। न्यूरॉन्स की सबसे विस्तृत विश्लेषण के लिए इन विट्रो में किया जा सकता है। हालांकि, न्यूरॉन्स कोशिकाओं की मांग और उनके लंबे समय तक जीवित रहने के लिए astrocytes की अतिरिक्त सहायता की जरूरत है। इस सेलुलर विविधता उद्देश्य न्यूरॉन्स और astrocytes के विश्लेषण के टुकड़े करना के साथ संघर्ष में है। हम यहाँ है कि शुद्ध प्राथमिक न्यूरॉन्स और astrocytes, जो शेयर एक ही रासायनिक परिभाषित मध्यम से लंबी अवधि के लिए अनुमति देता है cocultivation एक सेल संस्कृति परख मौजूद है, जबकि शारीरिक रूप से किया जा रहा हैअलग कर दिया। इस सेटअप में, संस्कृतियों अप करने के लिए चार सप्ताह के लिए जीवित है और परख न्यूरॉन glia बातचीत के विषय में जांच की विविधता के लिए उपयुक्त है।

Introduction

पिछले दशकों के दौरान, neuroglia समारोह के सामान्य व्याख्या न्यूरोनल समारोह 1 के विषय में एक सक्रिय नियामक भूमिका की दिशा में एक मात्र सहायक के रोपण से विकसित किया गया है। स्वास्थ्य और रोग में मस्तिष्क 2 homeostasis पर उनके प्रमुख प्रभाव के कारण, astrocytes वैज्ञानिक समुदाय के लिए विशेष रुचि के हैं। पिछले कुछ वर्षों में, अध्ययन की एक विविधता vivo में इन विट्रो 3 में न्यूरॉन glia बातचीत पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, संस्कृति सिस्टम की सबसे दोनों प्रकार की कोशिकाओं के अलग-अलग विश्लेषण के लिए और उनके संबंधित secretomes की अनुमति नहीं है।

कई दृष्टिकोण न्यूरॉन्स और glia के प्रत्यक्ष cocultivation का फायदा उठाने के लंबे समय तक चलने अस्तित्व और physiologically प्रासंगिक न्यूरोनल नेटवर्क के विकास 4-6 प्राप्त करने के लिए। वर्तमान प्रोटोकॉल एक ही लक्ष्य है, जबकि दोनों प्रकार की कोशिकाओं के शारीरिक रूप से अलग रखते हुए 7 तक पहुँचता है। conditione की तुलनाडी मध्यम 8,9 दृष्टिकोण, हमारी प्रणाली न्यूरॉन्स और astrocytes के बीच द्विदिश संचार अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। जबकि कोशिकाओं साझा माध्यम में उन्नति करना स्रावित संकेतन अणुओं की अभिव्यक्ति पर नजर रखी जा सकती है। इस अवसर विशेष रूप से प्रासंगिक के रूप में इस तरह के astrocytes साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है और बाह्य मैट्रिक्स अणुओं 10,11 के रूप में घुलनशील कारकों जारी है, जिससे न्यूरोनल विकास को विनियमित करने और 7,12 समारोह है,। इस प्रकार, यह दिखा दिया है कि इन विट्रो में रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को thrombospondin के अलावा synapses 13 के गठन लाती गया है। हालांकि, अन्य अभी तक अज्ञात कारणों कार्यात्मक 13 synapses प्रस्तुत करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, astrocytes द्वारा जारी आदेश के अणुओं न्यूरॉन glia बातचीत के आधार को समझने के लिए पहचान की जानी है।

माउस और चूहे से प्राथमिक न्यूरॉन्स और astrocytes की खेती पहले 14-16 वर्णित किया गया है। यहाँ हमएक अप्रत्यक्ष coculture दृष्टिकोण में दोनों प्रकार की कोशिकाओं गठबंधन करने के लिए एक सुंदर और बहुमुखी उपकरण प्रस्तुत करते हैं। चूंकि दो संस्कृतियों शारीरिक रूप से अभी तक एक ही माध्यम है, न्यूरॉन्स, astrocytes और घुलनशील अणुओं के प्रभाव को साझा करने के अलग हो रहे हैं, अलग से विश्लेषण किया जा सकता है, इस प्रकार न्यूरॉन glia बातचीत के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाने।

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Protocol

चूहों के साथ पशुपालन के तंत्रिका विज्ञान के दिशा-निर्देशों के लिए जर्मन कानून और जर्मन सोसायटी के अनुसार थे। रूहर विश्वविद्यालय Bochum के जानवरों की देखभाल और उपयोग समितियों उपयुक्त परमिट दे दी है।

