Summary
이 원고는 세로 두 광자 현미경을 사용하여 생체 내에서 아밀로이드 플라크 축적 동안 cerebrovasculature의 리모델링을 추적하는 절차를 설명합니다. 얇아진 두개골 제제는 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 손상의 진행을 평가하기 위해, 형광 염료의 시각화를 가능하게한다.
Abstract
뇌 혈관의 리모델링은 뇌 병변의 일반적인 특성이다. 생체 내 이미징 기술은 뇌 가소성 손상이 초과 발생 및 신경 세포의 활동이나 혈액의 흐름과 관련하여 감지 할 기본입니다. 생체 이광자 현미경 살아있는 뇌 큰 휴대 장치의 구조 및 기능 가소성 연구를 허용한다. 특히, 박형화 두개골 윈도우 준비 중요한 뇌 염증을 유발하지 않고 관심 (ROI)의 피질 영역의 가시화를 허용한다. 피질 ROI 반복적 촬상 세션은 다수의 CNS 질환의 진행 시간 경과 질병 특징의 특성을 제공 가능하다. 두뇌의 250 μm의 내 pial 구조에 접근이 기술은 유전자 세포 마커 및 / 또는 중요한 염료로 인코딩 된 형광 프로브의 검출에 의존한다. 후자 (즉, 형광 덱스 트란)을 루민 매핑하는 데 사용되는뇌 혈관 구조의 알 함. 본원에 기술 된 프로토콜에 밀접한 알츠하이머 병 (AD)의 진행을 평가하기 아밀로이드 침착 생체 마커, 메 톡시 O4의 사용이다. 또한 혈관 변화 아밀로이드 침착을 추적하기 위해 사용 된 후 수집 화상 처리를 설명한다. AD의 모델에 초점을 맞추고 있지만, 현재의 기술 된 프로토콜은 뇌 병리 변화가 발생하는 기타 CNS 장애와 관련이있다.
Introduction
뇌 혈관 해부학 기능적 신경 세포에 결합 된 멀티 - 셀 구조이다. 선박의 동적 리모델링 뇌 발달에 걸쳐 및 중추 신경계 (CNS)의 1,2- 병상의 진행 중에 발생한다. 널리 뇌 손상, 알츠하이머 병 (AD), 간질 등 여러 CNS 질환, 외상성 뇌 손상의 특징은 3,4- 뇌염 것을 허용한다. 발병에서 만성 단계로, CNS 질환을 모델링 할 때 따라서, 생체 내에서 뇌 혈관의 변화를 추적하는 것이 중요하게된다. 뇌 혈관 변형이 자주 신경 손상이나 소성 병용 발생으로, 신경 혈관의 영상은 중추 신경계 질환의 병태 생리를 해독하는 키 입력 포인트를 나타냅니다.
이 프로토콜의 마우스 모델에서 cerebrovasculature의 개조를 추적 길이 이광자 기반 절차를 설명AD 인해 아밀로이드 플라크 침착 5-7에 크고 작은 구경 혈관에서 뇌 혈관의 결함에 의해 표시 진보적 인 병리. 이 과정은 질환의 과정을 통해 신경 혈관 리모델링에 대한 아밀로이드 침착 및 위치 추적과 성장의 시각화를 허용한다. 중요한 형광 염료는 형질 전환 AD 마우스 (8)의 cerebrovasculature 및 아밀로이드 플라크의 시각화를위한 각 영상 세션 전에 주입된다. 얇아진 두개골 두개 창을 통해 반복적 ROI 영상 세션은 비 침습적 인 선택의 방법은 살아있는 쥐의 뇌에서 신경 혈관 리모델링 2,5,9,10을 평가.
아래의 절차는 수술 프로토콜, 이미지 수집 및 처리에 대해 간략하게 설명합니다. 대부분 큰 leptomeningeal 및 관통 동맥에서 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA)의 초기 진행이 특징입니다.
