Summary
该原稿描述的过程使用纵向双光子显微镜体内淀粉样蛋白斑积累期间跟踪cerebrovasculature的重塑。减薄头骨制备使荧光染料的可视化，以评估在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中脑血管损伤的进展。
Abstract
大脑脉管系统的重塑是脑病理学的一个共同特征。 体内成像技术是检测脑可塑性或损害的发生加班费和相对于神经元活性或血流的基础。 体内双光子显微镜允许在客厅大脑细胞大单位结构和功能可塑性的研究。特别是，减薄-颅骨窗制剂允许的感兴趣区域（ROI）的皮质区域的可视化而不诱导显著脑炎症。皮质的投资回报率的重复成像会议是可行的，许多中枢神经系统疾病的进展过程中提供疾病特点随时间变化的表征。这种技术在访问内250μm的大脑的软脑膜结构依赖于检测通过基因细胞标记和/或活体染料编码的荧光探针。后者（ 例如，荧光葡聚糖）被用于映射LUMIN脑结构的人舱。锗本文所述的协议是使用淀粉样蛋白沉积物的体内标记物，甲氧基O4，以评估阿尔茨海默氏病（AD）进展。我们还描述了用于跟踪血管变化和淀粉样沉积的采集后图像处理。虽然目前专注于AD模型，描述的协议是有关在那里发生的病理变化脑血管病其他中枢神经系统疾病。
Introduction
脑血管是一个多细胞结构，这是在解剖学和功能上耦合到神经元。船只的动态重构发生在整个大脑发育和中枢神经系统（CNS）1,2的病状的进展期间。它已被广泛接受脑损伤是几种中枢神经系统疾病，包括癫痫，阿耳茨海默氏病（AD），创伤性脑损伤的一个标志和脑炎3,4。因此， 在体内追踪脑血管变化建模中枢神经系统疾病时，从发病进入慢性期变得显著。由于脑血管修改常与神经元损伤或可塑性伴随发生时，神经血管成像是一个关键切入点破译CNS疾病的病理生理机制。
这个协议描述了一个纵向的双光子基于程序来跟踪cerebrovasculature的重构的小鼠模型AD，由于淀粉样蛋白斑块沉积5-7的大，小口径血管脑血管缺陷标志着一个渐进的病理。此过程允许淀粉样蛋白沉积和其位置和生长的跟踪的可视化对于神经血管重塑整个病程。重要的荧光染料的cerebrovasculature和淀粉样蛋白斑在转基因小鼠公元8可视化每个成像会议召开前被注入。通过减薄头骨颅窗口ROI的重复成像会议是非侵入性的和选择的方法在活老鼠的大脑2,5,9,10评估神经血管重塑。
下面的步骤概括了手术方案，图像采集和处理。淀粉样脑血管病（CAA）主要在软脑膜大与穿透性小动脉的早期发展的特点。
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Protocol
小鼠被允许食物，水随意访问，并维持12小时光照-黑暗周期。所有涉及实验动物的程序符合国家和欧洲的法律和由法国教育部教育和科学研究（CEEA-LR-00651-01）的批准。共有6个转基因5xFAD和4个同窝野生型（WT）对照组小鼠被用于此过程。
1.手术前准备
- 腹腔（IP）注射甲氧基X04（10毫克/千克）手术标记Aβ存款11前48小时。
- 制备无菌人工脑脊液（ACSF）（120mM氯化钠，26.2毫碳酸氢钠 ，2.5mM的氯化钾，1mM的的NaH 2 PO 4，1.3毫氯化镁 ，10mM葡萄糖;气泡以95％ 的 O 2/5％CO 2的前加入2.5毫摩尔的CaCl 2）。
- 消毒手术工具（剪刀，镊子，刀片和钻头），用高压灭菌或无菌之前热珠灭菌手术。
- 请用70％的乙醇和覆盖手术台和显微镜板用干净的吸水布。
- 注入氯胺酮/赛拉嗪（75毫克/公斤和10毫克/公斤，分别）和镇痛药酮洛芬（2.5毫克/千克）的IP。
- 请与爪子或尾巴捏麻醉适当的水平。