1. तैयारी और cortical astrocytes की खेती

नोट: प्रोटोकॉल कम से कम 7 डी के इन चरणों को पूरा अगले कदम के लिए आगे बढ़ने, न्यूरॉन्स तैयार कर रहे हैं के रूप में पहले astrocyte संस्कृतियों मिला हुआ monolayers में विकसित करना चाहिए पहले। प्राथमिक astrocytes मिश्रित glial प्रसव के बाद दिन (पी) 0-3 के आसपास माउस पिल्ले से प्राप्त संस्कृतियों से निकाली गई है। तीन दिमाग (6 cortices) T75 फ्लास्क प्रति इस्तेमाल हो रहे हैं।

  1. 10% वी / वी घोड़े सीरम और 0.1% v / बाँझ शर्तों के तहत वी gentamycin साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) सप्लीमेंट द्वारा astrocyte मध्यम तैयार। 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर।
  2. कोट 3x T75 वाई बोतलवें 10 माइक्रोग्राम / एमएल पाली-डी lysine (पीडीएल, सेल संस्कृति ग्रेड पानी में) कम से कम 1 से 6% वी / वी सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटे के लिए। कोटिंग के बाद, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार बोतल धोने अपार फैटायनों हटाने, और 9 एमएल astrocyte मध्यम जोड़ने के लिए।
  3. दिमाग की तैयारी के लिए, जोड़ने के 10 एमएल हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) 10 सेमी पेट्री डिश और 1 एमएल HBSS 1x करने के लिए 1x करने के लिए 15 एमएल ट्यूब (चाहे कि इस्तेमाल किया जाएगा दिमाग की संख्या की)। शल्य कैंची, 2 ठीक संदंश की एक जोड़ी और प्रक्रिया के लिए पहुंच के भीतर एक दूरबीन रखें।
  4. शल्य कैंची के साथ जल्दी से 3 पिल्ले सिर काटना और एक खाली 10 सेमी डिश में सिर इकट्ठा।
    1. दूरबीन के तहत cortices की तैयारी को पूरा करें। दो ठीक संदंश का प्रयोग, midline पर खोपड़ी से पृष्ठीय त्वचा को हटाने, आँखों के स्तर की ओर गर्दन से शुरू। इसके बाद, अपने रक्त वाहिकाओं के साथ मस्तिष्क खोपड़ी के तहत दिख रहा है।
    2. संदंश की एक जोड़ी के साथ व्याख्यान चबूतरे अंत में सिर फिक्स और खोपड़ी के midline काटकर अलग कर देना, पीछे अंत में शुरू। बाद में, सही और खोपड़ी के लिए छोड़ दिया आधा मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए बंद क्लिप।
    3. संदंश की नोक बंद करो और मस्तिष्क के तहत पेट के बल यह स्थिति। खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क लिफ्ट और यह HBSS से भरे 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित। शेष नमूना के साथ एक ही तरीके से आगे बढ़ें जब तक सभी दिमाग डिश में एकत्र कर रहे हैं।
  5. दिमाग इकट्ठा करने के बाद, hindbrain कैंची की एक जोड़ी की तरह संदंश की एक जोड़ी का उपयोग बंद pinching द्वारा cortices की जुदाई के साथ शुरू करते हैं। संदंश की एक जोड़ी के साथ दो गोलार्द्धों के बीच एक midline चीरा प्रदर्शन करना। ध्यान से एक संदंश के साथ मस्तिष्क को ठीक करने और मध्यमस्तिष्क काट दिया और एक दूसरे संदंश का उपयोग घ्राण बल्ब cortical हिस्सों के साथ खत्म करने के लिए।
  6. संदंश की एक जोड़ी के साथ एक cortical आधा ठीक करने और उन्हें च निकाल कर गोलार्द्धों से तानिका छीलपार्श्व किनारे ROM और बाद में एक दूसरे संदंश का उपयोग cortical सतह से उन्हें खींच रहा है।
  7. इसकी सतह पकवान की ओर उन्मुख नीचे के साथ cortical आधा फ्लिप; ध्यान से काटना और संदंश की एक जोड़ी का उपयोग चंद्राकार हिप्पोकैम्पस को हटा दें। एक बंद संदंश का उपयोग कर एक व्यक्ति कोर्टेक्स ले जाने के लिए शंक्वाकार 15 मिलीलीटर ट्यूब में एकल cortices स्थानांतरण।
  8. बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के लिए सभी cortices, पारगमन का संग्रह है और cortical ऊतक की हदबंदी के लिए तैयारी के साथ शुरू करने के बाद।
  9. एक 2 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 1 एमएल DMEM जोड़ें और 0.1% w / v papain (30 इकाइयों) को जोड़ने। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में निलंबन सेते हैं जब तक एक स्पष्ट किया समाधान विकसित करता है (लगभग 3 मिनट)। 0.24 मिलीग्राम / एमएल एल सिस्टीन और 20 माइक्रोग्राम / एमएल DNase जोड़ें और धीरे हिला।
