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Medicine

अनुदैर्ध्य Published: December 6, 2016 doi: 10.3791/54796
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Inserm, U1191, Institute of Functional Genomics, 2CNRS, UMR-5203, 3Université de Montpellier

Summary

यह पांडुलिपि विवो में amyloid पट्टिका संचय अनुदैर्ध्य दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग दौरान cerebrovasculature के पुनर्गठन को ट्रैक करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है। एक पतला-खोपड़ी तैयारी अल्जाइमर रोग के एक माउस मॉडल में cerebrovascular नुकसान की प्रगति का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है।

Abstract

मस्तिष्क वाहिका के पुनर्गठन मस्तिष्क विकृतियों का एक आम लक्षण है। विवो में इमेजिंग तकनीक cerebrovascular प्लास्टिसिटी या क्षति के लिए अतिरिक्त समय होने वाली है और neuronal गतिविधि या रक्त के प्रवाह के संबंध में पता लगाने के लिए मौलिक हैं। विवो दो photon माइक्रोस्कोपी में रहने वाले मस्तिष्क में बड़े सेलुलर इकाइयों के संरचनात्मक और कार्यात्मक प्लास्टिसिटी के अध्ययन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, पतला-खोपड़ी खिड़की तैयारी महत्वपूर्ण मस्तिष्क में सूजन उत्प्रेरण बिना ब्याज (आरओआई) के cortical क्षेत्रों के दृश्य के लिए अनुमति देता है। cortical रॉय के दोहराव इमेजिंग सत्र कई सीएनएस रोगों की प्रगति के दौरान समय के साथ रोग पहचान के लक्षण वर्णन उपलब्ध कराने संभव है। इस तकनीक मस्तिष्क की 250 माइक्रोन के भीतर pial संरचनाओं पहुँचने आनुवंशिक मार्करों सेलुलर और / या महत्वपूर्ण रंगों द्वारा इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच का पता लगाने पर निर्भर करता है। उत्तरार्द्ध (जैसे, फ्लोरोसेंट dextrans) Lumin नक्शा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंcerebrovascular संरचनाओं के अल डिब्बे। प्रोटोकॉल यहाँ बताया लिए सार्थक amyloid जमा का एक विवो मार्कर, methoxy-O4, का उपयोग अल्जाइमर रोग (ई) प्रगति का आकलन करने के लिए है। हम यह भी अधिग्रहण के बाद छवि की नाड़ी में परिवर्तन और amyloid बयानों पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया प्रसंस्करण का वर्णन है। जबकि विज्ञापन का एक मॉडल पर वर्तमान में ध्यान केंद्रित कर, वर्णित प्रोटोकॉल अन्य सीएनएस विकारों जहां रोग cerebrovascular परिवर्तन होते हैं के लिए प्रासंगिक है।

Introduction

मस्तिष्क वाहिका एक बहु-कोशिकीय संरचना है, जो संरचनात्मक और कार्यात्मक न्यूरॉन्स के लिए युग्मित है है। जहाजों की एक गतिशील remodeling मस्तिष्क के विकास के दौरान और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1,2 की विकृतियों की प्रगति के दौरान होता है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि cerebrovascular क्षति, मिर्गी सहित अल्जाइमर रोग (ई) कई सीएनएस रोग, घाव मस्तिष्क की चोट की एक बानगी है और 3,4 इन्सेफेलाइटिस। इसलिए, विवो में cerebrovascular परिवर्तनों पर नज़र रखने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है जब सीएनएस रोगों मॉडलिंग, शुरू होने से और जीर्ण चरणों में। cerebrovascular संशोधनों अक्सर neuronal नुकसान या plasticity के साथ समन्वित रूप से पाए जाते हैं, न्यूरो इमेजिंग वाहिका की सीएनएस रोग pathophysiology समझने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रवेश बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है।

इस प्रोटोकॉल एक अनुदैर्ध्य दो photon आधारित प्रक्रिया का वर्णन के एक माउस मॉडल में cerebrovasculature के पुनर्गठन ट्रैक करने के लिएई, amyloidogenic पट्टिका बयान 5-7 के कारण एक प्रगतिशील विकृति बड़े और छोटे कैलिबर जहाजों पर cerebrovascular दोषों के द्वारा चिह्नित। यह प्रक्रिया रोग के पाठ्यक्रम में neurovascular remodeling के संबंध में amyloid जमा है और उनकी स्थिति और विकास की ट्रैकिंग के दृश्य के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों ट्रांसजेनिक चूहों ई 8 में cerebrovasculature और सजीले टुकड़े के दृश्य के लिए प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले इंजेक्शन हैं। एक पतला खोपड़ी Transcranial खिड़की के माध्यम से एक रॉय के दोहराया इमेजिंग सत्र के गैर-आक्रामक है और पसंद की विधि रहने वाले माउस मस्तिष्क 2,5,9,10 में neurovascular remodeling आकलन करने के लिए।