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Protocol
마우스는 음식, 물에 광고 무제한 액세스를 허용하고, 12 시간의 명암주기에 유지됩니다. 실험 동물과 관련된 모든 절차는 국가 및 유럽 법을 따른다 교육 및 과학 연구 (CEEA-LR-00651-01)에 대한 프랑스의 교육부에 의해 승인되었다. (6) 형질 전환 5xFAD 4 한배 새끼를 야생형 (WT) 대조군의 총이 절차에 사용 하였다.
1. 수술 전 준비
- 복강 (IP) 메 톡시 - X04 (10 ㎎ / ㎏) Aβ 예금 (11) 레이블을 수술 전 48 시간을 주입.
- 멸균 된 인공 뇌척수액 (ACSF) (120 mM의 NaCl을, 26.2 밀리미터의 NaHCO3, 2.5 밀리미터의 KCl을 준비 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 포도당, 95 % O 2 / 5 % CO 2 이전과 거품 2.5 mM의 CaCl2를) 첨가.
- 오토 클레이브 또는 무균 전에 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여, 수술 도구 (가위, 집게, 면도날과 드릴 비트) 소독외과.
- 깨끗한 흡수 천으로 70 % 에탄올과 커버 수술 벤치와 현미경 플레이트를 청소합니다.
- 케타민 / 자일 라진 (75 ㎎ / ㎏, 10 ㎎ / ㎏, 각각) 및 진통 케토 프로 펜 (2.5 ㎎ / ㎏) IP를 주입한다.
- 발이나 꼬리 핀치와 마취의 적절한 수준을 확인합니다.
- 눈에 멸균 안과 연고를 적용하고 수염을 피하면서 모피 (귀 코) 면도. 이 심하게 피부 자극을 방지하기 위해 세정을 행한 뒤에으로하는 제모 크림 길이로 사용될 수있다. 면도날에 남아있는 털을 면도. 포비돈 요오드 소독액로 피부를 소독.
- 양안 현미경으로 마우스를 놓고 코 귀에서 피부 절개를합니다. 두개골을 노출 옆으로 피부를 당겨. 골막을 절개하고 반복 가능한 출혈을 멈추게하기 위해 멸균 ACSF으로 두개골을 씻어.
2. 혈관 라벨 및 박형화 두개골창 준비 (40 분)
- 코튼 팁 눈 연고를 제거합니다. 국소 안과 마취제 (tetracaine에 1 %) 한 방울을 적용하고 부드럽게 돌출부를 달성하기 위해 안와 주위 피부 압박.
- Yardeni 동료 (12)에 의해 기술 된 절차에 따라 역 궤도 부비동에서 (피하 인슐린 바늘 100 ㎎ / ㎏ 또는 50 ㎎ / ㎖ 용액 50 μL) 덱스 트란 (70 kDa의)와 접합 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)를 주입한다. 눈에 멸균 안과 연고를 적용합니다.
- 피부가 후퇴하고 두개골 선택한 이미지 주변 깨끗하고 건조 된 상태인지 확인하십시오. 디바이스 장착 헤드의 창 주위 cyanoacrylic 접착제 소량 적용 수초 10 완만 한 압력을 적용 대상 영역 주위의 접착제 (적층 면도기 블레이드로 이루어진,도 1 참조).
- 면적이 확실하게 디바이스를 탑재 헤드 윈도우의 가장자리에 피부의 끝을 당겨마른. 피부 의학적 등급 cyanoacrylic 접착제 소량의 윈도우 가장자리를 고정하고 건조 (도 1)까지 기다린다.
- 헤드 마운트 장치를 사용하는 단계에서, 동물을 고정. 멸균 ACSF 헹군 후 잘 피부와 헤드 마운트 장치 사이에 완벽하게 밀봉되어 있는지 확인합니다. 정상 체온을 유지하기 위해 생존 담요에 마우스를 감싸.