- 应用无菌眼药膏眼睛和刮皮毛（鼻耳），同时避免了胡须。因为它是接着用水，以防止皮肤刺激仔细漂洗脱毛乳膏可以用作长。刮剩下的皮毛用刀片。消毒用碘伏防腐剂溶液皮肤。
- 将鼠标的双目显微镜下和从耳朵到鼻使皮肤切口。侧身拉出皮肤暴露颅骨。切开骨膜并反复冲洗用无菌学联头骨停止可能的出血。
2.血管系统标签和减薄的头骨窗口准备（40分钟）
- 取出眼膏用棉签。应用局部眼用麻醉（地卡因1％）的下降，轻轻地压在皮肤周围的眼窝实现凸出。
- 在眶后窦以下通过亚德尼和同事12中描述的方法;注入用葡聚糖（70 kDa）的缀合异硫氰酸荧光素（FITC）（皮下注射胰岛素针100毫克/千克或50微升50毫克/毫升溶液）。应用无菌眼药膏的眼睛。
- 保证皮肤回缩，头骨是围绕选定成像区清洁和干燥。申请围绕头部的窗氰基丙烯酸胶少量贴装器件（包括层叠剃须刀刀片，参见图1），和胶周围施加温和的压力的目标区域几秒钟10。
- 皮肤的端部拉向头部的窗口的边缘安装器件，确保的区域是干。固定皮肤和兽医级氰基丙烯酸胶少量的窗口的边缘，并等待直至干燥（ 图1）。
- 固定动物在使用头戴式设备阶段。用无菌脑脊液冲洗，并确保对皮肤和头戴式设备之间的井是完全密封的。包裹鼠标生存毯子，以保持正常体温。
- 如前所述10学联解决方案执行颅骨变薄。注意，头皮未完全除去。定期更改学联清除骨屑，避免组织过热。任何剩余的骨骼碎片可以用简短的空气泡芙被删除。学联解决方案还通过衰减钻探产生的振动。
注：小鼠头骨厚度取决于动物的年龄和感兴趣区域80 150之间，以微米而变化。 - 使用牙钻（以中速和0.7mm的毛刺）开始在区域1变薄颅骨表面。0毫米直径利用垂直平行于头骨有规律的运动，并除去大部分的骨松质（第40 - 70微米）。记得更换学联每隔20-30秒，并限制不间断钻3-4秒。需要注意的是骨缝线附近是高度血管。学联应用明胶海绵预浸停止最终出血。
- 用锋利的一次性眼科显微叶片继续与颅骨变薄，小心不要施加过大的压力。最后区域是大约0.5毫米，直径与厚度为20 - 35微米。
注：由于骨再生和瘢痕形成，有必要在每个成像会话的窗口进一步变薄。
3.双光子显微镜（45分钟）
- 如果有必要，用19毫克/千克氯胺酮注射以维持足够的麻醉。
- 在双光子激光显微镜下传送鼠标（固定到头戴阶段）。使用20X水浸泡OBJ为1.0的数值孔径ective，在使用外延荧光灯的光场的中心定位的变薄颅窗口。确保目标始终沉浸在学联。
- 与锁模脉冲激光（钛宝石680-1040nm）启动激光扫描。在750纳米设定激发波长分别检测甲氧基XO 4的发射的荧光和FITC-葡聚糖的蓝色和绿色通道。
注：本显微镜具有在506 nm和555 nm的两个分束器。蓝色的光被配备有470±12纳米的过滤器的NDD检测器捕获。绿色光被配备有525±25纳米的过滤器具有高灵敏度的GaAsP检测器捕获。从物镜射出的最大激光功率不应超过10毫瓦，以避免激光诱导的组织损伤。 - 获取低倍率栈（500微米×500微米，512×512像素; 2微米步骤）在0.7X变焦数值创造了3D地图的ROI的精确重新定位在稍后的时间点。
- 获得高4数字放大图像的镶嵌有2倍数字变焦（200微米×200微米，512×512像素; 1微米步骤）。使用图像处理软件在200微米的步骤将窗口移动到捕获所有地区。堆栈的深度通常为250微米，从表面软脑膜镶嵌的每幅图像中开始。
- 从显微镜取出鼠标之前，拍照，或对影像领域的未来重新定位的软脑膜血管的手绘2D地图。
4.回收和再成像
- 通过施加牵引力而下方保持头骨移除头部安装设备。如果有任何胶水仍然连接到颅骨或皮肤，用细镊子仔细地刮它。缝合头皮和将鼠标在加热的笼返回给家笼之前并监控从麻醉中恢复。应用局部抗生素乳膏于缝线和注入酮洛芬（2.5毫克/千克）我P上的以下2天。
- 重复步骤重复成像会议1.1至2.5。如果需要的话，剃骨用显微叶片，以确保图像的最佳质量。