नीचे प्रक्रिया शल्य प्रोटोकॉल, छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण की रूपरेखा। मस्तिष्क amyloid वाहिकारुग्णता (सीएए) ज्यादातर बड़े leptomeningeal और मर्मज्ञ धमनियों में के प्रारंभिक प्रगति होती है।

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Protocol

चूहे भोजन, पानी के लिए यथेच्छ के उपयोग की अनुमति दी है, और एक 12 घंटे की प्रकाश अंधेरे चक्र पर रखा जाता है। प्रयोगशाला जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं राष्ट्रीय और यूरोपीय कानून के लिए पुष्टि और शिक्षा और वैज्ञानिक अनुसंधान (CEEA-एलआर-00651-01) के लिए फ्रेंच मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया। 6 ट्रांसजेनिक 5xFAD और 4 littermate wildtype (डब्ल्यूटी) नियंत्रण चूहों की कुल इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया।

1. पूर्व ऑपरेटिव तैयारी

  1. Intraperitoneally (आईपी) methoxy-X04 (10 मिलीग्राम / किग्रा) सर्जरी Aβ जमा 11 लेबल करने से पहले 48 घंटे के इंजेक्षन।
  2. बाँझ कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) (120 मिमी NaCl, 26.2 मिमी 3 NaHCO, 2.5 मिमी KCl, तैयार 1 मिमी नः 2 4 पीओ, 1.3 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी ग्लूकोज, 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ पहले बुलबुला 2.5 मिमी CaCl 2) जोड़ने।
  3. सर्जिकल उपकरण (कैंची, संदंश, धार और ड्रिल बिट) जीवाणुरहित, एक आटोक्लेव या मम्मियाँ से पहले एक गर्म मनका अजीवाणु का उपयोग करसर्जरी।
  4. एक साफ शोषक कपड़े से 70% इथेनॉल और कवर के साथ शल्य बेंच और माइक्रोस्कोप प्लेट साफ करें।
  5. ketamine / xylazine (75 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) और एनाल्जेसिक ketoprofen (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) आईपी इंजेक्षन।
  6. पंजा या पूंछ चुटकी के साथ संज्ञाहरण के उचित स्तर की जाँच करें।
  7. आंखों को बाँझ नेत्र मरहम लागू करें और फर (कानों के लिए नाक) दाढ़ी मूंछ, जबकि परहेज। के रूप में यह ध्यान से त्वचा की जलन को रोकने के लिए पानी के साथ rinsing द्वारा पीछा किया जाता है एक लोमनाशक क्रीम लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। एक धार के साथ शेष फर दाढ़ी। povidone आयोडीन एंटीसेप्टिक समाधान के साथ त्वचा जीवाणुरहित।
  8. दूरबीन माइक्रोस्कोप के नीचे माउस प्लेस और नाक कान से एक त्वचा चीरा बनाते हैं। खोपड़ी को बेनकाब करने के बग़ल में त्वचा खींच। periosteum काटकर अलग कर देना और बार बार बाँझ aCSF के साथ खोपड़ी कुल्ला संभव रक्तस्राव रोकने के लिए।