    नोट: पाचन के लिए, एंजाइम समाधान के लगभग 1 एमएल की जरूरत है।
  10. फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार) जोड़ने से पहले 1 मिलीलीटर बाँझ समाधान प्राप्त करने के लिएयह cortical ऊतक करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे (यानी, एक पानी के स्नान में) - 30 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं।
    नोट: कदम 1.11 - 1.14 आलोचना कर रहे हैं और 15 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
  11. पाचन प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, 1 एमएल astrocyte मध्यम जोड़ने और ध्यान से एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग कर पचा ऊतक triturate। विचूर्णन के लिए, धीरे पिपेट सवार ले जाते हैं, जिससे श्वास और cortical ऊतक निलंबन extruding।
  12. एक बार ऊतक एक एकल कोशिका निलंबन में अलग कर दिया गया है, पर 216 x जी 5 मिनट के लिए 5 एमएल astrocyte मध्यम और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  13. जिसके परिणामस्वरूप गोली से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1 एमएल astrocyte माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
  14. 9 एमएल astrocyte मध्यम (1.2 देखें) के साथ मंगाया T75 बोतल करने के लिए सेल निलंबन जोड़ें।
  15. 6% वी / वी सीओ 2 की उपस्थिति में इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। बाद 4 डी, पहले पूरा मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन (10 एमएल)। 3 डी - इसके बाद, संस्कृति के माध्यम से हर 2 बदल जाते हैं।
  16. बाद 7 डी, अगर जांच कोशिकाओं को एक मिला हुआ monolayer का गठन किया है। जब तक संस्कृति की पूरी संगम उपलब्ध हो जाता है - 3 दिन यदि नहीं, तो एक और 2 के लिए प्रतीक्षा करें।
    नोट: Astrocytes बड़े चपटा सेल शरीर का प्रदर्शन, फ्लास्क के तल पर स्थानीय बनाना और उल्लेखनीय सेलुलर प्रक्रियाओं को विकसित नहीं है। वे छोटे चरण विपरीत उज्ज्वल पूर्वज कोशिकाओं और microglia monolayer 17 के शीर्ष पर रहने से भिन्न होते हैं।
  17. आदेश में पूर्वज कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए और एक शुद्ध astrocyte संस्कृति प्राप्त है, एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर T75 बोतल जगह है और 250 rpm पर संस्कृतियों हे / एन हिला। सुनिश्चित करें कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए और कहा कि कुप्पी के फिल्टर सीओ 2 के वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के साथ बंद है निकाला जाता है।
  18. अगले दिन, elimina के लिए मध्यम aspirate और 20 माइक्रोन के साइटोसिन-1-β-डी arabinofuranoside (Arac) के साथ मंगाया 10 एमएल ताजा संस्कृति के माध्यम जोड़ेंते अवशिष्ट कोशिकाओं को विभाजित।
    नोट: के लिए 2 Arac साथ ऊष्मायन - 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 3 डी, 6% सीओ 2 के एक शुद्ध astrocyte संस्कृति में परिणाम होगा।
  19. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य निरीक्षण द्वारा astrocyte संस्कृतियों की शुद्धता की निगरानी। अवशिष्ट चरण विपरीत उज्ज्वल पूर्वज कोशिकाओं और microglia अभी भी astrocytic monolayer 17 के शीर्ष पर रहते हैं (कदम 1.16 देखें), दोहराने कदम 1.18 और 1.19।
    नोट: मिला हुआ है और शुद्ध astrocyte monolayers अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले के लिए इनक्यूबेटर में अप करने के लिए 14 डी (37 डिग्री सेल्सियस, 6% वी / वी सीओ 2) को बनाए रखा जा सकता है। मध्यम के आधे बदले हर 3 डी। इकट्ठा मत करो, फ्रीज और astrocytes पिघलना, के रूप में इन कोशिकाओं भंडारण प्रक्रिया के माध्यम से अपने न्यूरोनल सहायक गुण खो देंगे।