- 이전 10 바와 같이 ACSF 용액에 두개골의 박형화를 수행한다. 두피가 완전히 제거되지 않습니다. 정기적으로 뼈 파편을 취소하고 조직의 과열을 방지하기 위해 ACSF을 변경합니다. 남아있는 뼈 파편은 간단한 에어 퍼프로 제거 할 수 있습니다. ACSF 솔루션은 시추에 의해 생성 된 진동을 감쇠.
참고 : 동물의 연령과 관심 영역에 따라 μm의 150-80 사이에 마우스 두개골 두께가 달라집니다. - (중간 속도 및 0.7 mm 버) 치과 용 드릴을 사용하면 영역 1에서 두개골 표면을 얇게 시작합니다.두개골에 정기적으로 수직 운동 평행을 사용하여 제거 직경 0mm 해면골의 대부분 (제 1 40-70 μm의). ACSF마다 20 ~ 30 초를 교체하고 3 ~ 4 초에 중단 드릴링을 제한해야합니다. 그 뼈 근처 봉합 참고 높은 혈관이다. ACSF는 결국 출혈을 멈추게하기 위해 gelfoam을을 적시고 적용합니다.
- 과도한 압력이 가해지지 않도록주의하면서 두개골의 숱이 계속 날카로운 일회용 안과 미세 수술 블레이드를 사용합니다. 35 μm의 - 최종 영역의 직경 및 20의 두께는 약 0.5 mm이다.
참고 : 뼈의 재성장과 흉터에, 그것은 각각의 영상 회의에서 더 얇은 창에 필요한 인해.
3. 이광자 현미경 (45 분)
- 필요한 경우, 충분한 마취를 유지하기 위해 19 밀리그램 / kg 케타민 주입.
- 이광자 레이저 현미경 (headmount 스테이지에 고정 된) 마우스를 옮긴다. 20 배 침수 OBJ를 사용하여1.0 개구 수 ective 에피 형광 램프를 이용하여 광 필드의 중심에서 얇아진 두개골 창을 찾아. 목적이 항상 ACSF에 몰입되어 있는지 확인합니다.
- 모드 잠금 펄스 레이저 (티 - 사파이어 680-1040nm)와 레이저 스캔을 시작합니다. 각각 파란색과 녹색 채널에서 방출 된 메 톡시 XO4의 형광 및 FITC-덱스 트란를 감지하는 750 nm의 여기 파장을 설정합니다.
참고 : 현미경은 506 nm 내지 555 nm에서 두 개의 빔 스플리터가 있습니다. 청색 광은 470 ± 12 nm의 필터를 구비 한 NDD 검출기에 의해 캡쳐된다. 녹색광은 525 ± 25 nm의 필터를 구비 한 고감도 하나로 이루어질 검출기에 의해 캡쳐된다. 대물로부터 방출 최대 레이저 출력은 레이저 - 유도 된 조직 손상을 피하기 위해 10 mW의을 초과하지 않아야한다. - 낮은 배율 스택을 획득 (500 μm의 X 500 μm의 512 X 512 픽셀, 2 μm의 단계) 투자 수익 (ROI)의 정확한 relocalization에 대한 3 차원지도를 제작하는 0.7 배 수치 줌에나중 시점에서.
- 2 배 수치 줌 4 높은 디지털 확대 이미지의 모자이크를 취득 (200 μm의 X 200 μm의 512 X 512 픽셀, 1 μm의 단계). 이미징 소프트웨어는 200 μm의 단계로 창을 이동 사용하면 모든 지역을 촬영합니다. 스택의 깊이는 모자이크의 각 이미지에 pial 표면에서 시작하여, 일반적으로 250 μm의입니다.
- 현미경에서 마우스를 제거하기 전에 사진을 촬영하거나 이미징 분야의 미래 relocalization에 대한 pial 혈관의 손으로 그린 2D지도를합니다.