2. Vasculature लेबल और पतला खोपड़ीखिड़की तैयारी (40 मिनट)

  1. एक कपास टिप के साथ आंख मरहम निकालें। सामयिक नेत्र संवेदनाहारी (tetracaine 1%) की एक बूंद लागू करें और धीरे फलाव प्राप्त करने के लिए थैली के आसपास की त्वचा का दबाव।
  2. प्रक्रिया Yardeni और उनके सहयोगियों ने 12 से वर्णित निम्नलिखित रेट्रो कक्षीय साइनस में, (चमड़े के नीचे सुई इंसुलिन 100 मिलीग्राम / किलो या एक 50 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 50 μl) fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) dextran (70 केडीए) के साथ संयुग्मित इंजेक्षन। आंखों को बाँझ नेत्र मरहम लागू करें।
  3. सुनिश्चित करें कि त्वचा मुकर गया है और खोपड़ी स्वच्छ और चयनित इमेजिंग क्षेत्र के आसपास सूखी है। सिर की खिड़की के आसपास cyanoacrylic गोंद की एक छोटी राशि लागू माउंट डिवाइस कई सेकंड 10 के लिए, और लक्ष्य क्षेत्र कोमल दबाव लागू करने के आसपास गोंद (खड़ी रेजर ब्लेड से मिलकर, चित्रा 1 देखें)।
  4. सिर की खिड़की के किनारे करने के लिए त्वचा के सिरों खींचो माउंट डिवाइस, यकीन है कि क्षेत्र है बनानेसूखी। त्वचा और पशु चिकित्सा ग्रेड cyanoacrylic गोंद की एक छोटी राशि के साथ खिड़की के किनारे सुरक्षित और सूखी (चित्रा 1) जब तक प्रतीक्षा करें।
  5. सिर माउंट डिवाइस का उपयोग चरण में पशु सुरक्षित। बाँझ aCSF से कुल्ला करें और सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से त्वचा और सिर माउंट डिवाइस के बीच पूरी तरह से बंद है। एक अस्तित्व कंबल में लपेट कर माउस normothermia बनाए रखने के लिए।
  6. के रूप में पहले 10 में वर्णित aCSF समाधान में खोपड़ी के thinning प्रदर्शन करना। ध्यान दें कि खोपड़ी पूरी तरह से हटाया नहीं गया है। नियमित रूप से अस्थि मलबे को साफ करने और ऊतक overheating से बचने के लिए aCSF बदल जाते हैं। किसी भी शेष हड्डी मलबे संक्षिप्त हवा कश के साथ हटाया जा सकता है। ACSF समाधान भी ड्रिलिंग द्वारा बनाई कंपन attenuates।
    नोट: माउस खोपड़ी मोटाई बदलता है माइक्रोन से 80 के बीच 150 जानवर की उम्र और ब्याज के क्षेत्र पर निर्भर करता है।
  7. (मध्यम गति से और एक 0.7 मिमी गड़गड़ाहट) एक दंत ड्रिल का प्रयोग एक क्षेत्र में 1 खोपड़ी की सतह thinning शुरू करते हैं।व्यास में 0 मिमी खोपड़ी के लिए एक नियमित रूप से ऊर्ध्वाधर गति समानांतर का उपयोग करने और हटाने स्पंजी हड्डी के सबसे अधिक (पहले 40 - 70 माइक्रोन)। aCSF हर 20-30 सेकंड की जगह है और 3-4 सेकंड के लिए निर्बाध ड्रिलिंग सीमित करने की याद है। ध्यान दें कि हड्डी के पास टांके अत्यधिक vascularized है। लागू aCSF gelfoam presoaked अंतिम रक्तस्राव रोकने के लिए।
  8. खोपड़ी के thinning के साथ जारी रखने के लिए सावधान किया जा रहा अत्यधिक दबाव लागू करने के लिए नहीं एक तेज डिस्पोजेबल नेत्र microsurgical ब्लेड का प्रयोग करें। 35 माइक्रोन - अंतिम क्षेत्र में व्यास और 20 की मोटाई के साथ 0.5 मिमी के बारे में की है।
    नोट: कारण हड्डी regrowth और scarring के लिए, यह आगे पतली प्रत्येक इमेजिंग सत्र में खिड़की के लिए आवश्यक है।

3. दो photon माइक्रोस्कोपी (45 मिनट)