2. अप्रत्यक्ष coculture के लिए तैयारी Astrocytes

नोट: 48 - 72 ज सेल न्यूरॉन्स, स्थानांतरण astrocytes तैयार करने से पहलेएल संस्कृति सम्मिलित करता है। आम तौर पर, एक भी T75 कुप्पी एक तैयारी के साथ प्राप्त neuronal संस्कृतियों का समर्थन करने के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में बचाता है।

  1. के रूप में कई सम्मिलित रूप में 24 अच्छी तरह-प्लेटों में जरूरत रखें। कोट 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 घंटे के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल पीडीएल (सेल संस्कृति ग्रेड पानी में भंग) के साथ प्रत्येक डालने, 6% वी / वी सीओ 2। ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ दो बार सम्मिलित धो लें। इस बीच में, astrocytes की तैयारी के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: जब तक astrocyte सेल निलंबन इस्तेमाल के लिए तैयार है पीबीएस के साथ भरा सम्मिलित रखा जा सकता है।
  2. astrocyte मध्यम (Arac के साथ) Aspirate और यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी अवशिष्ट सीरम निकाल दिया जाता है 10 एमएल पीबीएस के साथ संस्कृति एक बार धो लें।
  3. बोतल के लिए 0.05% trypsin EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड) के 3 मिलीलीटर जोड़ें और लगभग 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 6% वी / वी सीओ 2 में trypsinization के लिए कोशिकाओं सेते हैं।
  4. दृश्य निरीक्षण द्वारा सेल टुकड़ी एक माइक्रोस्कोप और facilita का उपयोग को नियंत्रितडेस्कटॉप के खिलाफ बोतल के पक्ष में दोहन से कोशिकाओं की टुकड़ी ते।
    नोट: 2.5 कदम - 2.8 आलोचना कर रहे हैं और 15 के भीतर समाप्त किया जाना चाहिए - 20 मिनट।
  5. trypsinization के बाद, धीरे 7 एमएल astrocyte माध्यम से कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण। पर 216 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और 1 एमएल astrocyte मध्यम में सेल गोली resuspend।
  7. एक मतगणना कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  8. 500 μL astrocyte मध्यम के साथ 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं के नीचे भरें और प्रत्येक व्यक्ति डालने में 500 μL astrocyte माध्यम में 25,000 कोशिकाओं को हस्तांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस, 6% वी / वी सीओ 2 संस्कृति सेते हैं।
    नोट: के बाद 42 - 72 ज संस्कृतियों लगभग 100% संगम तक पहुंच जाएगा। इस स्तर पर संस्कृति की पवित्रता 11 immunocytochemistry द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। मिला हुआ संस्कृतियों के लिए आगे बढ़ने के लिए जब तक अप करने के लिए 7 डी बनाए रखा जा सकताअगला कदम। मध्यम के आधे बदले हर 3 डी।

3. प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की तैयारी

नोट: प्राथमिक माउस hippocampal न्यूरॉन्स E15.5 से प्राप्त किया जाना चाहिए - समय पर गर्भवती चूहों के E16 भ्रूण।