注意：当成像会话之间的时间间隔是超过一个月与牙钻附加变薄可能是必要的。 - 根据从以前的会话（步骤3.6）所采取的软脑膜血管的2D地图使用啶光显微镜下鼠标位置。
- 启动双光子激光扫描和调整显微镜阶段在使用在步骤3.4中得到的3D地图的微米尺度来实现对准。如步骤3.5所述进行详细的成像。
5.收购后三维重建与图像分析
- 获得脉管的三维重建和使用3D图像分析软件如IMARIS淀粉样蛋白沉积（版本使用8.0和7.7.2）。 使用图像处理菜单和对比度变化的子菜单上的正常化层插件，以获得在图像栈的整个深度的两个通道中的理想的对比度。
- 在所有时间点同时打开来自同一区域的图像和总是处理它们并联 ，以比较不同时间点。
- 使用长丝示踪模块跟踪船只。
- 点击图标长丝创建一个新的细丝，跳过自动追踪并选择自动路径法。
- 是确定所选信道对应的血管图像，并使用指针的选择功能，点击即在保持变速+对照键，以确定一个起点穿过成像会话保守脉管分叉。使用指针的选择功能，同时按住shift键来选择丝的终点单击。
注：obtai的比较斯内德骨骼会显示出血管的结构变化。
- 通过平面分析进行平面追踪新的斑块。应用面模块与蓝色通道用于跟踪的Aβ斑块的生长。点击图标面来创建一个新的表面，并与自动曲面创建进行。使用阈值法来设置和减去背景信号。统计数据菜单提供相对于个别淀粉样蛋白沉积的表面数据。
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Representative Results
本协议描述的可视化cerebrovasculature和淀粉样蛋白沉积加班的方法。荧光染料注射标记的淀粉样蛋白沉积（甲氧基XO 4）11，以填充脑血管管腔（FITC-葡聚糖）1。 3D图像分析软件模块用于创建视图的连续时间点拍摄的恒定场的3D图像。在5XFAD小鼠5表明大部分的Aβ沉积物出现月龄3和4之间，在软组织生长（ 图2）和围绕穿透血管（ 图3）（AD的遗传模型）的躯体感觉皮层获得的代表性图像。斑块沉积与显著重塑和相邻cerebrovasculature偶尔闭塞（ 图2）同时出现。只观察到噬斑减少尺寸的罕见的情况下，表明这是斑块一个的处理 ccumulation。 图2和3示出，在实质和血管周围的淀粉样蛋白负荷与在躯体感觉皮层血管生成和血管闭塞相关联。血管淀粉样蛋白斑块和血管阻塞的关系仍不清楚，因为积累了大型穿透动脉血管最斑块，而大多发生在小口径血管闭塞。
图1.实验装置。 （一）头设置;舞台定制。头安装装置由如前所述10，内置堆叠剃须刀刀片。 （二）锁定在头部鼠标查看安装的设备。 （C）设备和皮肤粘在颅骨观。边缘都集中在目标区域。S / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.在4和5个月的婴儿比较的微血管和淀粉样供词上5xFAD鼠标的两个再现像。淀粉样蛋白斑块与一个白色星号表示，出现在5个月推出新斑块由黄色的星号表示。斑减少的罕见实例表明一个橙色星号新形成的微血管被用黄色箭头表示，而血管闭塞用红色箭头指示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.在躯体感觉皮层大和小口径船只在3，4和5个月的年龄。 （一）对大口径血管（白星号），淀粉样蛋白沉积血管生长。 （B）淀粉样蛋白斑块可以在小口径血管（黄色星号）来还观察到。红色箭头表示闭塞血管。白星号表示日益增长的淀粉样斑块。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