  1. यदि आवश्यक हो, 19 मिलीग्राम / किग्रा ketamine साथ इंजेक्षन पर्याप्त संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए।
  2. दो photon लेजर खुर्दबीन के नीचे माउस (headmount चरण के लिए फिक्स्ड) स्थानांतरण। एक 20X पानी विसर्जन obj का प्रयोग1.0 की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ ective, महामारी फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग कर ऑप्टिकल क्षेत्र के केंद्र में पतला कपाल खिड़की का पता लगाने। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य हमेशा aCSF में डूब जाता है।
  3. एक विधा बंद कर दिया स्पंदित लेजर (तिवारी नीलम 680-1040nm) के साथ लेजर स्कैनिंग शुरू। क्रमशः नीले और हरे रंग चैनलों में methoxy-XO4 की उत्सर्जित प्रतिदीप्ति और FITC-dextran पता लगाने के लिए 750 एनएम पर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप 506 एनएम और 555 एनएम पर दो बीम splitters है। ब्लू प्रकाश एक NDD एक 470 ± 12 एनएम फिल्टर के साथ सुसज्जित डिटेक्टर से कब्जा कर लिया है। हरी बत्ती एक उच्च संवेदनशीलता GaAsP एक 525 ± 25 एनएम फिल्टर के साथ सुसज्जित डिटेक्टर से कब्जा कर लिया है। अधिक से अधिक लेजर शक्ति उद्देश्य से उत्सर्जित 10 मेगावाट से अधिक नहीं होनी चाहिए लेजर प्रेरित ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए।
  4. एक कम बढ़ाई ढेर मोल (500 माइक्रोन x 500 माइक्रोन, 512 x 512 पिक्सल, 2 माइक्रोन कदम) एक 0.7X संख्यात्मक जूम रॉय की सटीक पुनर्स्थानीकरण के लिए एक 3 डी मानचित्र बनाने के लिएबाद में समय बिंदुओं पर।
  5. एक 2X संख्यात्मक ज़ूम के साथ 4 उच्च डिजिटल बढ़ाई छवियों की पच्चीकारी मोल (200 माइक्रोन x 200 माइक्रोन, 512 x 512 पिक्सल, 1 माइक्रोन कदम)। इमेजिंग सॉफ्टवेयर 200 माइक्रोन चरणों में खिड़की चाल का उपयोग सभी क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए। ढेर की गहराई, आम तौर पर 250 माइक्रोन है पच्चीकारी के प्रत्येक छवि में pial सतह से शुरू।
  6. माइक्रोस्कोप से माउस को हटाने से पहले, एक तस्वीर ले सकते हैं या इमेजिंग क्षेत्र के भविष्य के लिए पुनर्स्थानीकरण pial vasculature की एक हाथ से तैयार 2 डी नक्शा बनाने के।

4. रिकवरी और फिर इमेजिंग

  1. कर्षण को लागू करने के नीचे खोपड़ी जबकि पकड़े द्वारा सिर माउंट डिवाइस निकालें। किसी भी गोंद खोपड़ी या त्वचा के साथ जुड़ा रहता है, तो इसे ध्यान से कुरेदना ठीक संदंश के साथ। खोपड़ी सिवनी और एक गर्म पिंजरे में माउस जगह घर पिंजरे में लौटने से पहले संज्ञाहरण से वसूली की निगरानी के लिए। सिवनी को सामयिक एंटीबायोटिक क्रीम लगाओ और ketoprofen इंजेक्षन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) मैंपी 2 दिनों के बाद।
  2. दोहराएँ 1.1 दोहराया इमेजिंग सत्र के लिए 2.5 कदम। यदि आवश्यक हो, एक microsurgical ब्लेड के साथ हड्डी दाढ़ी छवि के इष्टतम गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: दंत ड्रिल के साथ अतिरिक्त पतले होने के लिए आवश्यक हो सकता है जब इमेजिंग सत्र के बीच के अंतराल में एक महीने से अधिक समय है।
  3. माइक्रोस्कोप पिछले सत्र (3.6 कदम) से ली गई pial वाहिका के 2 डी नक्शे के अनुसार epifluorescent प्रकाश का उपयोग कर नीचे माउस की स्थिति।
  4. दो photon लेजर स्कैनिंग शुरू और 3 डी मानचित्र 3.4 कदम में प्राप्त का उपयोग कर माइक्रोमीटर पैमाने पर संरेखण को प्राप्त करने के लिए खुर्दबीन मंच समायोजित करें। 3.5 चरण में वर्णित के रूप में विस्तृत इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।