  1. 0.6% w / साथ न्यूरॉन मध्यम (10 मिमी सोडियम पाइरूवेट के साथ सदस्य, 0.1% w / v ovalbumin, 2% वी / वी B27 मध्यम पूरक, और 0.1% वी / वी जेंटामाइसिन (बाँझ फ़िल्टर)), और तैयारी मध्यम (HBSS तैयार वी ग्लूकोज और 10mm HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic एसिड))। पूर्व गर्म और पूर्व संतुलित 37 डिग्री सेल्सियस, 6% वी / वी सीओ 2 फिल्टर बोतल में न्यूरॉन माध्यम।
  2. कांच coverslips (12 मिमी व्यास) 24 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में जगह (विशेष coverslips, जो सेल संस्कृति आवेषण के साथ उपयोग के लिए कर रहे हैं नोकदार उपयोग करें)।
    1. कम से कम 1 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी (सेल संस्कृति ग्रेड) में 15 माइक्रोग्राम / एमएल पाली-डीएल-ओर्निथिन के साथ घंटे के लिए कोट। यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से प्रति कम से कम 500 μL का प्रयोग करेंcoverslips पूरी तरह से कवर कर रहे हैं। कुओं पीबीएस के साथ दो बार धोएं। चढ़ाना कोशिकाओं तक कुओं में पीबीएस छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि कुओं बाहर सूखी नहीं है।
  3. hippocampi काटना करने के लिए, 3x 10 सेमी व्यंजन तैयार करने के मध्यम से भरा है और 1 एमएल तैयारी माध्यम के साथ 1x 2 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करते हैं। कैंची और 2 ठीक संदंश तैयार करें।
  4. , गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से गर्भवती माउस बलिदान 70% वी / वी इथेनॉल के साथ धोने से पेट जीवाणुरहित, और तेज कैंची का उपयोग पेट खुला। कैंची के साथ सावधानी से मनके गर्भाशय आबकारी एवं 1x 10 सेमी तैयारी मध्यम से भरा डिश में अंग हस्तांतरण।
  5. अगले, गर्भाशय से भ्रूण को हटा दें। ध्यान से गर्भाशय काटकर अलग कर देना और 2 संदंश का उपयोग करके भ्रूण को नुकसान पहुँचाने के बिना भ्रूणावरण को हटा दें। इसके बाद, कैंची की एक जोड़ी के साथ प्रत्येक भ्रूण सिर काटना और एक दूसरे 10 सेमी तैयारी मध्यम के साथ आपूर्ति की डिश में सिर हस्तांतरण।
  6. सिर की तैयारी (prepar के समान के साथ आगे बढ़ें1.7) - समझना 1.4 में वर्णित है।
    1. संदंश की एक जोड़ी के साथ सिर स्थिर और खोपड़ी और गर्दन के क्षेत्र में त्वचा hindbrain के करीब है, neuraxis को सीधा काटकर अलग कर देना। दोनों खोपड़ी और कवर त्वचा उठा, और सिर के व्याख्यान चबूतरे अंत में मुलायम खोपड़ी टोपी मोड़ है, जिससे मस्तिष्क को उजागर करने के लिए संदंश की एक दूसरी जोड़ी का प्रयोग करें।
    2. 2 संदंश की मदद से, कपाल गुहा से मस्तिष्क अलग। इस संदंश की, करीब 1 जोड़ी करते हैं और खोपड़ी घ्राण बल्ब पर शुरू और पश्च मस्तिष्क की ओर बढ़ने से मस्तिष्क को अलग करने के लिए। एक और 10 सेमी तैयारी मध्यम से भरा पकवान में दिमाग लीजिए।
  7. के रूप में astrocyte तैयारी (1.6 चरण) के लिए ऊपर वर्णित कोर्टेक्स moieties से hippocampi काटना। प्रत्येक गोलार्द्ध से hippocampi निकालें और उन्हें तैयारी के मध्यम से भरा 2 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा।
  8. विच्छेदन पूरा करने के बाद, बाँझ लामिना का प्रवाह बेंच और diges करने के लिए ट्यूब का स्थानांतरण1 एमएल पाचन समाधान papain युक्त साथ हिप्पोकैम्पस ऊतक टी। कदम 1.9 में वर्णित के रूप में पाचन समाधान तैयार - 1.10, लेकिन सदस्य बजाय का उपयोग DMEM।
    नोट: 3.9 कदम - 3.12 आलोचना कर रहे हैं और 10 के भीतर पूरा किया जाना चाहिए - 15 मिनट।
  9. पाचन के पूरा होने के बाद, ध्यान से एक विंदुक के साथ कोमल चूषण द्वारा पाचन समाधान वापस ले लें।
  10. क्रमिक रूप से जोड़ने और उसके बाद सावधानी से धोने चक्र के अनुसार 1 एमएल ताजा संस्कृति के माध्यम से श्वास hippocampi धो न्यूरॉन माध्यम के साथ 3 बार। सेल निलंबन अपकेंद्रित्र मत करो।
  11. अंतिम चरण धोने के बाद, ध्यान से 1 एमएल न्यूरॉन माध्यम में ऊतक triturate।
  12. एक मतगणना कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना और एक 24 अच्छी तरह से थाली (प्लेट 3.2 में उल्लेख किया है) की एक भी अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μL न्यूरॉन माध्यम में 35,000 कोशिकाओं थाली।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक सेल विभाज्य सेल तैयार की जीवन शक्ति का आकलन करने के trypan नीले रंग के साथ counterstained जा सकता है। नियंत्रण रखें दृश्य का निरीक्षण करके चढ़ाना घनत्व(- एक मानक 10X उद्देश्य के दृश्य क्षेत्र में प्रति 110 कोशिकाओं को आमतौर पर 90) आयन माइक्रोस्कोप का उपयोग।
  13. 37 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 6% वी / वी सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें न्यूरॉन्स।
  14. पोस्ट ऊष्मायन, तैयार सम्मिलित लेने के लिए इनक्यूबेटर से बाहर (मिला हुआ astrocyte monolayers के साथ वरीयता प्राप्त) (2.8 कदम देखें)। astrocyte मध्यम aspirating और 500 μl ताजा न्यूरॉन मध्यम के साथ जगह से मध्यम विनिमय।
    नोट: आवेषण के बाद 2 मिला हुआ astrocyte monolayers बंदरगाह चाहिए - 3 DIV (इन विट्रो में दिन)।
  15. astrocytes के साथ सम्मिलित ध्यान से कुओं कि न्यूरॉन संस्कृतियों (3.13 कदम) बाँझ संदंश का उपयोग रोकने में रखें।
  16. जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्यक्ष न्यूरॉन astrocyte coculture इनक्यूबेटर में वापस 37 डिग्री सेल्सियस, 6% वी / वी सीओ 2 में रखें।
    नोट: इन शर्तों के तहत, न्यूरॉन्स पूरी तरह से परिभाषित माध्यम में 4 सप्ताह के लिए खेती की जा सकती है। कोई मध्यम परिवर्तन आवश्यक है। लंबे समय संस्कृतियों के लिए, यह ई भरने के लिए सिफारिश की हैआदेश में 24 अच्छी तरह से थाली से वाष्पीकरण को कम करने में बाँझ पानी के साथ mpty कुओं।
  17. प्रदर्शन में इन विट्रो सेल विश्लेषण के बाद संस्कृति अवधि वांछित (जैसे, immunocytochemistry, पीसीआर, पश्चिमी धब्बा, electrophysiological रिकॉर्डिंग (पैच दबाना या multielectrode सरणी) के लिए) 7,15,18।
    ध्यान दें: संस्कृति प्रणाली भी संस्कृतियों 11 की तीव्र और जीर्ण औषधीय उपचार के लिए उपयुक्त है।