4. 복구 및 재 이미징
- 아래 두개골을 누른 상태에서 견인을 적용하여 헤드 마운트 장치를 제거합니다. 어떤 접착제가 두개골이나 피부에 부착 된 상태를 유지하는 경우, 미세 집게로 조심스럽게 긁어. 두피를 봉합하고 홈 케이지에 반환하기 전에 마취에서 회복을 모니터링하는 가열 새장에 마우스를 놓습니다. 봉합사에 국소 항생제 크림을 적용하고 케토 프로 펜을 주입 (2.5 ㎎ / ㎏) IP는 이일 다음과 같습니다.
- 반복 1.1 반복 이미징 세션에 대한 2.5 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 화상의 최적의 품질을 보장하기 위해 미세 수술 블레이드 뼈 면도.
참고 : 이미징 세션 사이의 간격 한 달 이상 때 치과 드릴 추가 숱이 필요할 수 있습니다. - 이전 세션 (단계 3.6)에서 촬영 pial 혈관의 2D 맵에 따라 epifluorescent 빛을 사용하여 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.
- 이광자 레이저 스캐닝을 시작하고, 단계 34에서 수득 한 3 차원지도를 이용하여 마이크로 미터 규모로 정렬하기 위해 현미경 스테이지를 조절. 단계 3.5에 설명 된대로 상세한 이미지로 넘어갑니다.
5. 후 인수 3 차원 재구성 및 이미지 분석
- 입체 혈관의 복원 및 IMARIS 같은 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 아밀로이드 침착을 (버전 8.0 및 7.7.2를 사용)을 얻었다. 이미지 스택의 전체 깊이에 두 채널의 이상적인 대비를 얻기 위해 이미지 처리 메뉴 및 대비 변화 하위 메뉴의 표준화 계층 플러그인을 사용합니다.
- 동시에 모든 시점에서 동일한 영역에서 이미지를 열고 항상 다른 시점을 비교하기 위해 병렬로 처리합니다.
- 필라멘트 추적 모듈을 사용하여 추적 용기.
- 새로운 필라멘트를 만들 필라멘트 아이콘을 클릭 자동 추적을 건너 뛰고 자동 경로 방법을 선택합니다.
- 선택된 채널은 혈관 화상과 상기 포인터의 선택 기능을 이용에 대응해야하는 시점을 결정하기 위해 시프트 + 컨트롤 키를 누른 상태에서 촬상 세션에서 보존하는 용기 분기점에서 클릭. 포인터의 선택 기능을 사용하여 필라멘트의 끝점을 선택하려면 Shift 키를 누른 상태에서 클릭합니다.
참고 : obtai의 비교네드 켈리는 혈관의 구조적 변화를 표시합니다.
- 새로운 플라크를 추적하는면 분석에 의해 평면을 수행합니다. Aβ 플라크의 성장을 추적 파랑 채널에 표면 모듈을 적용합니다. 새로운 표면을 생성하고 자동 표면 생성을 진행 표면의 아이콘을 클릭합니다. 설정하고 배경 신호를 감산하는 임계 방법을 사용합니다. 통계 메뉴 개별 아밀로이드 침착의 표면에 관한 데이터를 제공한다.