5. अधिग्रहण के बाद तीन आयामी पुनर्निर्माण और छवि विश्लेषण

  1. वाहिका के तीन आयामी पुनर्निर्माण और इस तरह के रूप में Imaris amyloid बयानों 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग (संस्करण इस्तेमाल किया 8.0 और 7.7.2) प्राप्त करते हैं। छवि ढेर की पूरी गहराई में दो चैनलों के आदर्श विपरीत प्राप्त करने के लिए छवि प्रसंस्करण मेनू और इसके विपरीत परिवर्तन सबमेनू पर मानक के अनुसार लेयर प्लगइन का उपयोग करें।
  2. एक साथ सभी समय बिंदुओं पर एक ही क्षेत्र से छवियों को खोलें और हमेशा के लिए अलग अलग समय बिंदुओं की तुलना करने में समानांतर में उन्हें प्रक्रिया।
  3. ट्रेस वाहिकाओं रेशा दरियाफ्त मॉड्यूल का उपयोग कर।
    1. एक नए रेशा रेशा बनाने के लिए आइकन पर क्लिक करें, स्वत: दरियाफ्त को छोड़ और ऑटो-पथ विधि चुनें।
    2. सुनिश्चित करें कि चयनित चैनल संवहनी छवि और सूचक के समारोह का चयन का उपयोग कर से मेल खाती हो, एक पोत विभाजन कि इमेजिंग सत्र के पार संरक्षित है Shift + नियंत्रण कुंजी धारण करते हुए एक प्रारंभिक बिंदु निर्धारित करने के लिए पर क्लिक करें। सूचक के समारोह का चयन का उपयोग करें और तंतु के अंत अंक का चयन करने के लिए शिफ्ट कुंजी दबाए हुए क्लिक करें।
      नोट: obtai की तुलनानेड कंकाल वाहिका के संरचनात्मक परिवर्तन दिखाई देगा।
  4. नई सजीले टुकड़े को ट्रैक करने के लिए विमान विश्लेषण द्वारा विमान का प्रदर्शन। Aβ सजीले टुकड़े के विकास नज़र रखने के लिए नीले चैनल के लिए सतह मॉड्यूल को लागू करें। एक नई सतह बनाने के लिए और स्वचालित सतह निर्माण के साथ आगे बढ़ने के लिए सतह आइकन पर क्लिक करें। सेट और पृष्ठभूमि संकेत घटाना thresholding विधि का प्रयोग करें। सांख्यिकी मेनू व्यक्ति amyloid जमा की सतह के लिए डेटा रिश्तेदार प्रदान करता है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल cerebrovasculature और amyloid जमा ओवरटाइम visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है। फ्लोरोसेंट रंजक amyloid बयानों (methoxy-XO4) 11 लेबल करने के लिए और cerebrovascular लुमेन (FITC-dextran) 1 को भरने के लिए इंजेक्शन थे। 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मॉड्यूल लगातार समय बिंदुओं पर कब्जा कर लिया दृश्य के एक निरंतर क्षेत्र के 3 डी चित्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया। छवियों प्रतिनिधि 5XFAD चूहों 5 बताते हैं कि ज्यादातर Aβ जमा उम्र के 3 और 4 के बीच महीनों दिखाई देते हैं, पैरेन्काइमा में बढ़ रहा है (चित्रा 2) और मर्मज्ञ आसपास वाहिकाओं (चित्रा 3) (ई के आनुवंशिक मॉडल) के somatosensory प्रांतस्था में प्राप्त की। फलक बयान महत्वपूर्ण remodeling और पड़ोसी cerebrovasculature के कभार रोड़ा (चित्रा 2) के साथ एक साथ होता है। पट्टिका आकार में कमी का केवल दुर्लभ मामलों मनाया गया, यह दर्शाता है कि इस पट्टिका एक की एक प्रक्रिया है ccumulation। आंकड़े 2 और 3 वर्णन है कि पैरेन्काइमा में और जहाजों के आसपास amyloidogenic लोड angiogenesis और somatosensory प्रांतस्था में संवहनी रोड़ा के साथ जुड़ा हुआ है। संवहनी सजीले टुकड़े और पोत रोड़ा के बीच संबंध स्पष्ट नहीं हुआ है, यह देखते हुए कि ज्यादातर संवहनी सजीले टुकड़े बड़े मर्मज्ञ धमनियों पर जमा हुए, जबकि रोड़ा छोटे कैलिबर जहाजों पर ज्यादातर हुई।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रायोगिक सेटअप। (ए) के प्रमुख सेटअप; स्टेज कस्टम बनाया है। सिर माउंट डिवाइस खड़ी रेजर के रूप में पहले 10 में वर्णित बनाया ब्लेड के होते हैं। (बी) माउस सिर में बंद कर के देखें डिवाइस माउंट। (सी) डिवाइस और त्वचा खोपड़ी से चिपके के देखें। किनारों लक्षित क्षेत्र पर केंद्रित कर रहे हैं।एस / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा उम्र के 4 और 5 महीने में microvasculature और एक 5xFAD माउस पर Amyloid बयानों के दो खंगाला छवियाँ की 2. तुलना करें। सजीले टुकड़े एक सफेद तारक से संकेत कर रहे हैं, 5 महीने में प्रदर्शित होने नए सजीले टुकड़े पीले तारों के संकेत हैं। पट्टिका में कमी का एक दुर्लभ उदाहरण एक नारंगी तारांकन नवगठित microvessels एक पीले तीर के साथ संकेत कर रहे हैं, जबकि संवहनी रोड़ा एक लाल तीर के साथ संकेत दिया है के साथ संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन उम्र के 3, 4 और 5 महीने में somatosensory प्रांतस्था में 3. बड़े और छोटे कैलिबर वेसल्स चित्रा। (ए) बड़े कैलिबर वाहिकाओं (सफेद तारे) पर amyloid संवहनी जमा की वृद्धि। (बी) Amyloid सजीले टुकड़े भी छोटे कैलिबर वाहिकाओं (पीला तारों) पर देखा जा सकता है। लाल तीर अवरोधित वाहिकाओं संकेत मिलता है। व्हाइट तारों से बढ़ सजीले टुकड़े संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इन विवो दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए खुले खोपड़ी तकनीक बड़े इमेजिंग क्षेत्रों 13,14 के असीमित इमेजिंग सत्र का लाभ प्रदान करता है। हालांकि, इस तकनीक को भी ब्याज 14 के क्षेत्र में सूजन पैदा करता है, अक्सर असंगत या को प्रभावित न्यूरो संवहनी पढ़ बहिष्कार 15। इसके विपरीत, पतला खोपड़ी Transcranial तकनीक न्यूरो सूजन में परिणाम नहीं करता है, cerebrovascular संरचनाओं के विश्वसनीय इमेजिंग और पट्टिका संचय 10,14 सक्षम करने से। इस तकनीक द्वारा प्रस्तुत एक दूसरा लाभ यह है कि पतला-खोपड़ी खिड़की सफलता की दर एक अनुभवी जोड़तोड़ के लिए 90% से 80% तक पहुंच सकता है। सफलता के लिए एक बड़ा झटका हड्डी मोटाई अत्यधिक पतले होने और अंतिम फ्रैक्चर के लिए अग्रणी की सराहना की कमी है; अनुभव और दूरबीन माइक्रोस्कोप के उत्कृष्ट प्रकाशिकी इस समस्या को सीमित कर देगा। सीमाओं की एक संख्या हालांकि इस तकनीक को प्रभावित करते हैं। सबसे पहले, इमेजिंग गहराई सीमित सह हैखुले खोपड़ी प्रक्रियाओं के लिए mpared। दूसरा, समय के साथ, निशान ऊतक की हड्डी overlying Transcranial इमेजिंग की गुणवत्ता कम कर सकते हैं। तीसरा, यह अधिक से अधिक 4 इमेजिंग सत्र दिया खोपड़ी प्रत्येक सत्र में एक छोटे से अधिक पतला हो गया है कि के लिए आगे बढ़ना मुश्किल है। नतीजतन, यह एक प्रयोग की शुरुआत में इमेजिंग सत्र की संख्या निर्धारित करने के लिए, क्रम में सत्र के बीच में पतले होने वेतन वृद्धि का अनुकूलन करने में महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, एक पुरानी Transcranial एक पतला-खोपड़ी तैयारी एक coverglass के साथ चिपके से मिलकर खिड़की पहले से समय 16 से अधिक हड्डी के ऊतकों के regrowth को सीमित करने का वर्णन किया गया है। हालांकि कुशल, हमने पाया है कि इस तकनीक केवल कई हफ्तों के लिए हड्डी regrowth देरी अंततः गुणवत्ता, गहराई और चित्रों के subcellular संकल्प के साथ हस्तक्षेप जब फिर से इमेजिंग समय की लंबी अवधि (Margarita, Arango-Lievano और फ्रेडी Jeanneteau, अप्रकाशित डेटा) के बाद। अपनी सीमाओं के बावजूद, दो photon Transcranial microscप्रतिलिपि बनाएं दोहराया पतला खोपड़ी की तैयारी के माध्यम से पसंद की एक विधि पुरानी बीमारी मॉडल जहां न्यूरो संवहनी परिवर्तन और सूजन होने में फ्लोरोसेंट मार्करों ट्रैक करने के लिए है।