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Representative Results

अप्रत्यक्ष coculture प्रणाली के माध्यम से neuronal संस्कृतियों के विश्लेषण के विविध है और संस्कृति परिपक्वता के विभिन्न चरणों में किया जा सकता है। तथ्य यह है कि कोशिकाओं के लिए 4 हफ्तों के लिए रखा जा सकता है के कारण, संस्कृतियों के लंबे समय तक जांच संभव हो रहे हैं।

चित्रा 1 के बीच बाएं पैनल में योजनाबद्ध cocultivation सेटअप को दर्शाता है। इस प्रणाली के उपयोग के साथ, दोनों प्रकार की कोशिकाओं का जीना सेल इमेजिंग, किया जा सकता है के रूप में astrocyte monolayer (ऊपर बाएं पैनल) और neuronal नेटवर्क (बाएं नीचे पैनल) के चरण विपरीत चित्रों के द्वारा उदाहरण। निर्धारण के बाद, immunocytochemical मूल्यांकन के रूप में शीर्ष सही और नीचे सही पैनल में दिखाया गया है, संभव है।

न्यूरॉन्स हमारे मॉडल में कम से लगभग 7 DIV शुरू synaptic कनेक्शन स्थापित करने के लिए शुरू (डेटा) नहीं दिखाया। 14 D सेचतुर्थ कई synapses के रूप में पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी मार्कर (चित्रा 1, नीचे सही पैनल) के संयुक्त immunocytochemical पता लगाने के द्वारा पहचान, neuronal नेटवर्क के भीतर का गठन कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, न केवल synaptic मार्कर puncta की राशि से कल्पना की जा सकती है और इस दृष्टिकोण का उपयोग मात्रा, लेकिन यह भी संरचनात्मक रूप synapses है, जो सबसे कनेक्टिविटी नेटवर्क के लिए योगदान करने की संभावना है पूरा किया।

Astrocyte संस्कृतियों न केवल 11 न्यूरॉन्स के लिए पौष्टिकता समर्थन प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी कई कारकों स्रावित 19,20 न्यूरल प्लास्टिसिटी में शामिल synthesize। इन कारकों, अर्थात् मैट्रिक्स metalloproteinase 2 (MMP2) में से एक की अभिव्यक्ति, चित्रा 1 के शीर्ष सही पैनल में प्रदर्शन किया है। दिलचस्प बात यह 2 अलग-MMP2 isoforms वेस्टर्न ब्लाट (चित्रा 1, मध्य सही पैनल का उपयोग कर coculture माध्यम में पाया गया )। संभावित astrocytes रों में MMP2 छिपानाhared माध्यम है, इस प्रकार न्यूरॉन्स के plasticity प्रभावित। इसके अलावा Tenascin-सी, अक्षतंतु परिणाम, सेल प्रवास और भेदभाव 21 के नाम से जाना जाता नियामक के कई isoforms पहचान की गई।

साथ में ले ली, इन परिणामों दो उदाहरण का प्रदर्शन और इस तरह astrocytes, न्यूरॉन्स और उनके पारस्परिक संचार कि अप्रत्यक्ष cocultivation साथ साथ वर्णित विधि का उपयोग कर महसूस किया जा सकता की जांच के लिए विभिन्न प्रकार के सिद्धांत का सबूत प्रदान करते हैं।