体内双光子显微镜开放式颅骨技术提供大量成像领域13,14无限成像会议的优势。然而，该技术也是在感兴趣区域14产生炎症，经常不相容或影响神经血管读数15。相反，减薄头骨颅技术不会导致神经炎症，使脑血管结构的可靠的成像和菌斑积累10,14。通过这种技术提出的第二个优点是稀疏的颅骨窗口的成功率可达80％〜90％，对于有经验的操纵者。成功的重大挫折是缺乏骨厚度，导致过度减薄和最终断裂升值;经验和双目显微镜的光学性能好将限制这个问题。一些限制做不过影响这种技术。首先，成像深度是有限的共mpared到开头骨的过程。第二，随着时间的推移，疤痕组织覆盖骨可以削弱颅成像的质量。第三，难以进行到给定的头骨在每一会话变薄多一点超过4成像会话。因此，重要的是要确定成像会话的数量在实验的开始时，为了优化会话之间的变薄增量。可替代地，由具有一玻璃罩胶合一个稀疏头骨制剂的慢性颅窗口已如前所述，以限制骨组织的再生长随时间16。虽然高效，我们发现，这种技术只延迟骨再生长数周，最终的品质，深度和图像的亚细胞分辨率的干扰时的较长时间（玛格丽塔阿朗戈-列瓦诺和Freddy Jeanneteau，未发表的数据）之后重新成像。尽管有其局限性，双光子颅microscOPY通过反复变薄头骨制剂是可以选择的方法来追踪在神经血管变化和炎症发生慢性疾病模型荧光标记。
颅骨的最佳变薄是一个重大的技术步骤，如应用到骨压力应该最小化，以避免出血并确保平坦颅骨窗。出血和不均匀颅骨窗可以促进疤痕和骨的不均匀再生。第一成像会话期间过度变薄，过度钻孔或激光破坏后过热也可以通过颅骨窗危及信号的清晰度。后者的问题可以通过在钻孔期间定期更换的脑脊液介质，冷却该制剂，间歇地钻孔，和抛光骨时使用干净锋利的工具来控制。额外的关键步骤包括头骨到头部的第（i）固定安装板以减少与呼吸相关的运动，（ⅱ）RETR邻入轨和所有船只的可靠的知名度，（III）的映射为将来搬迁感兴趣的区域，以及（iv）预，per-和术后护理在成像会话之间。
这里总结的方法允许研究，以评估中枢神经系统的药物靶向神经血管结构， 例如分子降低或预防淀粉样蛋白沉积在脑实质以及血管的疗效和安全性。此外，活体脑的纵向双光子显微镜允许淀粉样蛋白的跟踪和其对神经血管在AD的早期阶段的认知恶化的发病前的影响，。缺乏大型淀粉样蛋白斑块间隙可以对脑血管有害的影响，加剧了疾病的病理生理学17。新的荧光染料至关重要的问世标记路易体，突触核蛋白病，朊蛋白聚集体，亨廷顿聚集，支持神经血管的未来可达性remod其他神经退行性疾病18的发展过程中鹅岭研究。这种技术适合于几个小鼠品系结合染料（SR101，甲氧基X04，葡聚糖，凝集素）和遗传标记（thy1YFP，CX3CR1-GFP，NG2-DsRed的）调查在体内和实验模型，其中的结构和功能的细胞相互作用对神经血管的正常生理偏离。
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Disclosures
作者有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
笔者想承认法甲法兰西驳L'épilepsie（MA到-L），国家研究所德拉桑特等德拉RECHERCHE MEDICALE格兰特AVENIR R12087FS（FJ到），从蒙彼利埃大学教育资助（为FJ）和格兰特距离联邦倒拉RECHERCHE河畔乐Cerveau（以NM）。我们承认Chrystel的乐峰在IPAM在蒙彼利埃的体内成像核心平台设施的技术援助。我们也感谢玛丽Vernov（威尔康乃尔医学院）校对稿件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/kg |
| FITC-Dextran 70 Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
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