खोपड़ी के एक इष्टतम thinning, एक प्रमुख तकनीकी कदम का प्रतिनिधित्व के रूप में हड्डी के लिए लागू दबाव से खून बह रहा से बचने के लिए और एक फ्लैट खोपड़ी खिड़की सुनिश्चित करने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए। खून बह रहा है और एक असमान खोपड़ी खिड़की scarring और हड्डी के असमान regrowth सुविधा कर सकते हैं। पहली इमेजिंग सत्र के दौरान अत्यधिक पतले होने, अत्यधिक ड्रिलिंग, या लेजर क्षति के बाद overheating भी खोपड़ी खिड़की के माध्यम से संकेत की स्पष्टता समझौता कर सकते हैं। उत्तरार्द्ध समस्याओं को नियमित रूप से ड्रिलिंग के दौरान aCSF मध्यम बदलने की तैयारी ठंडा, रहकर ड्रिलिंग, और साफ तेज उपकरण का उपयोग कर जब हड्डी चमकाने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम सिर पर खोपड़ी (i) निर्धारण शामिल माउंट प्लेट श्वसन के साथ जुड़े आंदोलन को कम करने के लिए, (ii) retrओ-कक्षीय इंजेक्शन और सभी जहाजों के विश्वसनीय दृश्यता, (iii) भविष्य स्थानांतरण के लिए ब्याज के क्षेत्र मानचित्रण, और (iv) पूर्व, प्रति और इमेजिंग सत्र के बीच में पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल।