आकृति 1
। चित्रा 1: अप्रत्यक्ष astrocyte न्यूरॉन coculture प्रणाली Astrocytes, न्यूरॉन्स और स्रावित आण्विक मध्यस्थों के अलग विश्लेषण के लिए अनुमति देता है शीर्ष पैनल, छोड़ दिया: सेल संस्कृति डालने झिल्ली, चरण विपरीत पर astrocytes प्रपत्र monolayers; पैमाने पर पट्टी: 250 माइक्रोन शीर्ष पैनल, सही:। के रूप मेंtrocytes Glial अम्लीय तंतुमय प्रोटीन (GFAP) (माउस क्लोन GA5) और मैट्रिक्स Metalloprotease 2 (MMP2) (खरगोश पॉलीक्लोनल) के लिए immunostained कर रहे हैं; पैमाने पर पट्टी:। 250 माइक्रोन मध्यम पैनल, छोड़ दिया: इस योजना को दिखाता अप्रत्यक्ष coculture सेटअप। हालांकि दो संस्कृतियों शारीरिक रूप से अलग हो रहे हैं, वे एक ही माध्यम हिस्सा मध्यम पैनल, सही:। न्यूरॉन glia बातचीत के दो secreted आणविक मध्यस्थों वेस्टर्न ब्लाट का उपयोग कर सह खेती मध्यम में पता चला रहे हैं। । Tenascin सी (टीएनसी), एक neurite परिणाम नियामक, और MMP2, एक बाह्य मैट्रिक्स संशोधक, दस्तावेज हैं नीचे पैनल, के एकाधिक isoforms छोड़ दिया: प्राथमिक न्यूरॉन्स अत्यधिक खेती, चरण विपरीत के 14 वें दिन से जुड़े विकास नेटवर्क; । पैमाने पर पट्टी: 250 माइक्रोन नीचे पैनल, सही: के साथ इन विट्रो में 14 घ शुरू, कई synaptic कनेक्शन, न्यूरॉन्स के बीच स्थापित कर रहे हैं के रूप में immunocytochemical लेबलिंग से पता लगाया; पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन। पोस्टअन्तर्ग्रथनी PSD95 मचान प्रोटीन (माउस क्लोन 6G6-1C9) के साथ presynaptic मार्कर Bassoon (खरगोश पॉलीक्लोनल) के सह स्थानीयकरण संरचनात्मक रूप से पूरा synapses गठन दस्तावेजों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जबकि उन्हें साझा माध्यम में बनाए रखने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य है, पूरी तरह से अलग neuronal और astrocytic संस्कृतियों के लिए है। इस कारण से, प्राप्त संस्कृतियों की पवित्रता प्रक्रिया की शुरुआत में सत्यापित किया जाना चाहिए। हम न्यूरोनल मार्कर के रूप में न्यूरॉन विशिष्ट tubulin, neurofilaments या NeuN प्रोटीन के इस्तेमाल की सिफारिश, GFAP astrocytic मार्कर के रूप में, oligodendrocyte अग्रदूत मार्कर और Iba1 प्रोटीन के रूप में O4 प्रतिजन microglia की पहचान।

विशेष ध्यान के साथ प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शन, के रूप में पहले कदम के विवरण एक 'नोट' द्वारा निर्दिष्ट। विचार यह है कि न्यूरॉन्स और astrocytes के दोनों प्राथमिक संस्कृतियों नहीं बल्कि संवेदनशील होते हैं में ले लो। इसलिए, कई समस्याओं प्रक्रिया की शुरुआत में पैदा हो सकता है। astrocytes 10 DIV (प्रोटोकॉल अनुभाग 1) के बाद T75 बोतल में मिला हुआ monolayer तक पहुँच नहीं है, तो astrocyte मध्यम (समाप्ति की तारीख के लिए) के घटकों की जाँच करें। इसके साथ - साथ,(अप कुप्पी प्रति 10 cortices के लिए) संस्कृति आरंभ करने के लिए तैयार cortical ऊतक की मात्रा में वृद्धि। astrocytes 72 एच (प्रोटोकॉल धारा 2) के बाद सेल संस्कृति सम्मिलित करता है पर एक मिला हुआ monolayer तक पहुँच नहीं है, तो astrocyte मध्यम और पीडीएल (समाप्ति की तारीख के लिए) .Try के घटकों की जांच हौसले से तैयार संस्कृतियों बाहर थाली करने के लिए, व्यवहार्य के अनुपात का निर्धारण कोशिकाओं से पहले चढ़ाना और तदनुसार सेल नंबर समायोजित करने के लिए (जैसे, trypan नीले counterstaining उपयोग करें)। न्यूरॉन्स की कम अस्तित्व के 24 घंटे के बाद पता चला है, हिप्पोकैम्पस ऊतक धीरे पर्याप्त triturated नहीं किया गया था (प्रोटोकॉल कदम 3.11) जब ऊतक अलग बुलबुले के गठन से बचने के लिए .Pay ध्यान। न्यूरॉन्स के अस्तित्व के काफी बाद 7 उतारा है तो - 14 DIV और अगर न्यूरॉन्स 3 का समुच्चय के रूप में - 7 DIV के बाद 5 कोशिकाओं, हौसले astrocytes के साथ सम्मिलित तैयार उपयोग, immunocytochemistry द्वारा astrocyte शुद्धता के लिए जाँच करें, और न्यूरॉन मध्यम घटकों की जाँच करें। न्यूरॉन्स (10 से अधिक कोशिकाओं) का बड़ा समुच्चय वी कर रहे हैंisible, यह संभव है कि हिप्पोकैम्पस ऊतक पर्याप्त triturated नहीं किया गया था अधूरा हदबंदी (प्रोटोकॉल कदम 3.11) में जिसके परिणामस्वरूप। निलंबन एकरूपता पर ध्यान दे। न्यूरोनल संस्कृति गैर neuronal कोशिकाओं (microglia, astrocytes, oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं, आदि) के साथ दूषित है, तो पूरी तरह से पड़ोसी cortical ऊतक हिप्पोकैम्पस से सटे (3.7 चरण) को हटाने और भी न्यूरॉन मध्यम घटकों की जाँच करें।