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Representative Results
이 프로토콜은 cerebrovasculature 아밀로이드 침착 초과를 시각화하기위한 방법을 설명한다. 형광 염료는 아밀로이드 증착 (메 톡시 XO4) (11) 레이블과 뇌 혈관 내강 (FITC-덱스 트란)를 1 채우기 위해 주입 하였다. 3D 이미지 분석 소프트웨어 모듈은 연속 시점에서 캡쳐 된 뷰의 일정한 필드의 3 차원 이미지를 생성하는데 사용되었다. 대표 이미지는 5XFAD 마우스 (5) 대부분의 Aβ 예금의 실질 성장, 3 세 사이의 4 개월 나타 쇼 (그림 2) 주위 관통 혈관 (그림 3) (AD의 유전 적 모델)의 체성 감각 피질에서 얻어진. 플라크 침착은 상당한 리모델링과 이웃 cerebrovasculature의 임시 폐쇄 (그림 2)와 동시에 발생합니다. 플라크 크기 감소의 단지 드물게이 플라크 (A)의 처리 인 것을 나타내는, 관찰 ccumulation. 도 2 및도 3은 실질 조직 및 혈관 주위의 아밀로이드 부하가 체성 감각 피질의 혈관 신생 및 혈관 폐색과 관련된 것을 나타낸다. 혈관 아밀로이드 플라크와 혈관 폐색의 관계는 폐쇄 작은 구경 혈관에서 주로 발생하는 반면, 대부분의 혈관 플라크가 큰 관통 동맥에 축적 주어진 불분명 남아있다.
1. 실험 설정 그림. (A) 헤드 설치; 무대는 사용자 정의한다. 헤드 마운트 장치는 이전 10 설명 된대로 기본 스택 면도날로 구성되어 있습니다. (B) 머리에 잠겨 마우스보기 장치를 탑재합니다. (C) 두개골에 붙어 장치와 피부의보기. 가장자리는 대상 지역을 중심으로하고 있습니다.S / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 나이의 4, 5 개월에서 5xFAD 마우스의 미세 혈관 및 아밀로이드 증착을 두 복원 된 이미지 2. 비교. 아밀로이드 플라크가 흰색 별표 (*)로 표시됩니다 5 개월에서 나타나는 새로운 플라크는 노란색 별표로 표시됩니다. 플라크 감소의 희귀 한 예는 혈관 폐색은 빨간색 화살표로 표시되는 동안 새로 형성된 미세 혈관 노란색 화살표로 표시됩니다 오렌지 별표 (*)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
나이의 3, 4, 5 개월 체성 감각 피질 3. 크고 작은 구경 용기를줍니다. 큰 구경 혈관 (흰색 별표)에 아밀로이드 혈관 예금의 (A) 성장. (B) 아밀로이드 플라크는 작은 구경의 용기 (노란색 별표)을 관찰 할 수있다. 빨간색 화살표는 폐색 된 혈관을 나타냅니다. 화이트 별표 성장 아밀로이드 플라크를 지적했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 이광자 현미경 오픈 두개골 기술은 큰 이미지 필드 13,14 무제한 촬상 세션의 이점을 제공한다. 그러나이 기술은 또한 관심 (14)의 영역에 염증을 생산, 종종 호환되지 않거나 영향을 미치는 신경 혈관 읽기 아웃 15. 반대로, 얇아진 두개골 두개의 기술은 신뢰성 뇌 혈관 구조 촬상 플라크 축적 10,14있게 신경 염증을 초래하지 않는다. 이 기술에 의해 제공 번째 장점은 얇아진 두개골 창 성공률 숙련 된 조작자를 위해 90 % ~ 80 %까지 도달 할 수 있다는 것이다. 성공을위한 주요 차질 과도한 숱이와 궁극적 인 파괴로 이어지는 뼈 두께의 감사의 부족이다; 경험과 쌍안 현미경의 우수한 광학이 문제를 제한합니다. 많은 제한 그러나이 방법에 영향을 수행. 우선, 촬상 깊이 제한은 CO오픈 두개골 절차를 mpared. 둘째로, 시간이 지남에 따라 뼈를 덮는 흉터 조직은 두개 화상의 품질을 감소시킬 수있다. 셋째, 두개골 각 세션에서 좀 더 얇게되어야한다는 소정의 4 개 이상의 촬상 세션을 진행하기가 어렵다. 그 결과, 세션의 씨닝 증가분을 최적화하기 위해 실험의 시작 촬상 세션의 수를 결정하는 것이 중요하다. 대안 적으로, 커버 글라스와 접착 시닝 두개골 준비 이루어진 만성 두개 창에 이전에 16 시간 동안 골 조직의 재성장을 제한하기 위해 설명되었다. 효율적인 있지만, 우리는 몇 주 동안 뼈의 재성장 지연이 기술은 결국 품질, 깊이와 이미지의 세포 내 해결을 방해하는 것을 발견했을 때 오랜 시간 (마가리타, 아란 - Lievano와 프레디 Jeanneteau, 게시되지 않은 데이터) 후 이미징을 다시. 한계에도 불구하고, 두 개의 광자 두개 microscopy 반복 얇아진 두개골 제제 통해 신경 혈관 변화 및 염증이 발생 만성 질환 모델에서 형광 마커 추적 선택하는 방법이다.