कार्यप्रणाली यहाँ संक्षेप अध्ययनों प्रभावकारिता और न्यूरो संवहनी संरचनाओं, जैसे, अणुओं को कम करने या मस्तिष्क पैरेन्काइमा में और जहाजों पर amyloid बयानों को रोकने को लक्षित सीएनएस दवाओं की सुरक्षा का आकलन करने के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, रहने वाले मस्तिष्क के अनुदैर्ध्य दो photon माइक्रोस्कोपी amyloidogenesis की ट्रैकिंग और विज्ञापन के प्रारंभिक चरणों में neurovasculature पर इसके प्रभाव, संज्ञानात्मक गिरावट की शुरुआत करने से पहले अनुमति देता है। बड़े सजीले टुकड़े की निकासी की कमी मस्तिष्क वाहिका पर हानिकारक प्रभाव, रोग pathophysiology 17 exacerbating हो सकता है। नई फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण रंगों के आगमन, Lewy निकायों, synucleopathy, प्रिओन समुच्चय, हटिंगटिन समुच्चय लेबल remod neurovasculature के भविष्य attainability समर्थन करने के लिएअन्य neurodegenerative विकारों 18 वर्ष की प्रगति के दौरान पढ़ाई के eling। इस तकनीक को कई माउस (SR101, methoxy-X04, dextrans, lectins) रंगों के संयोजन तनाव और आनुवंशिक मार्करों (thy1YFP, CX3CR1 GFP, NG2-dsRed) के लिए अनुकूल है विवो में और प्रयोगात्मक मॉडल जहां संरचना और समारोह में बातचीत सेलुलर जांच करने के लिए neurovasculature के सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान से भटक जाता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

लेखकों लीग Francaise contre ल épilepsie (एमए-एल), संस्थान में राष्ट्रीय डी ला Santé एट डी ला Recherche MEDICALE अनुदान AVENIR R12087FS (FJ करने के लिए), पेरिस विश्वविद्यालय से अनुदान (FJ) और अनुदान स्वीकार करना चाहते हैं रूस से डालना ला Recherche सुर ले Cerveau (एनएम)। हम तकनीकी मोंटपेलियर के vivo इमेजिंग कोर मंच सुविधा में IPAM पर Chrystel Lafont की सहायता स्वीकार करते हैं। हम यह भी पांडुलिपि proofreading के लिए मैरी Vernov (वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज) धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxy-X04 tocris 4920 use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda sigma 46945 use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang Bausch and Lomb
micorsurgical blade surgistar 6900 must be sharp and not dented
povidone-iodine betadine antisceptic solution
binocular stereomicroscope olympus SX10 optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope zeiss Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut Fine science tools 14058-09 this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue

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References

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Arango-Lievano, M., Giannoni, P., Claeysen, S., Marchi, N., Jeanneteau, F. Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases. J. Vis. Exp. (118), e54796, doi:10.3791/54796 (2016).

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