प्राथमिक न्यूरॉन्स और astrocytes के प्रस्तावित अप्रत्यक्ष coculture न्यूरॉन glia बातचीत के लिए लंबी अवधि की जांच के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रोटोकॉल माउस कोशिकाओं, माउस आनुवंशिक मॉडल के कार्यान्वयन के लिए परिप्रेक्ष्य खोलता है जिसके लिए अनुकूलित है। 2 प्रकार की कोशिकाओं की पूरी शारीरिक जुदाई की वजह से, न्यूरॉन्स और अलग जीनोटाइप के astrocytes वांछित तरह से जोड़ा जा सकता है।

आवेदनों की एक किस्म के अलावा, इस दृष्टिकोण निवेश संबंधी निर्णय निर्माताओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकतातंत्रिका नेटवर्क के विकास, synaptogenesis नेटवर्क गतिविधि और astrocyte न्यूरॉन सिगनल estigate। हालांकि न्यूरॉन्स और astrocytes के अप्रत्यक्ष cocultivation उनकी अलग-अलग विश्लेषण और लंबी दूरी के संकेत के लिए विशाल अवसरों को खोलता है, सीधे संपर्क की कमी synaptic plasticity 22 के सूक्ष्म विनियमन समझौता हो सकता है। इस प्रकार, astrocytic उभार और neuronal synapses के बीच बातचीत की कमी को ध्यान से जब इस मॉडल का उपयोग कर इलाज किया जा चुका है।

परख astrocyte और neuronal तैयारियों 14,17 के लिए पिछले दो प्रोटोकॉल पर आधारित है और पिछले कुछ वर्षों के पाठ्यक्रम में सुधार किया गया है। दृष्टिकोण मूल माउस 7 के लिए की स्थापना की और 11 कोशिकाओं चूहे कर दिया गया है। प्रयोगशाला के पिछले प्रकाशनों सेल अस्तित्व, synapse गठन और जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं 7,11,15,18 के electrophysiological लक्षण वर्णन के विषय में assays की एक विस्तृत लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, टीवह परख ऐसे सूक्ष्म इलेक्ट्रोड-सरणियों (MEAS) 7 के रूप में अन्य सेटिंग्स, अनुकूलित किया जा सकता। भविष्य अनुप्रयोगों के लिए, पाठक के रूप में अच्छी तरह से synapse गठन 23 की विस्तृत जांच के लिए अन्य प्रोटोकॉल पर विचार करना चाहिए, इन विट्रो में विदेश मंत्रालय के विश्लेषण के लिए। अंत में, परख न्यूरॉन glia बातचीत के विभिन्न पहलुओं पर ध्यान केंद्रित कर प्रयोगशालाओं के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
B27 Gibco (Life Technologies) 17504-044
Cell-culture-grade water MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768 CAUTION: H317, H361
DMEM Gibco (Life Technologies)  41966-029
DNAse Worthington LS002007
Gentamycin Sigma-Aldrich G1397 CAUTION: H317-334
Glucose Serva 22700
HBSS Gibco (Life Technologies) 14170-088
HEPES Gibco (Life Technologies) 15630-056
Horse serum Biochrom AG S9135
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-2529
MEM Gibco (Life Technologies) 31095-029
Ovalbumin Sigma-Aldrich A7641 CAUTION: H334
Papain Worthington 3126
PBS self-made
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P3655
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Trypsin-EDTA Gibco (Life Technologies) 25300054
Equipment
24-well-plates Thermoscientific/Nunc 142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture) BD Falcon 353504
Binocular Leica MZ6
Cell-culture inserts BD Falcon 353095
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Counting Chamber Marienfeld 650010
Forceps FST Dumont (#5) 11254-20
glass cover slips (12 mm) Carl Roth (Menzel- Gläser) P231.1
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i
Micro-tube (2 mL) Sarstedt 72,691
Microscope Leica DMIL
Millex Syringe-driven filter unit Millipore SLGV013SL
Orbital shaker New Brunswick Scientific Innova 4000
Parafilm Bemis PM-996
Petri dishes (10 cm) Sarstedt 833,902
pipette (1 mL) Gilson Pipetman 1000
Sterile work bench The Baker Company Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors FST Dumont 14094-11
Syringe Henry Schein 9003016
T75 flask Sarstedt 833,911,002
tube (15 mL) Sarstedt 64,554,502
Water bath GFL Water bath type 1004

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 117 हिप्पोकैम्पस सेल संस्कृति अप्रत्यक्ष coculture hippocampal न्यूरॉन्स astrocytes synaptogenesis
अप्रत्यक्ष न्यूरॉन astrocyte coculture परख: एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; न्यूरॉन glia बातचीत की विस्तृत जांच के लिए सेट-अप
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Gottschling, C., Dzyubenko, E., Geissler, M., Faissner, A. The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions. J. Vis. Exp. (117), e54757, doi:10.3791/54757 (2016).

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