뼈에 적용될 압력은 출혈을 방지하기 위해, 평면 두개골 창을 위해 최소화되어야 같이 두개골의 최적 얇아 주요 기술 공정을 나타낸다. 출혈 요철 두개골 창 흉터 및 뼈의 요철 재성장을 용이하게 할 수있다. 과도한 드릴링, 또는 레이저 손상 후 과열 1 이미징 세션 동안 과도 씨닝 또한 두개골 창을 통해 신호의 선명도를 손상시킬 수있다. 후자의 문제는 주기적으로, 드릴링 동안 ACSF 매체 변경 준비 냉각 간헐적 드릴링 및 뼈 연마시 클린 날카로운 도구를 사용하여 제어 될 수있다. 추가의 중요한 단계는, 호흡과 연관된 움직임을 줄이기 위해 (ⅱ) RETR를 장착 판 머리 두개골 (I)의 고정을 포함이미징 세션 사이에 당과 수술 후 치료 오 - 궤도 주입 및 모든 선박의 신뢰할 수있는 가시성, (ⅲ) 미래의 재배치에 대한 관심의 영역을 매핑하고, (ⅳ) 사전.
연구는 예를 들어, 분자가 감소 또는 뇌 실질과 혈관에 아밀로이드 침착을 방지하는 신경 혈관 구조를 대상으로 CNS 약물의 효능과 안전성을 평가하기 위해 여기를 요약 방법론은 할 수 있습니다. 또한, 살아있는 뇌의 길이 두 광자 현미경 아밀로이드의 추적 및 사전인지 저하의 발병 AD의 초기 단계에서 neurovasculature에 미치는 영향을, 허용한다. 큰 아밀로이드 플라크의 여유 공간의 부족은 질병의 병태 생리 (17)을 악화 뇌 혈관에 해로운 효과를 가질 수있다. 새로운 형광 중요한 염료의 출현은, 루이 기관, synucleopathy, 프리온 집계, 헌팅 집계 레이블을 remod neurovasculature의 미래 실현성을 지원하는다른 신경 퇴행성 질환 (18)의 진행 동안 연구를 ELING. 이 기술은 생체 내 실험 모델의 구조와 기능에서 세포의 상호 작용을 조사하기 위해 염료를 결합 여러 마우스 변종 (SR101, 메 톡시 X04, 덱스 트란, 렉틴) 및 유전자 마커 (thy1YFP, CX3CR1-GFP, NG2-을 DsRed)에 적합하다 neurovasculature의 정상적인 생리에서 벗어나.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 리그 프랑세즈 CONTRE 난 épilepsie (MA-L에), (FJ에) 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE 부여 AVENIR R12087FS은 몽펠리에 대학에서 부여 (FJ에) 및 허가를 인정하고 싶습니다 연맹에서 (NM에) 라 공들인 쉬르 르 Cerveau을 붓는다. 우리는 몽펠리에의 생체 내 이미징 코어 플랫폼 기능의 IPAM에서 Chrystel Lafont의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 또한 원고를 교정하기위한 메리 Vernov (웨일 코넬 의과 대학)을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/kg |
| FITC-Dextran 70 Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
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